淺論基質(zhì)金屬蛋白酶

淺論基質(zhì)金屬蛋白酶【摘要】目的探討基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrixmetalloproteinase-9,MMP-9)、層黏連蛋白(Laminin,LN)在原發(fā)性干燥綜合征(PrimarySjgrens’sSyndrome，PSS)患者唇腺組織的表達(dá)及其與唇腺病理分級(jí)的相關(guān)性。方法采用免疫組化S-P法檢測(cè)59例PSS患者，30例正常對(duì)照者唇腺中MMP-9，LN表達(dá)。結(jié)果原發(fā)性干燥綜合征患者唇腺組織中MMP-9高表達(dá),LN低表達(dá),而對(duì)照組唇腺組織中MMP-9低表達(dá),LN高表達(dá)；MMP-9的表達(dá)強(qiáng)度隨唇腺病理分級(jí)升高而增強(qiáng)，LN的表達(dá)隨唇腺病理分級(jí)升高而減弱；MMP-9與LN的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性。結(jié)論MMP-9、LN在PSS患者唇腺組織中存在異常表達(dá)，并且二者的表達(dá)情況與病理分級(jí)相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】原發(fā)性干燥綜合征基質(zhì)金屬蛋白酶-9層黏連蛋白唇腺

Abstract:ObjectiveTostudytherelationshipbetweenMMP9,LNandtheirrolesinthepathogenesisofPrimarySjgrens‘sSyndrome.MethodsImmunohistochemicaltechniquewasemployedtodetecttheexpressionofMMP9andLNinthelabialglandaciniofpatientswithPrimarySjgrens‘sSyndrome(PSS).ResultsSignificantdifferencesinLNandMMP9expressionsbetweentwogroupswereexpressionofMMP9inthelabialglandofthepatientswithPSSwasincreasedsignificantly(P＜)andtheexpressionofLNinthelabialglandaciniofthepatientswithPSSwasdecreasedsignificantly(P＜).TheexpressiondegreeofMMP9wassignificantlynegativelycorrelatedwiththetheexpressioneddegreeofLN,andthePearson‘scorrelationcoefficientwas(P＜).ConclusionMMP9,LNmaybeinvolvedinthepathogenesisofPrimarySjgrens‘sSyndrome.

Keywords:PrimarySjgrens‘sSyndrome;matrixmetalloproteinase9;laminin;labialglands

原發(fā)性干燥綜合征(PrimarySjgrens’sSyndrome,PSS)是一種累及全身外分泌腺的自身免疫性疾病，主要侵犯淚腺和唾液腺，以淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn)為特征，可以引起腺體分泌減少，出現(xiàn)眼、口干燥癥狀。其發(fā)生淋巴瘤的機(jī)率是正常人的44倍［1］。MMP-9是一個(gè)蛋白酶家族中主要成員之一，能降解上皮基底膜(basementmembrane,ＢＭ)，在許多生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，包括免疫和炎癥反應(yīng)。有關(guān)MMP-9在腫瘤的發(fā)病及MMPs抑制劑對(duì)腫瘤和部分自身免疫性疾病治療作用的研究已有報(bào)道［2-3］，而有關(guān)MMP-9及LN與PSS的發(fā)病機(jī)制關(guān)系，國(guó)內(nèi)未見報(bào)道。深入探討PSS患者唇腺組織MMP-9的表達(dá)及其與LN表達(dá)間的關(guān)系，有可能為PSS提供新的治療靶點(diǎn)，本研究應(yīng)用免疫組化SP法對(duì)原發(fā)性干燥綜合征患者唇腺區(qū)MMP-9及LN進(jìn)行了檢測(cè)和分析。

1資料和方法

臨床資料

實(shí)驗(yàn)組：2004年5月～2006年9月我科門診及住院的PSS患者59例，所有病例均符合2002年干燥綜合征國(guó)際分類診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］，首次確診時(shí)由本院口腔科行唇腺活檢術(shù)。術(shù)前均征得患者本人的同意。男3例,女56例,年齡25～65歲,平均(±)歲;病程1個(gè)月～10年,平均(±)年。對(duì)照組：30例為同期健康志愿者。兩組患者年齡、性別等無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

方法

石蠟5μm厚連續(xù)切片,常規(guī)處理后,微波爐抗原熱修復(fù),依次加入即用型一抗(鼠抗人MMP-9、LN工作液)、生物素標(biāo)記二抗,DAB顯色、蘇木素復(fù)染。具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。用已知陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照,PBS代替一抗作空白對(duì)照。鼠抗人MMP-9、LN工作液和即用型SP免疫組化染色試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

免疫組化：光學(xué)顯微鏡下MMP-9以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色顆粒狀物質(zhì)為陽(yáng)性，LN以基底膜線性染色為陽(yáng)性,按著色強(qiáng)弱分級(jí)計(jì)分:無(wú)著色為0,淺黃色為1,深黃色為2,棕黃色為3;著色范圍以在40倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野(每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞)計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比均值:＜25%為1,25%～50%為2,＞50%為3。上述兩項(xiàng)相加即為MMP9或LN的強(qiáng)度積分:＜3分為陰性,3分為(+),4分為陽(yáng)性(2+),5分為(3+)，6分為(4+)。

HE染色按Chisholm標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分級(jí)［5］：0級(jí)為間質(zhì)中無(wú)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；1級(jí)為每4mm2組織內(nèi)有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；2級(jí)為每4mm2組織內(nèi)有輕度淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；3級(jí)為每4mm2組織內(nèi)有中度淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)或少于一個(gè)灶淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；4級(jí)為每4mm2組織內(nèi)有兩個(gè)或兩個(gè)以上淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)灶，每個(gè)灶至少有50個(gè)淋巴細(xì)胞聚集。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，兩樣本計(jì)數(shù)資料比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)、單因素方差分析及Pearson相關(guān)性分析。

2結(jié)果

陽(yáng)性信號(hào)為胞漿內(nèi)出現(xiàn)黃色顆粒。以PBS代替一抗的空白對(duì)照切片中,無(wú)任何陽(yáng)性反應(yīng)。59例原發(fā)性干燥綜合征患者唇腺組織MMP9陽(yáng)性，呈現(xiàn)高表達(dá),主要位于導(dǎo)管細(xì)胞胞漿(圖1，見封3)。30例原發(fā)性干燥綜合征患者的唇腺組織檢測(cè)到LN，呈現(xiàn)低表達(dá)(圖2，見封3)。對(duì)照組唇腺組織中MMP-9表達(dá)為陰性或弱陽(yáng)性，而LN呈現(xiàn)高的表達(dá)(圖3，見封3)。二組MMP-9、LN的表達(dá)強(qiáng)度相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且MMP-9的表達(dá)隨病理分級(jí)的升高而升高，LN的表達(dá)隨唇腺病理的分級(jí)升高而減弱，MMP-9與LN的表達(dá)強(qiáng)度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)(r=-,P＜)，見表1、2。表1MMP-9、LN在正常對(duì)照與患者唇腺中表達(dá)強(qiáng)度的比較表2MMP-9、LN在PSS患者唇腺中表達(dá)強(qiáng)度與病理分級(jí)的關(guān)系

3討論

PSS是臨床常見的結(jié)締組織病，發(fā)病率僅次于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。PSS最主要的病理特征是唇腺、淚腺等腺體組織中淋巴細(xì)胞的灶性浸潤(rùn)。PSS因外分泌腺結(jié)構(gòu)破壞、功能受損可出現(xiàn)口干、眼干癥狀，還可有皮疹、關(guān)節(jié)炎、膽囊炎、胰腺炎、腎小管病變、肺部受損等全身表現(xiàn)，并且PSS發(fā)生淋巴瘤的機(jī)率明顯高于正常人［1］。至今，其確切發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚。唇腺導(dǎo)管、腺泡上皮及基底膜的完整是保證唇腺功能正常的基礎(chǔ)。

在正常情況下,上皮細(xì)胞不但分泌LN等基底膜蛋白以形成基底膜，而且分泌MMP-9等依賴鋅離子的內(nèi)肽酶降解物質(zhì)分解基底膜,使基底膜成分處于不斷合成和降解的動(dòng)態(tài)平衡，以維持基底膜完整結(jié)構(gòu)。PSS的典型唇腺病理特征是導(dǎo)管周圍大量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)成灶，并且多為CD4+的T淋巴細(xì)胞［6］，MMP-9可以介導(dǎo)T細(xì)胞的遷移［7］。

本研究發(fā)現(xiàn)MMP-9在PSS患者唇腺組織中高表達(dá)，與對(duì)照組比較差異明顯(Ｐ＜),并且表達(dá)強(qiáng)度隨著病理分級(jí)的升高而表達(dá)增強(qiáng)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Ｐ＜)。LN在PSS患者唇腺組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，表現(xiàn)為基底膜染色減弱、基底膜破壞、斷裂甚至缺失，與對(duì)照組比較差異明顯(Ｐ＜),并且表達(dá)強(qiáng)度隨著病理分級(jí)的升高而減弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜)。MMP-9與LN的表達(dá)間存在顯著性負(fù)相關(guān)性(r=-,P＜)。部分對(duì)照組MMP-9的低表達(dá)，推測(cè)為其發(fā)揮生理作用維持基底膜完整結(jié)構(gòu)。Fox［8］研究認(rèn)為唇腺組織的上皮細(xì)胞具有一定的免疫功能，而在PSS患者的腺體局部免疫失衡的情況下，導(dǎo)管上皮細(xì)胞產(chǎn)生MMP-9的增加，LN是MMP-9的作用底物，即MMP-9活性增加，從而導(dǎo)致MMP-9降解其基底膜中的層黏連蛋白，而基底膜借助層黏連蛋白與上皮細(xì)胞緊密連接［9］，一旦基底膜結(jié)構(gòu)不完整，二者連接受到影響，導(dǎo)致腺體分泌功能受損。推測(cè)PSS患者唇腺功能的受損有MMP-9與LN的參與。

本研究結(jié)果提示，MMP-9、LN在PSS患者唇腺組織中存在異常表達(dá)，并且二者的表達(dá)情況與病理分級(jí)相關(guān)，而檢測(cè)原發(fā)性干燥綜合征患者唇腺組織中MMP-9、LN的表達(dá)變化，可以預(yù)測(cè)病變，為臨床實(shí)施積極的干預(yù)措施提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

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