發(fā)酵過(guò)程及優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

發(fā)酵過(guò)程及優(yōu)化實(shí)驗(yàn)——產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)淀粉酶是一類(lèi)能催化淀粉糖苷鍵水解的酶類(lèi)，作用于淀粉分子產(chǎn)生糊精、低聚糖及葡萄糖等多種產(chǎn)物。而淀粉酶是應(yīng)用最廣的酶制劑之一，占全球酶工業(yè)市場(chǎng)份額的25%-33%。淀粉酶廣泛分布于動(dòng)物、植物和微生物有機(jī)體中。目前，已報(bào)道的能夠產(chǎn)生淀粉酶的微生物種屬包括不動(dòng)桿菌屬、微球菌屬、黃隱球酵母、鹽單胞菌屬、青霉菌屬、類(lèi)芽孢桿菌屬、鏈霉素屬、假單胞菌屬和桿菌菌屬等。實(shí)驗(yàn)一培養(yǎng)基的配置、滅菌一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康臏毓逝渲莆⑸锱囵B(yǎng)基的原理及配制的一般方法、操作步驟。了解鑒別性培養(yǎng)基的原理，并掌握配制鑒別性培養(yǎng)基的放到和步驟。二、 實(shí)驗(yàn)原理鑒別性培養(yǎng)基是一類(lèi)在成分中加有能與目的菌的無(wú)色代謝產(chǎn)物發(fā)生顯色反應(yīng)的指示劑，從而達(dá)到只需用肉眼辨別顏色就能方便地從近似菌落中找出目的菌菌落的培養(yǎng)基。如對(duì)于淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選，選用的是在含有淀粉的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，滴加碘液進(jìn)行染色，若出現(xiàn)透明圈，則表明該菌能產(chǎn)生胞外淀粉酶。三、 材料和器材（1） 培養(yǎng)基：普通培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，自來(lái)水1000mL，pH7.2?7.4。鑒別型培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，可溶性淀粉10g，NaCl5g，瓊脂20g，自來(lái)水1000mL，pH7.2?7.4。另一個(gè)鑒別性培養(yǎng)基加可溶性淀粉15g每1000ml。（2） 器皿：電子天平，燒杯，錐形瓶，量筒，培養(yǎng)皿，玻棒，涂布棒，移液管等。（3） 其他：藥匙，記號(hào)筆，報(bào)紙等。（4） 碘原液：稱(chēng)取碘化鉀22g，加少量蒸餾水溶解，加入碘11g，溶解后定容至500mL，貯于棕色瓶中。稀碘液：取碘原液2mL，加碘化鉀20g，用蒸餾水定容至500mL，貯于棕色瓶中。四、 方法和步驟配制基本培養(yǎng)基，分裝50mL至250mL錐形瓶，供實(shí)驗(yàn)菌株擴(kuò)增。配制鑒別培養(yǎng)基，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)菌株是否能產(chǎn)胞外淀粉酶。配制稀釋用的生理鹽水，分裝4.5mL至每個(gè)試管(11管)。包扎培養(yǎng)皿、錐形瓶，移液管等。121°C，滅菌20min。將實(shí)驗(yàn)菌株經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋涂布在鑒別性培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天，在菌落周?chē)渭拥庖?，根?jù)透明圈的大小，挑取合適的單菌落進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在加可溶性淀粉15g/L的鑒別性培養(yǎng)基中涂布的稀釋梯度分別是10-3,10-4,10-5。在加可溶性淀粉10g/L的鑒別性培養(yǎng)基中涂布的稀釋梯度分別是10-5,10-6,10-7。五、 注意事項(xiàng)將實(shí)驗(yàn)菌株涂布至鑒別性培養(yǎng)基表面時(shí)，掌握好稀釋度，盡量獲得單獨(dú)的單菌落，以利于后期的篩選。六、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.菌落的透明圈1.菌落的透明圈透明圈2.菌落計(jì)數(shù)淀粉濃度(g/L)菌懸液的濃度梯度菌落數(shù)平均值1010-511010710910-69101010-73539371510-3菌落太多無(wú)法計(jì)數(shù)/10-413013713410-5323735實(shí)驗(yàn)二生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)物形成曲線的測(cè)定一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私夥峙囵B(yǎng)時(shí)微生物生長(zhǎng)曲線形成的原理及各時(shí)期的主要特點(diǎn)。學(xué)習(xí)微生物生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)物形成曲線的測(cè)定方法。二、 實(shí)驗(yàn)原理將少量微生物接種到一定體積的新鮮培養(yǎng)基中，在適宜的條件下培養(yǎng)，定時(shí)測(cè)定培養(yǎng)液中微生物的生長(zhǎng)量（吸光度或活菌數(shù)的對(duì)數(shù)），以生長(zhǎng)量為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制的曲線就是生長(zhǎng)曲線，它反映了微生物在一定環(huán)境條件下的群體生長(zhǎng)規(guī)律。依據(jù)生長(zhǎng)速率的不同，一般可把生長(zhǎng)曲線分為延滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期四個(gè)階段。這四個(gè)時(shí)期的長(zhǎng)短因菌種的遺傳特性、接種量和培養(yǎng)條件而異。因此，通過(guò)微生物生長(zhǎng)曲線的測(cè)定，可了解微生物的生長(zhǎng)規(guī)律，對(duì)于科研和生產(chǎn)實(shí)踐都具有重要的指導(dǎo)意義。測(cè)定微生物的數(shù)量有多種方法，如血球計(jì)數(shù)法、平板活菌計(jì)數(shù)法、稱(chēng)重法、比濁法等。本實(shí)驗(yàn)采用比濁法來(lái)測(cè)定。由于菌懸液的濃度與吸光值（A）也稱(chēng)光密度成正比，只要用分光光度計(jì)測(cè)得菌液的A后與其對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間作圖，即可繪出該菌株的生長(zhǎng)曲線，此法快捷、簡(jiǎn)便。產(chǎn)物形成曲線就是產(chǎn)物產(chǎn)量對(duì)培養(yǎng)時(shí)間的曲線。工業(yè)發(fā)酵的目的是為了收獲產(chǎn)物，因此必須搞清楚產(chǎn)物積累最高時(shí)所需的發(fā)酵時(shí)間。如果提前終止發(fā)酵，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)還沒(méi)有完全被利用，發(fā)酵液中的產(chǎn)物量偏低；如果發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，一方面產(chǎn)物可能會(huì)分解，另一方面也降低了設(shè)備利用率。因此，學(xué)會(huì)生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)物形成曲線的測(cè)定對(duì)工業(yè)發(fā)酵具有非常重要的指導(dǎo)意義。三、 材料和器材菌種實(shí)驗(yàn)菌株。培養(yǎng)基普通培養(yǎng)基，鑒別性培養(yǎng)基。器材高壓蒸汽滅菌鍋，超凈工作臺(tái)，分光光度計(jì)，搖床等。四、 方法和步驟（一）生長(zhǎng)曲線的測(cè)定將實(shí)驗(yàn)菌株經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋涂布在鑒別性培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天，在菌落周?chē)渭拥庖?，根?jù)透明圈的大小，挑取合適的單菌落進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將選擇的菌挑取到新鮮的基本培養(yǎng)基中，放置搖床上30°C，180rpm培養(yǎng)，過(guò)夜。將第2步中培養(yǎng)得到的菌懸液搖勻，吸取0.5mL接入新鮮基本培養(yǎng)集中，30C，180rpm培養(yǎng)，每隔4h取一瓶，在560nm處測(cè)吸光度，以未接種、但已滅菌的基本培養(yǎng)基作對(duì)照；每隔2小時(shí)取次樣。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，作生長(zhǎng)曲線。（二）產(chǎn)物形成曲線的測(cè)定同上，在進(jìn)行生長(zhǎng)量測(cè)定的同時(shí)，進(jìn)行產(chǎn)物形成量（淀粉酶活力）的測(cè)定，以培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)為橫坐標(biāo)，產(chǎn)物形成量為縱坐標(biāo)，作出產(chǎn)物形成曲線。五、 注意事項(xiàng)各瓶的接種量、培養(yǎng)條件應(yīng)一致。2、 若吸光度太高，可適當(dāng)稀釋后再測(cè)定。六、 結(jié)果記錄數(shù)據(jù)記錄培養(yǎng)時(shí)間/h04812162024283236A5600.0020.0040.0060.0180.1250.1850.0570.0890.8940.5432.繪制出實(shí)驗(yàn)菌株的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)物形成曲線。從標(biāo)曲中，查出對(duì)應(yīng)時(shí)間下吸光度值A(chǔ)660下的淀粉濃度，計(jì)算出酶活力。生長(zhǎng)曲線及淀粉酶活力圖見(jiàn)下個(gè)實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中。實(shí)驗(yàn)三液化型淀粉酶活力的測(cè)定一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆辗止夤舛确y(cè)定液化型淀粉酶活力的基本原理和方法。掌握在微生物分批培養(yǎng)時(shí)酶活力測(cè)定的基本方法。二、 實(shí)驗(yàn)原理淀粉酶是指能催化分解淀粉分子中糖苷鍵的一類(lèi)酶，包括a-淀粉酶，淀粉1,4-麥芽糖苷酶（6-淀粉酶），淀粉1,4-葡萄糖苷酶（糖化酶）和淀粉1,6-葡萄糖苷酶（異淀粉酶）。a-淀粉酶可從淀粉分子內(nèi)部切斷淀粉的a-1,4糖苷鍵，形成麥芽糖、含有6個(gè)葡萄糖單位的寡糖和帶有支鏈的寡糖，使淀粉的黏度下降，因此又稱(chēng)為液化型淀粉酶。淀粉遇碘呈藍(lán)色。這種淀粉-碘復(fù)合物在660nm處有較大的吸收峰，可用分光光度計(jì)測(cè)定。隨著酶的不斷作用，淀粉長(zhǎng)鏈被切斷，生成小分子糊精，使其對(duì)碘的藍(lán)色反應(yīng)逐漸消失，因此可以根據(jù)一定時(shí)間內(nèi)藍(lán)色消失的程度為指標(biāo)來(lái)測(cè)定a-淀粉酶的活力。三、 材料與器材樣品實(shí)驗(yàn)二中的發(fā)酵液4000rpm，5min離心得到的上清液作為粗酶液。試劑（1）碘原液：稱(chēng)取碘化鉀22g，加少量蒸餾水溶解，加入碘11g，溶解后定容至500mL，貯于棕色瓶中。比色稀細(xì)碘液：取碘原液2mL，加碘化鉀20g，用蒸餾水定容至500mL，貯于棕色瓶中。2%可溶性淀粉：稱(chēng)取可溶性淀粉(干燥至恒重)2g，用少量蒸餾水混合調(diào)勻，倒入煮沸的蒸餾水中，邊加邊攪拌，煮沸2min后冷卻，加水定容至100mL。須當(dāng)天配制。pH6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液：稱(chēng)取磷酸氫二鈉(Na2HPO4.12H2O)4.523g，檸檬酸0.807g，用水溶解并定容至100mL。0.5mL/L乙酸溶液，0.85%生理鹽水。器材恒溫水浴鍋、分管光度計(jì)。四、 方法和步驟標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將可溶性淀粉稀釋成0.2%，0.5%，1%，1.5%和2%的稀釋液。吸取淀粉稀釋液2.0mL加至試管中，再加入磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液1.0mL，40°C水浴保溫5min。加蒸餾水1mL，40C保溫30min后加入0.5mol/L乙酸10mL。吸取反應(yīng)液1mL，加稀碘液10mL，混勻，在660nm下測(cè)得吸光度A(用2.0mL蒸餾水代替步驟(2)中的淀粉稀釋液作為對(duì)照)。以淀粉濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線：

2.淀粉酶活力測(cè)定用2%可溶性淀粉按1(2)操作，用稀釋后的粗酶液1mL代替1(3)中的蒸餾水，測(cè)得吸光度a660,從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出相應(yīng)的淀粉濃度，求出被酶消耗的淀粉量。2.淀粉酶活力測(cè)定管號(hào)12345678910淀粉稀釋液/mL2222222222緩沖液/mL111111111140°C水浴鍋保溫5min蒸餾水/mL1111111111粗酶液/mL111111111140C保溫30min，然后加入0.5mol/L乙酸10mL，混勻吸取反應(yīng)液1mL稀碘液/mL10101010101010101010A6600.550.570.5710.5560.5160.4790.0650.0790.0730.082淀粉濃1.7211.7781.7801.7381.6241.5190.3430.3830.3660.391

度/%消耗淀粉量/(mg/ml)2.7932.2242.1962.6223.7594.81016.57116.1716.34416.088酶活力1.3961.1121.0981.3111.8792.4058.2868.0878.1728.0443.酶活力計(jì)算枯草壓板桿菌生長(zhǎng)曲線及淀粉酶活力圖活0.90.80.70.60.50.40.30.2枯草壓板桿菌生長(zhǎng)曲線及淀粉酶活力圖活0.90.80.70.60.50.40.30.2粉淀—生長(zhǎng)曲線淀粉酶活實(shí)驗(yàn)四實(shí)驗(yàn)菌株的培養(yǎng)基條件的優(yōu)化一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私獍l(fā)酵條件對(duì)產(chǎn)物形成的影響，用單因子試驗(yàn)找出實(shí)驗(yàn)菌株的最佳培養(yǎng)條件。掌握發(fā)酵培養(yǎng)基的配制原則，熟悉用正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的方法。二、 實(shí)驗(yàn)原理發(fā)酵培養(yǎng)基是指大生產(chǎn)時(shí)所用的培養(yǎng)基，由于發(fā)酵產(chǎn)物中一般含有較高比例的碳元素，因此培養(yǎng)基中的碳源含量也應(yīng)該比種子培養(yǎng)基中高，如果產(chǎn)物的含氮量高，還應(yīng)增加培養(yǎng)基中氮源比例。但必須注意培養(yǎng)基的滲透壓，如果滲透壓太高，又會(huì)反過(guò)來(lái)抑制微生物的生長(zhǎng)，在這種情況下可考慮用流加的方法逐步加入碳氮源。培養(yǎng)基組分對(duì)發(fā)酵起著關(guān)鍵性的影響作用。工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基與菌種篩選時(shí)所用的培養(yǎng)基不同，一般以經(jīng)濟(jì)節(jié)約為主要原則，因此常用廉價(jià)的農(nóng)副產(chǎn)品為原料。選擇碳源時(shí)常用山芋粉、麩皮、玉米粉等代替淀粉，而用豆餅粉、黃豆粉等作為氮源；此外，還應(yīng)考慮所選原料不至于影響下游的分離提取工作。由于這些天然原料的組分復(fù)雜，不同批次的原料成分各不相同，在進(jìn)行發(fā)酵前必須進(jìn)行培養(yǎng)基的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵培養(yǎng)基中的原料多是大分子物質(zhì)，微生物一般不能直接吸收，必須通過(guò)胞外酶的作用后才能被利用，所以是一些“遲效性”營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。而微生物分泌的胞外酶有不少是誘導(dǎo)酶，為了使發(fā)酵起始階段微生物能快速繁殖，可適當(dāng)在培養(yǎng)基中添加一些速效營(yíng)養(yǎng)物。三、 材料與器材菌種實(shí)驗(yàn)菌種。培養(yǎng)基以基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別添加葡萄糖、可溶性淀粉、果糖、蔗糖和乳糖作為碳源。器材電子天平、高壓蒸汽滅菌鍋、搖床、超靜工作臺(tái)。四、 方法與步驟查閱資料，選定培養(yǎng)基中碳源的含量，計(jì)算出對(duì)應(yīng)的葡萄糖、可溶性淀粉、果糖、蔗糖和乳糖的量（以碳含量相同為準(zhǔn)則）；配置相應(yīng)培養(yǎng)基。將實(shí)驗(yàn)菌株接種至新鮮的基本培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)過(guò)夜。將上述菌懸液以10%的接種量接種至各個(gè)培養(yǎng)基中，30C，180rpm培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間以之前測(cè)出酶活最高點(diǎn)為準(zhǔn)。檢測(cè)各個(gè)培養(yǎng)基培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)菌株的菌含量及酶活量。五、 結(jié)果記錄碳源葡萄糖果糖乳糖可溶性淀粉蔗糖A5600.8170.7850.5260.8970.638A6600.2870.280.0190.0370.4141、各個(gè)碳源對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株生長(zhǎng)的影響圖

各個(gè)碳源對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株生長(zhǎng)的影響圖198765432119876543210.0.0.0.0.0.0.0.0.葡萄糖可溶性淀粉果糖 蔗糖 乳糖不同碳源從芽孢桿菌生長(zhǎng)情況來(lái)看，用淀粉作碳源最為合適。（不同碳源對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株生長(zhǎng)量由大到小順序?yàn)椋嚎扇苄缘矸?、葡萄糖、果糖、蔗糖和乳糖。?、各個(gè)碳源對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株產(chǎn)酶的影響圖各個(gè)碳源對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株產(chǎn)酶影響圖09876543210987654321力活酶葡萄糖 可溶性淀粉 果糖 蔗糖 乳糖不同碳源從芽孢桿菌的生產(chǎn)淀粉的酶活力的情況來(lái)看，以乳糖為碳源的培養(yǎng)基最佳。（不同碳源對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株產(chǎn)酶酶活力由大到小順序?yàn)椋喝樘恰⒖扇苄缘矸?、果糖、葡萄糖、蔗糖。）思考題1.如若通過(guò)鑒別性培養(yǎng)基鑒定該實(shí)驗(yàn)菌株不產(chǎn)生透明圈，是否可以認(rèn)定該菌就不產(chǎn)淀粉酶？原因是什么？不可以。原因還有可能是該菌產(chǎn)的淀粉酶很少，透明圈不明顯；或是培養(yǎng)時(shí)間不夠，還沒(méi)有開(kāi)始產(chǎn)淀粉酶。不一定代表該菌就不產(chǎn)淀粉酶。如果每次從同一搖瓶中取出1mL進(jìn)行測(cè)定，會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生怎么樣的影響？這樣的話(huà)前面測(cè)的值與后面測(cè)的值除了培養(yǎng)時(shí)間不同之外，培養(yǎng)液的多少等其他條件也不相同，無(wú)法在只有一個(gè)變量的情況下相互對(duì)照，結(jié)果會(huì)變得不準(zhǔn)確。本實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)物形成量用淀粉酶活力來(lái)表征，是否合適？為什么？合適。產(chǎn)生的淀粉酶用來(lái)分解淀粉正好是酶活力在此次試驗(yàn)的定義即以每毫升粗酶液在40°C，pH6.0的條件下每小時(shí)所分解的淀粉毫克數(shù)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得曲線，我們可以得到哪些結(jié)論？一段時(shí)間內(nèi)枯草芽孢桿菌量不斷增加，超過(guò)一段時(shí)間后開(kāi)始緩慢減少。而酶的活力也隨時(shí)間先升后降，最高處有一個(gè)酶活力最高的時(shí)間。查閱相關(guān)資料，提出切實(shí)可行的提