蛋白質(zhì)糖基化的研究和進(jìn)展教育課件

蛋白質(zhì)糖基化的研究和進(jìn)展PPT講座1概述1988年，牛津大學(xué)的RaymondDwek在AnnualReviewofBiochemistry上發(fā)表題為“糖生物學(xué)”的綜述，標(biāo)志糖生物學(xué)這一前沿領(lǐng)域的誕生。美國(guó)的新罕布什大學(xué)首先開展了“糖組學(xué)”（glycomics)的研究美國(guó)于2001年正式啟動(dòng)了“功能糖組學(xué)”的研究“功能糖組學(xué)”研究目標(biāo)基因組計(jì)劃提供了基本的遺傳信息，而許多基因的功能仍需要闡明。其中的關(guān)鍵就是蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，而糖基化是最主要的翻譯后修飾之一。闡明由蛋白質(zhì)-糖鏈所介導(dǎo)的細(xì)胞通訊機(jī)制糖組學(xué)研究的重心便是蛋白質(zhì)糖基化的研究。蛋白質(zhì)糖基化研究的基本目標(biāo)是：尋找編碼糖蛋白的基因?qū)ふ姨腔稽c(diǎn)解析糖鏈及糖基化肽段的結(jié)構(gòu)研究糖基化的功能基因組信息糖基化位點(diǎn)信息結(jié)構(gòu)信息功能信息現(xiàn)代分子生物學(xué)的中心法則：蛋白質(zhì)的糖基化在生物體是廣泛存在的。真核細(xì)胞中，有一半以上的蛋白質(zhì)被糖基化糖鏈的多樣性和復(fù)雜性“連接方式異構(gòu)體”“分枝形成”2蛋白質(zhì)糖基化的分類1．O-糖基化:糖鏈通過(guò)GalNAc連接在蛋白質(zhì)的Ser或Thr等側(cè)鏈的羥基處2．N-糖基化:糖鏈連接在蛋白質(zhì)的Asn的氨基側(cè)鏈處3．GPI-Anchor糖基化:蛋白質(zhì)通過(guò)肽鏈的C端共價(jià)連接的糖基磷脂酸肌醇錨定在膜脂上。3蛋白質(zhì)糖基化常用研究方法

因?yàn)樘擎湹膹?fù)雜性，很難通過(guò)單一的方法進(jìn)行序列測(cè)定等研究，需要多種方法組合完成。糖基化位點(diǎn)分析糖基化蛋白分析糖鏈分析糖蛋白糖鏈釋放單糖分析蛋白酶水解去糖基蛋白氨基酸分析糖鏈糖基肽肽鏈糖鏈釋放氨基酸序列分析去糖基肽鏈糖鏈分餾/純化結(jié)構(gòu)分析酶解糖基肽/寡糖多糖圖譜質(zhì)譜核磁共振蛋白質(zhì)糖基化的研究策略1.凝膠技術(shù)與質(zhì)譜聯(lián)用2.非凝膠技術(shù)與質(zhì)譜聯(lián)用3.O-β-GlcNAc糖基化研究細(xì)胞組織雙向電泳切割酶切質(zhì)譜分析糖鏈鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)搜索靶蛋白鑒定及功能分析與磷酸化之間存在“陰陽(yáng)”關(guān)系可以被篩選和鑒定O-β-GlcNApr親和層析母離子掃描366數(shù)據(jù)庫(kù)搜索鑒定4糖基化蛋白質(zhì)的分離技術(shù)蛋白質(zhì)混合物分離純化糖蛋白糖肽

凝集素ConA

是一種典型的對(duì)于一系列高甘露糖型的N-連接糖鏈具有高親和性的植物凝集素，同時(shí)也能結(jié)合復(fù)雜型的N-連接糖鏈及雙分枝的復(fù)雜型的N-連接糖鏈Mana1-6(Mana1-3)Manβ較強(qiáng)Mana1-2Mana1-6(Mana1-3)Manβ最強(qiáng)缺少三甘露糖核心結(jié)構(gòu)或含有阻礙性的3-OH，6-OH取代基團(tuán)的Mana（α1-6）較弱GalectinLEC-6

PNA

半乳糖苷結(jié)合凝集素是一類分布廣泛，不依賴于金屬離子的可溶性凝集素很多生物具有保守性傾向于結(jié)合包含半乳糖且具有分枝結(jié)構(gòu)的N-連接糖鏈花生凝集素是組織化學(xué)中用于檢測(cè)T抗原的。T抗原在黏蛋白中廣泛存在（如血型糖蛋白A）可廣泛結(jié)合于存在O-連接糖鏈的T抗原上5糖基化蛋白的檢測(cè)技術(shù)1熒光染色檢測(cè)法丹磺酰肼檢測(cè)聚丙烯酰胺凝膠中的糖蛋白綠色熒光蛋白即Pro-QEmerald300染色劑SYPRORubbyPro-QEmerald4882與凝集素聯(lián)用的檢測(cè)方法蛋白質(zhì)印跡到膜上后，與標(biāo)記了地高辛的凝集素一起孵育，再通過(guò)與帶有堿性磷酸酶的抗地高辛抗體結(jié)合，最后加入顯色試劑進(jìn)行檢測(cè)。6質(zhì)譜在蛋白質(zhì)糖基化研究中的應(yīng)用1位點(diǎn)分析a特征離子檢測(cè)尋找糖基特征離子，進(jìn)而確定糖肽如NacGlc特征離子為m/z204b酶處理前后酶解肽譜比對(duì)在TIC圖上，酶解前的糖肽峰酶解后消失，出現(xiàn)去糖肽，根據(jù)去糖肽的相對(duì)分子量及MS/MS圖確定糖基化位點(diǎn)2糖鏈組成，連接順序及連接方式的分析ESI串聯(lián)質(zhì)譜可以MS和MS/MS譜圖進(jìn)行解析

離子肼和FTICR在分析糖鏈結(jié)構(gòu)方面有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)Cancilla利用堿性降解和MALIDY-FT-MS成功分析了寡糖連接方式質(zhì)量數(shù)推斷對(duì)于同質(zhì)量異構(gòu)的糖基無(wú)法分辨（Man/Glu)利用外切糖苷酶處理后，再分析具體的糖鏈結(jié)構(gòu)還需進(jìn)行衍生化。（甲基化，還原胺化）增強(qiáng)疏水性和離子化能力Q-TOF-MS高分辨高靈敏度高精確度母離子掃描HexNAc+(m/z204)HexHexNAc+(m/z366)MALDI-TOF-MS能方便的檢測(cè)出衍生或未衍生的寡糖可以直接分析分子質(zhì)量較大的糖蛋白，并分辨不均一性展望

由于糖蛋白本身的復(fù)雜性，蛋白質(zhì)糖基化的研究必須采取多元化的研究策略和技術(shù)，而各種新的檢測(cè)方法也不斷的被采用。

隨著各種分離技術(shù)的不斷發(fā)展，研究方法也不斷翻新。蛋白質(zhì)糖基化研究也將成為翻譯后修飾研究的新熱點(diǎn)主要參考文獻(xiàn)1夏其昌曾嶸等蛋白質(zhì)化學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)科學(xué)出版社20042HirabayashiJ,etcJCB2002,771(1-2):67-873HirabayashiJ,etcTrendsGlycosciGlyco,2000,20(6):286-2874CourtenayHartetcElectrophoresis2003,24,588–5985CristianI.RuseetcAnal.Chem.2002,74,1658-16646STEVENAetcProteinScience(1993),2,183-196.7BenjaminL.etcAnal.Chem.2002,74,6088-60978WeiLi,etcAnal.Chem.2002,74,5701-57109RongZeng,etcEur.J.Biochem.266,352-358(1999)10PaulineM.etcProteomics2001,1,285–29411SchulzBLetcAnalChem,2002,74:6088-609712RobbeC,etcBiochemJ2004Dec1;384：307-1613Suzuk