細(xì)胞產(chǎn)物分析技術(shù)細(xì)胞產(chǎn)物分離方法

關(guān)于細(xì)胞產(chǎn)物分析技術(shù)細(xì)胞產(chǎn)物分離方法第1頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三樣品的預(yù)處理細(xì)胞產(chǎn)物的提取細(xì)胞產(chǎn)物的分離產(chǎn)物的分析鑒定經(jīng)典分離方法紅外光譜紫外可見光譜色譜分離法質(zhì)譜核磁共振譜第2頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典分離方法——液-液萃取法利用組分在兩個互不相溶的液相中的溶解度差異而將其從一個液相轉(zhuǎn)移到另一個液相的分離過程稱為液液萃取，也叫溶劑萃取，簡稱萃取。待分離的一相稱為被萃相，萃取后成為萃余相，用做分離劑的相稱為萃取相。第3頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典分離方法——液-液萃取法

被萃取組分在萃取相中的溶解度要大于被萃取相。一般一相為水相，一相為有機相。在水相中增加鹽離子濃度可以降低有機相在水中的溶解度。萃取應(yīng)采用少量多次原則。從水相中萃取有機物質(zhì)時，單級萃取時一般選擇該物質(zhì)的最佳溶劑。多級萃取溶劑選擇一般從弱極性→強極性。密度：石油醚、乙醚、乙酸乙酯、丁醇、苯<水<二氯甲烷、氯仿第4頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典分離方法——液-液萃取法用一種強極性溶劑直接提取后再用極性不同的溶劑與強極性溶劑的提取液進(jìn)行液／液兩相梯度萃取第5頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典分離方法——液相微萃取法根據(jù)液滴狀態(tài)的不同可分為單滴液相微萃取(SD-LPME)和中空纖維液相微萃取(HF-LPME)；根據(jù)懸掛液滴位置的不同可以分為直接液相微萃取(D-LPME)和頂空液相微萃取(HS-LPME)；根據(jù)操作方式的不同可以分為靜態(tài)液相微萃取(S-LPME)、動態(tài)液相微萃取(D-LPME)和連續(xù)流動液相微萃取(CFME)；根據(jù)作用相的多少可分為兩相液相微萃取和三相液相微萃取(LLLME)第6頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典分離方法——液相微萃取法單滴液相微萃取(SD-LPME)是將萃取用的有機溶劑液滴懸掛在微量進(jìn)樣器的針端。同液-液萃取一樣，單滴液相微萃取也是基于分析物在不同相中分配系數(shù)不同而達(dá)到萃取的目的。有機相液滴體積一般為1-5微升，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于樣品體積，所以可以達(dá)到對待測物的富集。第7頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典分離方法——液相微萃取法直接液相微萃?。狠腿∪軇┮旱沃苯咏n于樣品中，對分離富集潔凈樣品中的低濃度分析物效果較好，但對含固體顆?；蚝心苋榛袡C溶劑的復(fù)雜基質(zhì)樣品的萃取效果較差。頂空液相微萃?。狠腿∪軇┮旱闻c樣品基質(zhì)不直接接觸，適用于復(fù)雜基質(zhì)中微量揮發(fā)性或半揮發(fā)性成分的萃取。第8頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典分離方法——液相微萃取法第9頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典分離方法——液相微萃取法靜態(tài)模式萃?。簩⒂袡C溶劑液滴懸掛于微量進(jìn)樣器的針頭上，萃取一定時間后將溶劑抽回針頭中，直接進(jìn)樣分析。操作簡單，但易受溶劑的溶解或揮發(fā)損失以及脫落的影響，且富集效果相對較差。動態(tài)模式萃?。河梦⒘窟M(jìn)樣器抽取一定量溶劑，置于萃取位置后抽取空氣或水樣進(jìn)入針頭，停留一定時間，萃取被吸入微進(jìn)樣器的試樣中的目標(biāo)分析物，而后推出空氣或水樣但不推出溶劑，如此反復(fù)數(shù)次，最后將有機溶劑相直接進(jìn)樣分析。動態(tài)萃取通過變?nèi)軇┪⒌螢槿軇┍∧?，大大增加了萃取的表面積，使萃取效率更高。第10頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典分離方法——液相微萃取法連續(xù)流動液相微萃取法（CFME）是在直接液相微萃取方法上改進(jìn)而來。先用泵將被萃取的水溶液充滿PEEK管以及萃取單元的玻璃容器中，再將所需體積的有機溶劑用微量注射器從玻璃容器的注射口注射到樣品水溶液中，并在針尖形成液滴懸掛，在蠕動泵的作用下，不停流動的水溶液不斷與有機液滴接觸，分析物不斷被富集到微滴中，萃取完成后將有機液滴吸回，直接進(jìn)樣分析。第11頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典分離方法液相微萃取法第12頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典分離方法——液相微萃取法中空纖維液相微萃取(HF-LPME)以多孔的中空纖維為微萃取溶劑(接收相)的載體，將有機萃取溶劑固定到中空纖維壁內(nèi)的微孔里，通過有機溶劑在纖維壁孔中形成的液膜進(jìn)行傳質(zhì)，在多孔的中空纖維腔中進(jìn)行微萃取。根據(jù)接受相與微孔中溶劑的異同，HF-LPME分為兩相和三相液相微萃取。優(yōu)點：避免了單滴液相微萃取溶劑容易損失、移位、無法提高攪拌速度等缺點；具有突出的樣品凈化功能，擴(kuò)大了分析底物范圍，可用于復(fù)雜基質(zhì)樣品的直接分析；具有較高的富集倍數(shù)和靈敏度。第13頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典分離方法——液相微萃取法第14頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典分離方法——液相微萃取法舉例

測定乳制品中的三聚氰胺：將中空纖維切成2.3～2.5cm小段，放入有機溶劑磷酸三丁酯(TBP)

中超聲10s，使中空纖維壁孔充滿TBP，再將其套在微量進(jìn)樣器(已經(jīng)吸入25μL接受相)針尖上，接受相推入中空纖維，兩端用熱鉗子封住，使中空纖維保持約2cm長度。放入給出相內(nèi)，在恒溫磁攪拌儀上以一定速率攪拌，萃取一定時間后取出，剪開封口，用進(jìn)樣針抽回接收相，用5μL進(jìn)行高效液相色譜測定。第15頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典分離方法——液相微萃取法與液液萃取法比較適應(yīng)了綠色分析技術(shù)發(fā)展的需要（液液萃取消耗mL級有機溶劑，液相微萃取僅需μL級）富集倍數(shù)大，萃取效率高（富集倍數(shù)達(dá)1000倍），可使分析方法的靈敏度提高兩個數(shù)量級以上便于與具有微量進(jìn)樣方法的特定儀器聯(lián)用。樣品溶液用量少(l~10mL左右)第16頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典分離方法——液相微萃取法影響因素萃取溶劑的影響萃取溫度的影響鹽效應(yīng)和pH值的影響攪拌速度的影響應(yīng)用環(huán)境分析：水樣、土壤、大氣藥物分析：血樣、尿樣、唾液、乳汁食品分析：飲用水、酒、飲料、蔬菜第17頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典分離方法——蒸餾和分餾法利用提取成分具有不同沸點的性質(zhì)，可使用蒸餾和分餾法對植物成分進(jìn)行分離。在分離毒芹總堿中的毒芹堿和羥基毒芹堿時，以及分離石榴皮中的偽石榴皮堿、異石榴皮堿和甲基異石榴皮堿時，均可利用常壓或減壓分餾方法進(jìn)行初步分離，然后再精制純化。第18頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典分離方法——分子蒸餾技術(shù)一種特殊的蒸餾分離技術(shù)在通常的蒸餾（精餾）過程中，存在著兩股分子流向：一股是被蒸液體的氣化，由液相流向氣相的蒸氣分子流；另一股是蒸氣返回至液相的分子流。當(dāng)氣液兩相達(dá)到平衡時，表觀上蒸氣分子不再從液面逸出。假若采用某種措施，使蒸氣分子不再返回（或減少返回）液相，就會大大提高分離效率。第19頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典分離方法——分子蒸餾技術(shù)Bronsted和Hevesy在1922年設(shè)計了世界上第一套真正的實驗用分子蒸餾裝置，利用該裝置進(jìn)行水銀同位素分離的研究Burch等人制造了另一種盤式的分子蒸餾實驗裝置，蒸餾出了一些高分子量的油脂第一個具有工業(yè)應(yīng)用價值的分子蒸餾器是降膜式的，它依靠重力作用使被蒸餾物料在蒸發(fā)器上形成一層薄膜。第20頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典分離方法——分子蒸餾技術(shù)技術(shù)原理分子碰撞分子的平均自由程液體混合物受熱后分子運動會加劇，當(dāng)某些分子吸收到足夠的能量時，就會從液面逸出成為氣相分子隨著逸出分子的增多，有一部分氣相分子又會返回液相，在外界條件保持恒定的情況下，最終達(dá)到分子運動的動態(tài)平衡。第21頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典分離方法——分子蒸餾技術(shù)降膜蒸餾裝置第22頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典分離方法——分子蒸餾技術(shù)1935年Hickman領(lǐng)導(dǎo)的小組設(shè)計出了世界上第一臺離心式分子蒸餾器第23頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典分離方法——分子蒸餾技術(shù)1940，離心式分子蒸餾器結(jié)構(gòu)復(fù)雜成本昂貴，工業(yè)上出現(xiàn)了結(jié)構(gòu)簡單、成本低廉的刮膜式分子蒸餾器從上世紀(jì)60年代至今持續(xù)發(fā)展第24頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典分離方法——分子蒸餾技術(shù)我國上世紀(jì)60年代才有涉及。1986年蔡沂春申請了關(guān)于M型分子蒸餾器的專利；至上世紀(jì)80年代末期，國內(nèi)引進(jìn)了幾套分子蒸餾生產(chǎn)線，用于硬脂酸單甘油酯的生產(chǎn)。北京化工大學(xué)從1990s對分子蒸餾技術(shù)進(jìn)行研究，從小試、中試至工業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)，建立分子蒸餾生產(chǎn)裝置30余條。第25頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典分離方法——分子蒸餾技術(shù)普通蒸餾在沸點溫度下進(jìn)行分離，分子蒸餾可以在任何溫度下進(jìn)行，只要冷熱兩面間存在著溫度差，就能達(dá)到分離目的。普通蒸餾是蒸發(fā)與冷凝的可逆過程，液相和氣相間可以形成相平衡狀態(tài)；而分子蒸餾過程中，從蒸發(fā)表面逸出的分子直接飛射到冷凝面上，中間不與其它分子發(fā)生碰撞，理論上沒有返回蒸發(fā)面的可能性，所以，分子蒸餾過程是不可逆的。普通蒸餾有鼓泡、沸騰現(xiàn)象；分子蒸餾過程是液層表面上的自由蒸發(fā)，沒有鼓泡現(xiàn)象。第26頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典分離方法——分子蒸餾技術(shù)技術(shù)特點§操作溫度低§蒸餾壓強低§被分離物質(zhì)受熱時間短§產(chǎn)品品質(zhì)和產(chǎn)品收率高第27頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典分離方法——沉淀法沉淀分離是將被測組分和干擾組分通過一個沉淀反應(yīng)而使其中一個置于液相，另一個置于固相，最后通過相分離的方法將二者分離。沉淀分離中加入的沉淀劑可以是和被測組分作用使其轉(zhuǎn)至固相，也可以是和干擾組分作用使干擾組分轉(zhuǎn)至固相，具體使用哪種方法要根據(jù)分析對象、干擾物質(zhì)、實驗條件來具體決定。按照沉淀分離中使用的沉淀劑類型和沉淀時采用的方法不同可將它分成三個大類：無機沉淀劑分離法、有機沉淀劑分離法和共沉淀分離法。第28頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典分離方法——沉淀法第29頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典分離方法——膜分離法利用小分子物質(zhì)在溶液中可通過具有一定孔徑的膜，而大分子物質(zhì)不能通過的性質(zhì)達(dá)到分離的目的。常用于蛋白質(zhì)、多肽、多糖等大分子化合物與無機鹽、單糖、雙糖等小分子化合物的分離。根據(jù)所用膜的孔徑大小不同可將膜分離法分為超濾及納濾。因不使用大量有機溶劑具有很大優(yōu)越性。大豆蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)中即采用膜分離法。第30頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典分離方法——升華法固體物質(zhì)受熱時，直接變成氣態(tài)此現(xiàn)象稱為升華。植物中凡具有升華性質(zhì)的化合物均可用此法進(jìn)行純化。樟木中的樟腦、茶葉中的咖啡堿及存在于植物中的苯甲酸等成分。升華法簡單易行，但往往產(chǎn)率低，還可能伴有分解現(xiàn)象。第31頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典分離方法——升華法第32頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典分離方法——結(jié)晶法植物中某一成分含量特別高時，找到合適的溶劑進(jìn)行提?。崛∫悍爬浠蛏詽饪s，便可得到結(jié)晶。不需復(fù)雜的儀器設(shè)備，相對于制備色譜分離方法，成本低適于大量制備。效率低，無法適用于一些微量成分或難以結(jié)晶成分的分離。需利用X射線衍射方法確定化合物分子結(jié)構(gòu)時，獲得好的單晶仍是重要的。第33頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典分離方法——結(jié)晶法通過反復(fù)結(jié)晶得到純粹的單一晶體的過程稱為復(fù)結(jié)晶或重結(jié)晶。需要結(jié)晶的溶液呈過飽和狀態(tài)，在加溫的情況下，使化合物溶解過濾除去不溶解雜質(zhì)，濃縮，放冷，析出。有時溶液太濃，黏度大就不易結(jié)晶；或析出結(jié)晶的速度快，顆粒較小，夾雜的雜質(zhì)可能多。第34頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典分離方法——結(jié)晶法濃度適中，逐漸降溫，有可能析出純度較高的結(jié)晶。X射線衍射用的單晶即采用此法制備。選用溶劑最好能對所需成分的溶解度隨溫度的不同而有顯著的差別，即熱時溶解冷卻則析出。對雜質(zhì)來說，在該溶劑中應(yīng)不溶或難溶；也可采用對雜質(zhì)溶解度大的溶劑而對欲分離物質(zhì)不溶或難溶，則可用洗滌法除去雜質(zhì)后再用合適的溶劑結(jié)晶。重結(jié)晶用的溶劑可與結(jié)晶溶劑相同。也可不同達(dá)到利用不同溶劑結(jié)晶除去不同雜質(zhì)的目的。第35頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典分離方法——結(jié)晶法每種化合物的結(jié)晶都有一定的形狀、色澤和熔點。純結(jié)晶性化合物都有一定的晶形和均勻的色澤，通常在同一種溶劑下結(jié)晶形狀是一致的。純化合物結(jié)晶的熔點熔距應(yīng)在0.5℃左右，但由于晶體結(jié)構(gòu)的原因可允許在1～2℃內(nèi)。重結(jié)晶溶劑不同，有時呈雙晶現(xiàn)象，熔點可以有很大的差別。如血根堿(sangmnanne)在乙醚、氯仿和乙醇三種溶劑中所析出的結(jié)晶熔點不一樣，分別為266℃、242~243℃和195~197℃。第36頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三第37頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三1906年俄國植物學(xué)家MikhailTsvet將含有植物葉子色素的溶液通過裝填有白堊粒子吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率通過柱子，并彼此分開，由此得名為色譜法（Chromatography），又稱層析法。色譜分離方法第38頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離方法20世紀(jì)60年代末出現(xiàn)了高效液相色譜，它在分離速度及分辨率上比起經(jīng)典的液相柱色譜具有更大優(yōu)越性。高效液相色譜儀可配以紫外等不同類型的檢測器，用于各種化合物的分析、制備。近年來，高效液相色譜儀與質(zhì)譜、核磁共振譜儀的聯(lián)機使用，更加提高了高效液相色譜儀的應(yīng)用范圍和效能。第39頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法色譜法是又叫層析法，是利用不同的物質(zhì)在固定相與流動相中不同的平衡分配系數(shù)來進(jìn)行分離的一種方法。所有的色譜系統(tǒng)都由兩相組成：固定相：是固定不動的一相，是固體物質(zhì)或者是固定于固體物質(zhì)上的成分。流動相：是流動的一相，可以是氣體或液體，如水和各種有機溶劑。第40頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法當(dāng)待分離的混合物隨流動相通過固定相時，由于各組份的理化性質(zhì)存在差異，與兩相發(fā)生相互作用（吸附、溶解、結(jié)合等）的能力不同，在兩相中的分配（含量對比）不同，隨著流動相移動，各組份不斷地在兩相中進(jìn)行再分配。與固定相相互作用力越弱的組份，隨流動相移動時受到的阻滯作用小，向前移動的速度快。反之，與固定相相互作用越強的組份，向前移動速度越慢，從而實現(xiàn)分離。第41頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法氣相色譜液相色譜按流動相劃分氣-液色譜氣-固色譜液-液色譜液-固色譜按固定相劃分吸附色譜分配色譜排阻色譜離子交換色譜按色譜過程機理劃分反相色譜正相色譜按固定相與流動相的相對極性大小劃分第42頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法吸附色譜：吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異來達(dá)到分離的目的。分配色譜：利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數(shù)不同而分離。排阻色譜：利用分子大小不同而阻滯作用不同進(jìn)行分離的過程。離子交換色譜：利用不同組分對離子交換劑親和力不同進(jìn)行分離。第43頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法柱色譜：固定相裝填在圓柱狀上、下開口的玻璃、不銹鋼柱內(nèi)，使樣品沿著一個方向前移而達(dá)分離。薄層色譜：將適當(dāng)粘度的固定相均勻涂鋪在薄板上，點樣后用流動相展開，使各組份分離。紙色譜：用濾紙作液體的載體，點樣后用流動相展開，使各組份分離。第44頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜最常用的色譜分離手段，目前仍是進(jìn)行植物次生代謝產(chǎn)物分離的主要手段。一般使用圓柱狀玻璃或不銹鋼材料，內(nèi)徑1-10厘米，通常2-5厘米，柱高為內(nèi)徑的10~20倍。固定相填充在柱內(nèi)，樣品加在固定相的頂端，流動相從頂端加入，靠重力作用驅(qū)動流動相流經(jīng)固定相。常用固定相:常用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、活性炭、硅酸鎂、聚酰胺、硅藻土等步驟包括：裝柱、上樣、洗脫、收集第45頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜第46頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜常用固定相——硅膠

柱層析硅膠是具有固體特性的膠態(tài)體系，由形成凝集結(jié)構(gòu)的膠體粒子構(gòu)成。膠體粒子是水合狀態(tài)硅膠（多硅酸）的縮聚物，屬非晶態(tài)物質(zhì)。它具有多孔性的硅氧環(huán)（siloxane）及Si－O－Si－的交鏈結(jié)構(gòu)其骨架表面的硅醇（silano）基團(tuán)能通過氫鍵與極性或不飽和分子相互作用。膠體粒子的集合體的間隙形成內(nèi)部的微孔隙結(jié)構(gòu)。因此，它是一種具有豐富微孔結(jié)構(gòu)，高比表面積、高純度、高活性的優(yōu)質(zhì)吸附材料?？捎猛ㄊ絊iO2·xH2O表示。

第47頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜常用固定相——硅膠

價格低廉，可供選擇的溶劑種類多，樣品損耗少，分離后溶劑易于除去，分離速度快，因而是液-固色譜的最主要載體。

適用范圍廣，能用于非極性化合物也能用于極性化合物，如芳香油、萜類、甾體、生物堿、苷類、蒽醌類、酸性、酚性化合物、磷脂類、脂肪酸、氨基酸及一系列合成產(chǎn)物等的分離。

第48頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜常用固定相——硅膠

柱層析硅膠（細(xì)孔）粒度目數(shù)平均孔徑比表面積孔體積（約）180-250μm60-8020-30Aо

>600m2/g0.4ml/g150-180μm80-10020-30Aо

>600m2/g0.4ml/g125-180μm80-12020-30Aо

>600m2/g0.4ml/g75-150μm100-20020-30Aо

>600m2/g0.4ml/g45-75μm200-30020-30Aо

>600m2/g0.4ml/g柱層析硅膠（粗孔）粒度目數(shù)平均孔徑比表面積孔體積（約）180-250μm60-10080-100Aо

300-400m2/g0.8ml/g125-180μm80-12080-100Aо

300-400m2/g0.8ml/g75-150μm100-20080-100Aо

300-400m2/g0.8ml/g45-75μm200-30080-100Aо

300-400m2/g0.8ml/g第49頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜常用固定相——硅膠

硅膠的吸附性能取決于硅

膠中硅醇基的數(shù)及含水量。

隨著水分的增加吸附能力

降低。若吸水量超過12％，

吸附力極弱，不能用做吸附色譜，只可用于分配色譜的載體。

硅膠的表面積、表面結(jié)構(gòu)、微孔體積及微孔半徑均直接影響著色譜分離的效果。第50頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜常用固定相——硅膠

硅膠應(yīng)是中性無色顆粒，由于制備過程中接觸強酸常帶有酸性，故在使用前應(yīng)檢查其水浸液的酸度不低于pH5

時才可使用；否則應(yīng)用水洗至中性再在110℃活化24小時。

硅膠在甲醇、水等強極性溶劑中有一定的溶解性，約為0.01％。在pH=9以上，則溶解度急劇上升。

有時可以向硅膠中摻入某種試劑以改良吸附性能，提高分離效果。通常用硝酸銀處理過的硅膠對不飽和烴類有極好的分離作用。改良吸附劑的制備一般是將含1％~10％填加試劑的水或丙酮溶液與硅膠混勻，稍后于110℃干燥即可。第51頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜常用固定相——硅膠

硅膠的再生一般可用乙醇或甲醇洗滌，除去溶劑烘干活化處理即可使用。必要時用0.5％氫氧化鈉水溶液浸泡洗滌、過濾、水洗，再以5％～10％鹽酸浸泡洗滌最后用蒸餾水洗至中性，110℃活化，過篩即可。

50~200μm的硅膠每克吸附劑承載10mg樣品，吸附劑每克硅膠載樣30mg時只能用于被分離物質(zhì)的Rf值差別很大的情況。上樣較多時可達(dá)到過濾的目的。

第52頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜常用固定相——氧化鋁色譜用的氧化鋁可分酸性、中性和堿性三種。酸性氧化鋁pH約為4-4.5，用于分離羧酸、氨基酸等酸性物質(zhì)；中性氧化鋁pH值為7.5，用于分離中性物質(zhì)，應(yīng)用最廣；堿性氧化鋁pH為9-10，用于分離生物堿、胺和其它堿性化合物等。吸附劑的活性與其含水量有關(guān)。含水量越低，活性越高。脫水的中性氧化鋁稱為活性氧化鋁。第53頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜常用固定相——氧化鋁

常用規(guī)格：50～100目、100～200目、200～300目、300～400目、400～500目、500目以上

外觀白色微球和沙狀白色微球白色微球

粒徑(μm)≥75(%)≤250≤250≤250

PH值4.5～5.56.5～7.5≥8

酸堿度酸性中性堿性第54頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜常用固定相——聚酰胺

由酰胺聚合而成的一類高分子物質(zhì)，又

稱錦綸、尼龍等，層析常用的是錦綸－6

和錦綸－66；其單體物質(zhì)是已內(nèi)酰胺、已二胺和已二酸。分子中的酰胺鍵是其結(jié)構(gòu)的重要部分，酰胺鍵也是與其它極性鍵基團(tuán)產(chǎn)生氫鍵的物質(zhì)基礎(chǔ)。是吸附層析，酰胺鍵與物質(zhì)分子中的極性鍵的相互作用應(yīng)該是吸附作用的主要原因；分離物質(zhì)的氫鍵作用是聚酰胺層析的根本原因；但非氫鍵物質(zhì)也可用聚酰胺進(jìn)行分離。原理目前尚未完全闡明。第55頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜常用固定相——聚酰胺

通常有兩種雜質(zhì)：一種是蠟質(zhì)，另一種是錦綸的聚合原料單體及其小分子聚合物。原料單體及其小分子聚合物可與酚類物質(zhì)形成復(fù)合物，而蠟質(zhì)能被醇液洗脫下來，與分離之物質(zhì)混在一起則難以除去。除去原料單體及其小分子聚合物的方法是用二甲基甲酰胺（DMF）或DMF：醋酸：水：乙醇（5：10：30：20）混合液洗脫。除去蠟質(zhì)的方法是用甲醇：二氯乙烷（1：1）混合液洗脫。第56頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜裝柱要求:固定相的上表面一定要平整，并且固定相的高度要根據(jù)需要，短了可能分離效果不好，長了也會出現(xiàn)擴(kuò)散或拖尾導(dǎo)致分離效果不好。濕法裝柱:是先把硅膠混懸于流動相溶劑中，然后加入到裝有溶劑的柱子頂端，在保持一定流速的條件下固定相逐漸沉積并達(dá)到需要的高度，并始終保持一定的液面高度，不可將柱子“走干”，最大的優(yōu)點是柱子裝的比較結(jié)實，沒有氣泡。第57頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜裝柱干法裝柱：直接往柱子里填入硅膠，然后再輕輕敲打柱子兩側(cè)（濕法也要敲的，效果好點），至硅膠界面不再下降為止，然后再填入硅膠至合適高度，減壓抽氣可以使得柱子裝得結(jié)實，接著是用洗脫劑“走柱子”，干法裝柱較方便，技術(shù)要求低，但容易產(chǎn)生氣泡，在上樣前需要用大量溶劑淋洗才能達(dá)到濕法裝柱的效果。因而相對成本較高。第58頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜上樣濕法上樣：適合濕法的樣品是粘度不大均勻液體樣品或者在極性弱于洗脫劑的溶劑中溶解度好的固體樣品，需保證上樣過程中不會析出。用于溶解樣品的溶劑體積應(yīng)越少越好。樣品沿柱子內(nèi)壁于硅膠面上方0.5cm以內(nèi)距離均勻地加樣，加樣的速度以柱子不出現(xiàn)氣泡為限。待所有樣品上完后，用盡可能少的溶劑洗滌樣品瓶，待樣品在固定相上恰好走干后依上樣法將溶液加到固定相上。第59頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜上樣干法上樣：干法就是把待分離的樣品用少量低沸點溶劑溶解后，再加入少量固定相，拌勻后再揮干溶劑。如此得到的粉末再小心加到柱子的頂層，注意保留足夠的溶劑使加入的干粉恰好能被覆蓋以防柱子開裂。此時加入的干粉層中可能會有大量的氣泡，但由于是松的，可以用玻棒稍做攪拌以除去氣泡，同樣要保持硅膠表面的平整。若擔(dān)心上樣及加溶劑過程中會將柱子表面弄破可考慮在上樣前先在柱子上加一層石英砂。過程中時刻保持柱子不要干出氣泡或裂紋！第60頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜洗脫柱層析所用的流動相，習(xí)慣上稱為洗脫劑,可將目的組分自混合樣品中逐次分離出來。洗脫的過程中，洗脫劑自柱上端加入,固定相上端始終在洗脫劑溶劑不能干，每30分鐘－1小時內(nèi)流出的洗脫劑體積等于所用吸附劑的重量為宜。洗脫劑可隨意變，混合過渡為重點。根據(jù)需要分段收集，然后用薄層色譜檢測。第61頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜洗脫劑在柱色譜分離過程中混合物中各組分在吸附劑和洗脫劑之間發(fā)生吸附-溶解分配，強極性洗脫劑對極性大的有機物溶解的多，弱極性或非極性洗脫劑對極性小的有機物溶解的多，隨洗脫劑的流過不同極性的有機物以不同的次序形成分離帶。當(dāng)一種溶劑不能實現(xiàn)很好的分離時，選擇使用不同極性的溶劑分級洗脫。如一種溶劑作為洗脫劑只洗脫了混合物中一種化合物，對其它組分不能洗脫，需換一種極性更大的溶劑進(jìn)行第二次洗脫。這樣分次用不同的洗脫劑可以將各組分分離。第62頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜加壓柱色譜利用各種裝置施加壓力進(jìn)行的液相色譜，壓力可高達(dá)100bar?？稍试S在分離過程中使用顆粒度更小的吸附劑，從而獲得更高的分辨率。可加快洗脫劑的流速縮短分離時間。在對敏感化合物進(jìn)行長時間的常壓色譜分離時，化合物的結(jié)構(gòu)可能會發(fā)生轉(zhuǎn)變，而縮短分離時間的最大優(yōu)點在于可以避免這種轉(zhuǎn)變的發(fā)生。第63頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜加壓柱色譜根據(jù)分離中所用壓力的大小可把制備型柱色譜區(qū)分為快速色譜（約2bar）、低壓液相色譜（＜bar）。中壓液相色譜（5—20bar）及高壓液相色譜（＞20bar)低壓、中壓與高壓液相色譜的壓力范圍之間會存在一定交疊。分離中所用色譜柱及固定相顆粒的大小需根據(jù)分離的難易程度而定。一般對于難分離的樣品應(yīng)采用小顆粒的固定相及稍長的色譜柱分離所需壓力也會加大。第64頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜加壓柱色譜——快速色譜Still等于1978年介紹了快速色譜技術(shù)。色譜分離時長時間的洗脫可造成敏感化合物的分解并使色帶脫尾，快速色譜大大縮短分離所需時間從而避免產(chǎn)生上述問題?？焖偕V中使用最廣泛的固定相為硅膠。一些粒度范圍較窄的球形硅膠是專門為快速色譜而設(shè)計的。此外也可采用具有一定粒度范圍的非球形硅膠。硅膠快速色譜可對天然產(chǎn)物進(jìn)行最終純化，但更常見的是用此方法對粗提物或混合物進(jìn)行初步純化，然后再利用其他具有高分辨率的色譜技術(shù)進(jìn)行純化。第65頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜

加壓柱色譜——快速色譜快速色譜分離裝置包括一裝有活塞，長度適合的玻璃柱。可用干法或濕法將固定相加入其中。干法裝柱效果更好，但需用大量溶劑使固定相完全潤濕。在固定相的頂部最好加一層沙子。第66頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜固定相的上端應(yīng)留有足夠的空間以便反復(fù)加入洗脫劑，也可在柱頂部加一球形磨口儲液槽。加樣后可施加高于大氣壓lbar的壓力以加速樣品的洗脫。在氣體入口處可利用一針式閥門控制壓縮氣體的流速。利用不同尺寸的色譜柱對0.01~10.0g樣品所進(jìn)行的分離通?？稍?5min內(nèi)完成。加壓柱色譜——快速色譜第67頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜使用最廣泛的低壓液相色譜系統(tǒng)是EMerck公司生產(chǎn)的Lobar柱系列產(chǎn)品，一般與其他分離方法結(jié)合起來使用，將其用作中間或最后的純化手段。預(yù)制色譜柱是由玻璃制成，色譜柱中的固定相被柱兩端的熔融玻璃封閉。色譜柱兩端連有聚四氯乙烯環(huán)的金屬管可與輸液泵相連，金屬管及聚四氯乙烯環(huán)被柱端的旋鈕固定于柱體。加壓柱色譜——低壓柱色譜

第68頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜因分離過程中需使用輸液泵一般采用組成恒定的洗脫劑。利用反相LobarRP18色譜系統(tǒng)從山甘草中分離得到三萜皂苷類成分，所用溶劑系統(tǒng)為乙醇-水（1:1）和乙腈-水（1:1）加壓柱色譜——低壓柱色譜

第69頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜加壓柱色譜——低壓柱色譜

Lobar柱規(guī)格分為A、B、C三種型號預(yù)制色譜往的填料有硅膠、RP－18、RP-8、NH2-、CN-及diol鍵合相硅膠等。第70頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜加壓柱色譜——中壓柱色譜

Lobar色譜分離系統(tǒng)具有使用方便，分辨率較高的優(yōu)點。然而，用這些色譜柱難以分離5g以上的樣品。中壓液相色譜可采用更長、具有更大內(nèi)徑的色譜柱，可以一次性分離更多的樣品。中壓液相色譜比低壓液波相色譜使用的填料顆粒度更小，分辨率更高，需使用更大的壓力來維持適當(dāng)?shù)牧魉偎鑹毫捎蓧嚎s空氣或往復(fù)泵提供。先利用分析型HPLC可以十分有效地選擇適當(dāng)?shù)娜軇┫到y(tǒng)。第71頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜加壓柱色譜——中壓柱色譜

中壓色譜柱可用于分離100mg至100g的樣品?；钊眉翱商鎿Q泵頭可在最大壓力為40bar時，使流速在3~160mL／min之間調(diào)節(jié)。該系統(tǒng)接有溶劑梯度形成裝置并可用各種紫外檢測儀檢測。柱體大小可從130mL直至1880mL。第72頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜加壓柱色譜——中壓柱色譜

該系統(tǒng)的色譜柱由帶有塑料保護(hù)膜的強化玻璃制成，因此可以觀測到分離的進(jìn)展情況?？梢詫⑸V柱連接起來使用以提高分離能力?？梢杂酶煞ɑ驖穹ㄑb柱。與濕法裝柱相比，干法裝柱可使固定相填充密度提高20％。最大承受壓力只有40bar，但使用顆粒度為15μm的固定相可以獲得同HPLC柱類似的分離效果。第73頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜加壓柱色譜——中壓柱色譜

應(yīng)用鍵合相固定相時應(yīng)采用濕法裝柱?？梢杂米⑸淦鲗悠分苯蛹拥缴V柱上或使用進(jìn)樣器進(jìn)樣。如在色譜柱前連接一小的樣品柱，也可以采用固體上樣法。在制備型色譜柱前連一前置柱，在每次分離后將被污染的填料除去，利用甲醇—乙酸乙酯—已烷的沖洗順序?qū)枘z固定相進(jìn)行再生。但在重復(fù)使用幾次之后，應(yīng)將固定相廢棄。鍵合相色譜柱更易于清洗井具有更長的使用壽命。分離中多數(shù)采用的是硅膠或反相硅膠固定相但有時也采用聚酰胺或纖維素第74頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜減壓柱色譜

是利用真空為動力來加速流動相流經(jīng)固定相的一種色譜分離方法?？捎脺p壓液相色譜法替代快速色譜法在進(jìn)行高壓液相色譜及其他復(fù)雜分離之前對植物提取物進(jìn)行初步分離。與制備薄層色譜和快速色譜相比，設(shè)備簡單，分離全程短，有較理想的分離度，分離容量大。類似于制備型薄層色譜，在完成一次展開、干燥后，還可再次對之進(jìn)行展開。已有多種吸附劑被嘗試用于減壓液相色譜分離，其中包括硅膠、氧化鋁、聚酰胺及健合相硅膠等。例如：用減壓液相色譜法分離姜（Zingiberofficinale）中的辛辣成分，可將姜醇與姜烯酚完全分開。第75頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜減壓柱色譜

操作方式是在一裝有熔融玻璃（10－20μm，D型孔徑或2號孔徑）的短住或布氏漏斗中干法加入吸附劑（10~40μm薄層色譜用吸附劑，如Merck硅膠60H或60G），輕輕敲擊裝置，使吸附劑在重力作用下沉降。然后通過三通活塞抽真空并用一橡皮塞壓緊吸附劑，直至吸附劑變得堅硬。放氣之后，快速向吸附劑的表面加入低極性的溶劑，并繼續(xù)抽真空。當(dāng)溶劑流經(jīng)全部柱體后。將柱抽干，即可準(zhǔn)備上樣?？蓪悠啡苡谶m當(dāng)?shù)娜軇┲兄苯蛹釉谥喜浚缓鬁p壓小心地將樣品抽入吸附劑。第76頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜減壓液相色譜另外也可將樣品先吸附于硅膠、氧化鋁或硅藻土上。洗脫劑的選擇應(yīng)適當(dāng)先用低極性溶劑，然后再逐漸增大溶劑極性．在收集每份餾分后將柱體抽干（可減少餾分之間的相互交叉）。已有多種吸附劑被嘗試用于減壓液相色譜分離，其中包括硅膠、氧化鋁、聚酰胺及健合相硅膠等。減壓液相色譜不同于快速柱色譜，因該方法在收集每份餾分后允許色譜柱流干。減壓液相色譜因其操作簡便、分離速度快、分辨率高而在天然產(chǎn)物研究中獲得廣泛應(yīng)用。第77頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜干柱色譜將干的吸附劑裝入色譜柱中，待分離的樣品配成濃溶液或吸附于少量填料上，然后上樣。洗脫液依靠毛細(xì)作用流經(jīng)色譜柱，當(dāng)接近色譜柱底部時，停止洗脫，將吸附劑從柱中挖出用適當(dāng)?shù)娜軇⒏魃珟е械某煞窒闯龅纳V操作方法。在干柱色譜中，沒有洗脫液從色譜柱流出，色帶明顯分開，耗時短且節(jié)省溶劑?？衫镁哂邢嗤絼┑姆治鲂捅由V來推測干柱色譜分離的效果。第78頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜干柱色譜實際上只是制備型薄層色譜形式上的變化，具有相同的分辨能力。先利用薄層色譜選擇最佳的溶劑系統(tǒng)，然后進(jìn)行干柱色譜分離。在使用混合溶劑系統(tǒng)進(jìn)行干柱色譜分離時，可能達(dá)不到分析型薄層色譜所顯示的分辨力，這時可在裝柱前用10％的流動相對干柱的吸附劑進(jìn)行預(yù)飽和。最佳的干柱是尼龍柱。根據(jù)展開的色帶位置，可用刀將色譜柱或管切成若干段，然后把被分開的化合物用溶劑提取出來并進(jìn)行過濾。尼龍柱的另一優(yōu)點是可在紫外燈下觀測到無色的色帶，以此來指導(dǎo)切割。第79頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜干柱色譜填充劑是決定柱效的主要因素，填充劑的顆粒直徑越小直徑范圍越小，柱的效能越高；填裝均勻，分離的層帶才會整齊；若顆粒太小，流速減慢，則傳質(zhì)緩慢同時移動相線速度減慢，引起縱向擴(kuò)散，影響分離度；使用過長的柱會引起移動相流速減慢及縱向擴(kuò)散增加洗脫時間加長。可增加適當(dāng)?shù)膲毫κ沽魉俜€(wěn)定。一般所用柱的高度不宜超過50cm．直徑在1~3cm之間，主要決定于樣品容量及吸附劑量，通常比例在1：100以上。第80頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——柱色譜干柱色譜劉嘉森等用國產(chǎn)硅膠（青島海洋化工廠產(chǎn)品，150—2目）進(jìn)行干柱色譜。成功地分離了華中五味子中的五味子酯乙與酯丙。同時用酸性氧化鋁（120—200目，Ⅲ——Ⅳ級）干柱色譜分離出五味子酯丁。

Ai和Li將丹參根的95%乙醇提取物用幾種溶劑進(jìn)行分配，對所得的一個部位（45g）用2.3kg硅膠進(jìn)行干柱色譜分離（洗脫劑為氯仿一甲醇—甲酸85：15：1）。把色譜柱切割成16段每段吸附劑都用熱甲醇洗脫。對第13段和第14段進(jìn)一步用加SephadexLH-20純化，得到2.06g丹參酚酸B（salvianolicacidB）。第81頁，講稿共91頁，2023年5月2日，星期三色譜分離法——薄層色譜又稱薄層層析，屬于液－固吸附