離心機操作及血液樣本處理

實驗(shíyàn)基礎技能培訓李玉濤2017-07第一頁，共三十七頁。整理課件Part1血液基本成分及其分離方法(fāngfǎ)Part2離心機簡介及使用第二頁，共三十七頁。整理課件Part1血液(xuèyè)基本成分及其分離方法一、血液基本成分二、血液物理性質(zhì)三、血液采集常用方法四、血液成分(chéngfèn)分離方法第三頁，共三十七頁。整理課件一、血液(xuèyè)基本成分血細胞形態(tài)、數(shù)量、比例和血紅蛋白含量的測定稱為血像?；疾r，血像常有顯著變化，故檢查血像對了解機體狀況和診斷疾病十分(shífēn)重要。第四頁，共三十七頁。整理課件1、紅細胞紅細胞（erythrocyte，redbloodcell）直徑7～8.5μm，呈雙凹圓盤狀，中央(zhōngyāng)較?。?.0μm），周緣較厚（2.0μm）紅細胞的這種形態(tài)使它具有較大的表面積（約140μm2），便于攜O2和部分CO2。成熟紅細胞無細胞核，也無細胞器，胞質(zhì)內(nèi)充滿血紅蛋白（hemoglobin,Hb）。紅細胞的滲透壓與血漿相等，使出入紅細胞的水分維持平衡。當血漿滲透壓降低時，過量水分進入細胞，細胞膨脹成球形，甚至破裂，血紅蛋白逸出，稱為溶血（hemolysis）第五頁，共三十七頁。整理課件2、白細胞白細胞（leukocyte,whitebloodcell）為無色有核的球形細胞(xìbāo)，體積比紅細胞(xìbāo)大，能作變形運動，具有防御和免疫功能。第六頁，共三十七頁。整理課件白細胞分類(fēnlèi)光鏡下，根據(jù)(gēnjù)白細胞胞質(zhì)有無特殊顆粒，可將其分為有粒白細胞和無粒白細胞兩類。有粒白細胞又根據(jù)(gēnjù)顆粒的嗜色性，分為中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞。無粒白細胞有單核細胞和淋巴細胞兩種。第七頁，共三十七頁。整理課件2.1、中性(zhōngxìng)粒細胞中性粒細胞（neutrophilicgranulocyte,neutrophil）占白細胞總數(shù)的50%－70%，是白細胞中數(shù)量最多的一種。具有活躍的變形運動和吞噬(tūnshì)功能。細胞呈球形，直徑10－12μm，核染色質(zhì)呈團塊狀。核的形態(tài)多樣，有的呈臘腸狀，稱桿狀核；有的呈分葉狀，葉間有細絲相連，稱分葉核。第八頁，共三十七頁。整理課件中性(zhōngxìng)粒細胞異常中性粒細胞增高見于：a．急性感染和化膿性感染：肺炎、敗血癥、膿腫等。b．組織損傷：大手術后、心肌梗塞、肺梗塞等。c．惡性腫瘤：急、慢性(mànxìng)白血病、淋巴瘤等。d．各種中毒：尿毒癥、糖尿病酸中毒等。中性粒細胞減少見于：a．某些傳染病：流感、傷寒、付傷寒、麻疹。b．某些血液病：再障、粒細胞缺乏癥、白細胞減少癥。c．化療或放療后，抗癌藥物，X線及鐳照射。d．其它：脾功能亢進，自身免疫性疾病，高度惡病質(zhì)。第九頁，共三十七頁。整理課件2.2、嗜酸性(suānxìnɡ)粒細胞嗜酸性粒細胞（eosinophilicgranulocyte,eosinophil）占白細胞總數(shù)的0.5%－3%。與變態(tài)反應(biàntàifǎnyìng)有關，并有吞噬抗原抗體復合物的作用。細胞呈球形，直徑10～15μm，核常為2葉，胞質(zhì)內(nèi)充滿粗大（直徑0.5～1.0μm）、均勻、略帶折光性的嗜酸性顆粒，染成桔紅色。第十頁，共三十七頁。整理課件嗜酸性(suānxìnɡ)粒細胞異常嗜酸性粒細胞增多見于：a．變態(tài)反應性疾病：支氣管哮喘、藥物過敏、蕁麻疹等。b．寄生蟲?。夯紫x病、鉤蟲病、血吸蟲病(xuèxīchónɡbìnɡ)。c．某些皮膚病：濕疹、牛皮癬、剝脫性皮炎等。d．某些血液病：慢粒、惡性淋巴瘤、嗜酸性粒細胞性白血癥等。嗜酸性粒細胞減少見于：a．應用糖皮質(zhì)激素、促腎上腺皮質(zhì)激素。b．傷寒、副傷寒等病患者。第十一頁，共三十七頁。整理課件2.3、嗜堿性(jiǎnxìnɡ)粒細胞嗜堿性(jiǎnxìnɡ)粒細胞（basoophilicgranulocyte,basophil）數(shù)量最少，占白細胞總數(shù)的0～0.15。細胞呈球形，直徑10－12μm。胞核分葉或呈S形或不規(guī)則形，著色較淺。胞質(zhì)內(nèi)含有嗜堿性顆粒嗜堿性粒細胞主要參與特殊的免疫反應。第十二頁，共三十七頁。整理課件嗜堿性(jiǎnxìnɡ)粒細胞異常增多見于：a．慢性(mànxìng)粒細胞白血病、嗜堿性粒細胞白血病。b．某些轉(zhuǎn)移癌及骨髓纖維化。減少一般無臨床意義。第十三頁，共三十七頁。整理課件2.4、淋巴細胞淋巴細胞（lymphocyte）占白細胞總數(shù)的20%～30%，圓形或橢圓形，大小不等。T細胞約占淋巴細胞總數(shù)的75%，參與細胞免疫，如排斥異移體移植物、抗腫瘤等，并具有免疫調(diào)節(jié)功能。B細胞約占血中淋巴細胞總數(shù)的10%～15%。B細胞受抗原刺激后增殖分化為漿細胞，產(chǎn)生(chǎnshēng)抗體，參與體液免疫。第十四頁，共三十七頁。整理課件淋巴細胞異常(yìcháng)增多見于：a．某些病毒(bìngdú)或細胞所致的傳染?。簜魅拘粤馨图毎龆喟Y、傳染性單核細胞增多癥、傳染病恢復期、結(jié)核病、百日咳。b．淋巴細胞性白血病、白血性淋巴肉瘤。減少見于：a．應用腎上腺皮質(zhì)激素、接觸放射線。b．細胞免疫缺陷病、某些傳染病的急性期。第十五頁，共三十七頁。整理課件2.5、單核細胞單核細胞（monocyte）占白細胞總數(shù)的3%～8%。具有游走性和吞噬作用。單核細胞為白細胞中體積(tǐjī)最大的細胞。直徑14～20μm，呈圓形或橢圓形。胞核形態(tài)多樣，呈卵圓形、腎形、馬蹄形或不規(guī)則形等。胞質(zhì)較多，呈弱嗜堿性，含有許多細小的嗜天青顆粒第十六頁，共三十七頁。整理課件單核細胞異常(yìcháng)增多見于：a．某些感染：傷寒、結(jié)核、瘧疾、黑熱病、亞急性細菌性心內(nèi)膜炎。b．某些血液病：單核細胞性白血病、淋巴瘤、骨髓(ɡǔsuǐ)異常增殖綜合癥、惡性組織細胞病。減少一般無臨床意義。第十七頁，共三十七頁。整理課件二、血液(xuèyè)物理特性血液(xuèyè)密度為1.050—1.060×10^3kg/m^3，紅細胞的密度為1.090×10^3kg/m^3，血漿的密度為1.025—1.030×10^3kg/m^3。第十八頁，共三十七頁。整理課件血液(xuèyè)的顏色通常抽的是靜脈血，所以外觀看上去呈暗紅色。若血含較多的是高鐵血紅蛋白或其他血紅蛋白衍生物，則呈紫黑色。血漿（或血清）因含少量膽紅素，看上去呈透明淡黃色；若含乳糜微粒，則呈乳白渾濁(húnzhuó)；若發(fā)生溶血，則呈紅色血漿。第十九頁，共三十七頁。整理課件三、血液(xuèyè)采集常用方法紅色試管帽采血管采血管中不含任何添加劑，適用于常規(guī)生化血清(xuèqīng)檢驗，對檢驗結(jié)果無影響，缺點：離心不到位或者溫育時間不夠，容易形成纖維蛋白，容易堵塞設備針孔第二十頁，共三十七頁。整理課件三、血液采集(cǎijí)常用方法紫色試管帽采血管

采血管中含EDTA-K2抗凝劑，一般(yībān)采取噴霧制作，使得抗凝劑均勻分布管壁，制備標本為全血，一般(yībān)適用于常規(guī)的血液學檢測第二十一頁，共三十七頁。整理課件常用(chánɡyònɡ)抗凝劑（1）乙二胺四乙酸二鈉（簡稱EDTANa2）抗凝原理：可螯合血液中的鈣離子而阻止血液凝固(nínggù)。優(yōu)點：抗凝作用強，且不改變血細胞的形態(tài)和體積，可防止血小板聚集。應用：適于血液學檢驗，但輸血不能用。草酸鹽合劑（草酸鉀及草酸銨合劑）抗凝原理：奪取血中的游離鈣而形成不溶解的草酸鈣，而達到抗凝。優(yōu)點：溶解度大，抗凝作用強。缺點：草酸鉀使紅細胞縮小約6％，而草酸銨可使紅細胞膨脹。應用：適于除紅細胞壓積容量測定的血液檢驗。第二十二頁，共三十七頁。整理課件常用(chánɡyònɡ)抗凝劑（2）枸櫞酸鈉（檸檬酸鈉）抗凝原理：與血中游離鈣離子形成非離子化的可溶性的枸櫞酸鈣復合物，從而阻止血液(xuèyè)凝固。優(yōu)點：與血中游離鈣離子結(jié)合松散。缺點：引起水及無機鹽在血細胞及血漿之間分布的改變。應用：常用于血沉淀及輸血時的抗凝，不適用于血液化學檢驗。肝素抗凝原理：阻止血中的凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟?，防止血凝。?yōu)點：抗凝作用強，不影響紅細胞的大小，對血液化學分析干擾少。缺點：價格貴，抗凝時間短，其抗凝血做白細胞分數(shù)計數(shù)時，白細胞著色不佳。應用：血液有機成分、無機成分的分析。第二十三頁，共三十七頁。整理課件四、血液成分(chéngfèn)分離1血清(xuèqīng)血漿分離2白細胞分離 2.1裂解紅細胞法 2.2Ficoll分離法第二十四頁，共三十七頁。整理課件1、血清(xuèqīng)血漿的分離血清(xuèqīng)和血漿的最大區(qū)別就是血清(xuèqīng)中不含纖維蛋白原紫色采血管顛倒混勻后，1200g離心10min，4度，取上清。紅色采血管需用槍頭攪勻后，1200g離心10min，4度，取上清第二十五頁，共三十七頁。整理課件2.1、白細胞分離(fēnlí)-裂解紅細胞法紅細胞裂解液主要成分：NH4Cl，KHCO3，Na2EDTA紅細胞裂解液裂解原理：氯化銨通過在其細胞膜進行氫氧根／碳酸氫根和氯離子的交換，改變其滲透壓，造成(zàochénɡ)紅細胞脹大破裂；外周血淋巴細胞受影響較少因其細胞膜的離子轉(zhuǎn)運通道不同。第二十六頁，共三十七頁。整理課件2.1、白細胞分離(fēnlí)-裂解紅細胞法主要實驗流程：將10X儲存(chǔcún)液稀釋到1X工作濃度；加入血沉棕黃層的6-10倍體積的1X紅細胞裂解液，吹打均勻冰上裂解10分鐘。裂解完畢后，50ml離心管中液體應呈透明紅色，且下方無紅色沉淀。1500g，10min，4度離心，棄去上層液體，僅保留下層白色沉淀。第二十七頁，共三十七頁。整理課件2.2、白細胞分離(fēnlí)-Ficoll分離法原理:

常用來分離人外周血單個核細胞（PBMC）的分層液比重是1.077±0.001的聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F／H)分層液。Ficoll是蔗糖的多聚體，中性，平均(píngjūn)分子量為400,000，不穿過生物膜。紅細胞、粒細胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細胞和單核細胞的比重小于或等于分層液比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的細胞，就可從外周血中分離到單個核細胞。第二十八頁，共三十七頁。整理課件2.2、白細胞分離(fēnlí)-Ficoll分離法第二十九頁，共三十七頁。整理課件Part2離心機簡介(jiǎnjiè)及使用/experiment/628/629/47523.htm第三十頁，共三十七頁。整理課件1、離心機簡介(jiǎnjiè)離心機借助轉(zhuǎn)軸高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生離心力，使不同密度、不同大小的物質(zhì)分開，能達到初步分離純化的目的，是實驗室必不可少的儀器。按照轉(zhuǎn)速(zhuànsù)可以分為低速(<8000rpm)、高速(8000-20000)、超速(>50000)三種類型。根據(jù)體積大小和擺放位置又可分為臺式離心機和落地式離心機。臺式離心機體積比較小，常是中低速離心機；落地式離心機體積較大，常帶有降控溫裝置，大多是高速離心機。第三十一頁，共三十七頁。整理課件2、離心機的擺放(bǎifànɡ)離心機一般放在干燥、避免陽光直射的地方。離心機散熱量比較大，周圍不要堆放雜物，四周離墻壁、擋板等不透氣、散熱性差的物品至少10cm以上。離心機盡量單獨放在一個房間，周圍絕對(juéduì)不要放有機試劑、易燃品第三十二頁，共三十七頁。整理課件3、離心機使用(shǐyòng)注意事項根據(jù)實驗所需和使用的離心管，含有有機試劑的液體要用特殊的離心管；選擇合適的轉(zhuǎn)頭(zhuǎntóu)，轉(zhuǎn)速絕對禁止超過轉(zhuǎn)頭(zhuǎntóu)標明的最高轉(zhuǎn)速。離心管的對稱放置和重量配平，同時應該注意離心管和轉(zhuǎn)頭可以承受的最大重量的溶液，液體最多裝離心管全體積的3/4。第三十三頁，共三十七頁。整理課件4、離心機保養(yǎng)(bǎoyǎng)每次使用完畢，都要將離心機蓋兒打開，使得熱量或者水氣自然蒸發(fā)，如之前使用了低溫離心，可能有結(jié)冰，則要等冰融化，及時用干燥棉紗布擦洗干凈，等無明顯水汽時再蓋上蓋子。如果(rúguǒ)離心機轉(zhuǎn)頭可以替換，則每個轉(zhuǎn)頭使用完畢后都要及時取出，用干凈的、干燥的醫(yī)用紗布擦洗干凈，倒扣放置，切勿使用銳器刮擦。操作人員離開時候要切斷電源。第三十四頁，共三十七頁。整理課件5、具體操作流程(liúchéng)（1）1.設定使用溫度（通常為4℃）后，先把離心陀放入離心艙中，注意離心陀要卡好軸心；關上艙門，離心艙的溫度開始下降，預冷時間要充足。2. 把樣本裝入適當?shù)碾x心管，雙雙用天平平衡重量，蓋上離心管蓋子并旋緊。

1）注意離心管只裝七成滿，雖然加有蓋子，但也可能因離心力太強而外泄。

2）離心管通常都會放在碎冰上，注意取出平衡時，要把碎冰的液體擦拭干凈。

3）落單的離心管要用另一只裝有清水的離心管平衡。3. 把平衡好的離心管對稱地放入離心陀中，蓋上離心陀的蓋子，注意有無(yǒuwú)旋緊。4. 關上離心機艙門，在儀表板上調(diào)好所要的轉(zhuǎn)速與時間。5. 確定所有步驟無誤后，按Start鈕開動，離心機漸漸加速，此時要密切監(jiān)控。

1）如在運行中聽到不正常聲音或者聞到什么異味，應立即采取剎