解脲支原體MB蛋白金標檢測試劑盒（膠體金法）作業(yè)指導書

解脲支原體MB蛋白金標檢測試劑盒（膠體金法）作業(yè)指導書1目的建立解脲支原體MB蛋白金標檢測試劑盒（膠體金法）作業(yè)指導書，確保生產過程處于受控狀態(tài)。2范圍適用于解脲支原體MB蛋白金標檢測試劑盒（膠體金法）相關工序的操作者。3職責3.1操作人員應嚴格執(zhí)行本作業(yè)指導書。3.2生產主管負責監(jiān)督檢查。3.3質檢部質檢員負責抽查執(zhí)行情況。4工作內容4.1生產工藝流程圖※膠體金制備膠體金制備★膠體金反應膜檢測膠體金標記膠體金反應膜檢測膠體金標記抗體檢測抗體檢測單克隆抗體制備單克隆抗體制備★貼板產品檢測裝卡分包質量檢測切貼板產品檢測裝卡分包質量檢測切條NC反應膜檢測NC膜包被★NC反應膜檢測NC膜包被抗原檢測解脲重組抗原的表達NC膜處理NC膜檢測※NC膜處理NC膜檢測入庫入庫抗體檢測兔抗鼠IgG抗體制備抗體檢測兔抗鼠IgG抗體制備注：※關鍵過程★特殊過程4.2作業(yè)內容4.2.1膠體金制備（檸檬酸三鈉還原法）氯金酸（HAuCl4）水溶液放入三角瓶內加熱至沸騰→加熱檸檬酸三鈉溶液→混勻，攪拌煮沸10至15分鐘→待膠體金溶液顏色由藍→紫→紅，冷卻即可。4.2.2金標抗體（反應膜）制備以0.1M碳酸鉀溶液調膠體金溶液pH8.0-9.0→加入解脲支原體單抗，15分鐘后加入聚乙二醇→離心，調532nm測OD值5～10，方陣滴定法選定標記工作濃度→用無紡布浸濕膠體金溶液，干燥、平整，檢測。4.2.3金標抗體反應膜質檢將制備好的金標抗體反應膜按5‰比例抽檢，與標準反映膜匹配組裝成品，同時與標準成品作如下對照檢測。a)符合率：樣品稀釋液、陰性質控品無假陽，高、中、低濃度（0.1μg/ml、1.0μg/ml、10μg/ml）支原體陽性質控品均呈陽性。b）敏感度：最小檢出0.1μg/ml支原體陽性質控品。c)反應強度：+/+++（陽性反應線/陰性反應線）。d)反應時間：30s～5min。確認合格后才能轉入下一工序。4.2.4NC反應膜制備親和性高分子硝酸纖維素膜→活化處理12小時→用水洗5次，每次20分鐘→室溫干燥后→取純解脲支原體MB蛋白單抗和兔抗鼠IgG抗體溶于10%CS中，濃度均為2mg/ml，用解脲支原體單抗在NC膜上包被衣原體陽性反應線→用兔抗鼠IgG抗體在NC膜上包被陰性對照線→干燥后，用BS液封閉H2O清洗后，室溫干燥，備用。4.2.5NC反應膜質檢4.2.5.1常規(guī)圖形模式檢測：將制備好的反應膜按5‰比例抽檢，與標準金標抗體反應膜匹配組裝成品，同時與標準成品對照檢測；觀察陽性、陰性包被線及本底，要求圖形規(guī)則程度均勻，無遺漏或重復包被。4.2.5.2均一性，靈敏性和符合率篩選：按3%比例/批，隨機取樣，每張5～10人份，作陰性參比品和高、中、底（0.1μg/ml、1.0μg/ml、10μg/ml）三個濃度的陽性參比品檢測，靈敏度解脲支原體最小檢出0.1μg/ml，無假陽性，均一性≥99%。4.2.6反應體系組裝組裝材料材料規(guī)格（mm）組裝方式反應膜（S1）20見圖1無紡布（S2）25，30吸水紙（S3）30金標反應膜（S4）10雙面膠帶（S5）29，48塑料墊板S678單面膠帶S7154.2.6.1反應體組裝程序：a)在S6塑料基板上貼雙面膠帶S5（29，48mm）二條；b)在S5上貼反應膜S1（20mm），S1上下緣距S6上下緣各29mm；c)在S6上貼吸水紙S3（30mm），吸水紙下緣與S1上緣交接1mm,上緣與S5的上邊緣對齊；d)在S5下端貼無紡布S2-1，其上緣壓住S1下緣1mm；e)在S2-1上平放金標抗體反應膜S4（10mm）上緣對齊；f)在S4上平放無紡布S2-2（30mm）上下緣分別S4、S6對齊；g)將組裝成型的反應體系用電腦可調式切割機切成5mm測試條，裝入干燥器，待包裝。4.2.6.2成品包裝：每支成品先裝聚苯乙烯塑料外殼，再用鍍鋁膜包裝加干燥劑，附說明書，打批號入庫，每批留樣100人份，以備復檢．4.2.7質控品制備4.2.7.1解脲支原體MB蛋白陽性質控品取基因工程表達解脲支原體MB蛋白抗原，以樣品稀釋液（A液和B液1：1混合液）分別配成高、中、低（10μg/ml,1μg/ml,0.1μg/ml）三個濃度，0.5ml/支分裝，-70℃保存。4.2.7.2解脲支原體MB蛋白陰性質控品含0.1mg/ml牛血清白蛋白樣品稀釋液（A液和B液1：1混合液）,0.5ml/支分裝，-70℃保存。4.3成品檢測《解脲支原體MB蛋白金標檢測試劑盒（膠體金法）》產品注冊標要求。4.3.1外觀4.3.1.1要求a）檢測條：表面應平整、無劃傷、開裂、變形及污漬；檢測卡各組分附著牢固、內容齊全；b)檢測卡：外殼應平整，上下蓋應均勻合攏，無明顯間隙；反應芯試條在外殼內應附著牢固；4.3.1.2檢驗在自然光線下，用手感和目力觀察方法進行檢驗。4.3.2靈敏度4.3.2.1要求檢測卡可以測定出0.1μg/ml的解脲支原體MB蛋白，凡解脲支原體MB蛋白等于和高于該濃度時檢測線和對照線均顯色，而低于該濃度時檢測線不顯色，但無論任何濃度對照線均應顯色。4.3.2.2測試a)試劑1)空白對照液：樣品稀釋液；2)測定樣品液：10μg/ml,1μg/ml,0.1μg/ml，＜0.1μg/ml四個濃度的質控品。b)測定方法隨機從同批待測試劑盒中抽取足量試樣對空白對照液和每個濃度的樣品液分別進行測定，每個濃度測定重復測定10個檢測卡。測定時取約4滴處理好的樣品液在測試板右端的圓加樣孔中，平放，等待3～5分鐘觀察測試板中部檢視窗的結果，但不可超過20分鐘讀結果。c)結果以下結果為合格：測定空白對照液的試劑盒檢測線不顯色，只有對照線顯色。測定濃度≥0.1μg/ml解脲支原體MB蛋白樣品液的試劑盒檢測線和對照線均有顯色，且在測定閾值以上的檢測線色帶隨解脲支原體MB蛋白的濃度升高而色帶加深。4.3.3符合率4.3.3.1陰性符合率4.3.3.1.1要求試劑盒測試解脲支原體MB蛋白陰性質控品10份，假陽性判斷結果不多于1份，符合率應≥90%。4.3.3.1.2測試隨機從同批待測試劑盒中抽取10個檢測卡，測定陽性質控品10份。測定時取100μl陽性質控品加在檢測卡加樣孔中，平放，等待3～5分鐘觀察檢測卡中部檢視窗的結果，但不可超過20分鐘讀結果。4.3.3.2陽性符合率4.3.3.2.1要求試劑盒測試解脲支原體MB蛋白含量高于0.1μg/ml的陽性質控品10份，假陽性判斷結果不多于1份，符合率應≥90%。4.3.3.2.2測試隨機從同批待測試劑盒中抽取10個檢測卡，測定陰性質控品10份。測定時取100μL陰性質控品加在檢測卡加樣孔中，平放，等待3～5分鐘觀察檢測卡中部檢視窗的結果，但不可超過20分鐘讀結果。4.3.4重復性4.3.4.1陰性重復率4.3.4.1.1要求使用試劑盒檢測同一份陰性質控品10次，同一份質控品的陰性判定結果應基本一致，假陽性判定結果不多于1份，陰性重復率應≥90%。4.3.4.1.2測定隨機從同批待測試劑盒中抽取10個檢測卡，測定時取100μl陰性質控品加在檢測卡加樣孔中，平放，等待3～5分鐘觀察檢測卡中部檢視窗的結果，但不可超過20分鐘讀結果。4.3.4.2陽性重復率4.3.4.2.1要求使用試劑盒檢測同一份陽性質控品10次，同一份質控品的陽性判定結果應基本一致，假陰性判定結果不多于1份，陽性重復率應≥90%。4.3.3.2.2測定隨機從同批待測試劑盒中抽取10個檢測卡，測定時取100μl陽性質控品加在檢測卡加樣孔中，平放，等待3～5分鐘觀察檢測卡中部檢視窗的結果，但不可超過20分鐘讀結果。4.3.5精密性4.3.5.1要求每批試劑盒隨機抽取10個檢測卡樣品，用同一份陽性UU質控品進行檢測，要求各檢測卡的顯色應均一。4.3.5.2測定隨機從同批待測試劑盒中抽取10個檢測卡進行檢測。測定時取100μl陽性UU質控品加在檢測卡加樣孔中，平放，等待3～5分鐘觀察檢測卡中部檢視窗的結果，但不可超過20分鐘讀結果。4.3.6穩(wěn)定性4.3.6.1要求a）在37Cb）在