免疫組化實驗課課件

免疫組化實驗課41、俯仰終宇宙，不樂復(fù)何如。42、夏日長抱饑，寒夜無被眠。43、不戚戚于貧賤，不汲汲于富貴。44、欲言無予和，揮杯勸孤影。45、盛年不重來，一日難再晨。及時當(dāng)勉勵，歲月不待人。免疫組化實驗課免疫組化實驗課41、俯仰終宇宙，不樂復(fù)何如。42、夏日長抱饑，寒夜無被眠。43、不戚戚于貧賤，不汲汲于富貴。44、欲言無予和，揮杯勸孤影。45、盛年不重來，一日難再晨。及時當(dāng)勉勵，歲月不待人。免疫組織化學(xué)實驗課計劃趙坤慶趙清杰中國科學(xué)院動物研究所Email：zhaokqioz.aczhaoqingjie11mails.gucas.ac實驗一實驗動物取樣、固定與保存（4學(xué)時）實驗室規(guī)章制度及實驗室安全講解學(xué)生分組分小組配置相關(guān)溶液：操作動物的致死法及取材:操作細(xì)胞標(biāo)本的制備：操作尸體解剖的取材：講解活檢標(biāo)本的取材：講解組織樣品的固定：操作一、引言英語寫作是較高層次的語言技能，大學(xué)英語寫作教學(xué)效果不顯著。為了應(yīng)對四、六級考試，教師講寫作技巧，學(xué)生按照三段論的套路填空，然后教師對作文進(jìn)行精批細(xì)講，結(jié)果學(xué)生因體會不到創(chuàng)作的樂趣而對寫作失去信心，教師則因批改作文而力不從心。在這種情況下，寫作教學(xué)收效甚微，學(xué)生的寫作能力很難得到提高，英語水平自然達(dá)不到理想的狀態(tài)。民辦高校的大學(xué)英語寫作教學(xué)也是如此。民辦高校非英語專業(yè)學(xué)生具有自身的特點，他們英語詞匯量偏小、語法基礎(chǔ)薄弱，對英語寫作及英語學(xué)習(xí)存在焦慮情緒，學(xué)習(xí)積極性不高，自我認(rèn)可度不高。此外，民辦高校非英語專業(yè)的英語課課時緊、內(nèi)容多，教師很難對學(xué)生的寫作進(jìn)行全面詳細(xì)的指導(dǎo)，學(xué)生的寫作能力難以得到全面提高。王初明教授提出的“寫長法”是以寫的方式促進(jìn)外語教學(xué)的方法。該方法強調(diào)通過寫長增加學(xué)生語言輸出的量，提高學(xué)生的寫作水平。自寫長法理論提出以來，諸多學(xué)者從不同方面對其進(jìn)行了大量的研究，包括理論探討和實證研究。實證研究中，有些是以高中學(xué)生為研究對象，還有些是以英語專業(yè)的大學(xué)生、非英語專業(yè)的大學(xué)生和高職的學(xué)生為研究對象。以民辦高校非英語專業(yè)大學(xué)生為研究對象的相關(guān)研究鮮有人為。因此本文以寫長法理論為基礎(chǔ)，以民辦高校非英語專業(yè)的學(xué)生為研究對象，運用SPSS軟件分析數(shù)據(jù)，探討寫長法在大學(xué)英語教學(xué)中的應(yīng)用效果。二、理論基礎(chǔ)（一）可理解輸出假設(shè)寫長法的理論依據(jù)是Swain的輸出假設(shè)理論。Swain認(rèn)為，學(xué)習(xí)者必須經(jīng)過大量的語言輸出實踐才能內(nèi)化輸入的語言，輸出有強化流利性程度的功能。她提出了輸出在促進(jìn)準(zhǔn)確性方面的三個功能：“注意”的功能、假設(shè)檢驗和有意識的反顧。學(xué)習(xí)者因他人的提醒或自發(fā)思考注意到不同語言形式的使用，這使他反過來檢查自己使用的語言；如果仍不能修正自己的錯誤，他將轉(zhuǎn)向輸入以獲得更多的信息。Skehan認(rèn)為協(xié)調(diào)輸出可以得到學(xué)習(xí)者目前語言同等水平的輸入，即輸出可以產(chǎn)生更好的輸入。寫長法通過輸出量的積累，促進(jìn)學(xué)習(xí)者輸入的量，以量促質(zhì)；同時，大量的寫作體驗可以使學(xué)生獲得學(xué)習(xí)成就感，增強信心，從而能夠提高輸出的質(zhì)。（二）寫長法理論寫長法革新傳統(tǒng)的寫作教學(xué)方法，通過大量的寫長練習(xí)，以數(shù)量促進(jìn)質(zhì)量，實現(xiàn)學(xué)生寫作水平由量到質(zhì)的飛躍。該方法的教學(xué)理念是打開學(xué)習(xí)者的情感通道，淡化學(xué)習(xí)寫作，激發(fā)學(xué)習(xí)者興趣，挖掘其自身的學(xué)習(xí)潛力。該方法強調(diào)寫作任務(wù)的設(shè)計必須能夠激發(fā)學(xué)習(xí)者的興趣，教師在批改作文時發(fā)現(xiàn)閃光點，淡化錯誤的修改，少講寫作方法，讓學(xué)生從寫作中悟出寫法，這既可以增強學(xué)生的信心，也能夠減輕教師的負(fù)擔(dān)。三、實驗（一）研究問題寫長法教學(xué)是否促進(jìn)了民辦高校非英語專業(yè)學(xué)生作文水平的提高？是否促進(jìn)學(xué)生英語學(xué)習(xí)水平的提高？（二）研究對象本研究選取的受試為山東協(xié)和學(xué)院2012級非英語專業(yè)大一兩個本科班的63名學(xué)生，其中實驗班31人，對照班32人，男女學(xué)生比例基本相當(dāng)，他們已經(jīng)在本校進(jìn)行了一學(xué)期的英語學(xué)習(xí)。本學(xué)期是第二學(xué)期，所用教材是全新版大學(xué)英語第二冊。大學(xué)英語沒有設(shè)專門的寫作課，寫作是精讀課的一部分。前測成績來源于實驗前對兩個班的學(xué)生進(jìn)行的英語作文測試成績和第一學(xué)期期末英語考試成績，試卷滿分均為100分。然后運用IBMSPSSStatistics19對實驗班和對照班的作文測試成績和第一學(xué)期期末英語考試成績進(jìn)行獨立樣本T檢驗分析，結(jié)果顯示兩個班的英語作文測試平均成績沒有顯著差異（t=0.362，p=0.65），第一學(xué)期期末英語考試平均成績也沒有顯著差異（t=1.076，p=0.286）。實驗班和對照班由同一名教師教授，實驗班接受寫長法英語教學(xué)，而對照班接受傳統(tǒng)的作文教學(xué)方法，實驗為期一學(xué)期。前測和后測作文試卷由同一位教師批閱。前測作文成績、第一學(xué)期期末英語成績、后測作文成績以及第二學(xué)期期末英語考試成績將作為衡量英語水平的依據(jù)。（三）實驗的方法與步驟1.寫作任務(wù)的設(shè)計。寫作任務(wù)直接決定著語言輸出的質(zhì)量，寫作任務(wù)必須能讓學(xué)習(xí)者愿意寫、有的寫，能夠?qū)懙瞄L，必須是學(xué)習(xí)者感興趣的話題。因此本研究在選取寫作任務(wù)時精挑細(xì)選，從幾個教全新版大學(xué)英語的教師選出的題目中進(jìn)行第二輪的挑選；這些題目都是跟精讀課文內(nèi)容緊密相關(guān)，在課上經(jīng)過討論的；或者是由教師提供讀物讓學(xué)生寫讀后感，教師同時提供重點詞匯、短語和句型供學(xué)生使用，以讀促寫長。題目的設(shè)計考慮到了學(xué)生具備的背景知識以及他們的英語表達(dá)能力，多是些學(xué)生感興趣的話題，比如一次難忘的經(jīng)歷，由于印象比較深刻，有東西可寫，學(xué)生往往愿意寫，也能夠?qū)戦L。同時，鼓勵學(xué)生到圖書館查閱資料、增大他們的閱讀量，擴大背景知識和信息量，使讀寫相長。寫作長度的下限一開始定為150詞，逐漸增加到200詞、300詞，甚至更長。作文任務(wù)由教師課內(nèi)布置，由學(xué)生課外完成，每兩周完成一篇作文。教師要求上交作文前，學(xué)生至少檢查作文兩遍，然后與同學(xué)交換檢查。這樣既避免了低級錯誤的發(fā)生，又促進(jìn)了同學(xué)之間的相互學(xué)習(xí)。教師從作文長度（40分）、作文結(jié)構(gòu)（20）、作文思想（20）和語言表達(dá)（20）四個方面打分，教師點出作文中的閃光點，以及學(xué)生使用的新的表達(dá)方法；盡量避免批改錯誤，可以點出錯誤，讓學(xué)生自己修改或同學(xué)幫助修改；最后選出兩篇優(yōu)秀作文在課內(nèi)集體評閱。整個過程中，教師要淡化錯誤，強調(diào)閃光點，讓學(xué)生有信心、有興趣繼續(xù)寫。2.數(shù)據(jù)的收集與分析。經(jīng)過一個學(xué)期的寫長法實驗，對實驗班和對照班的學(xué)生進(jìn)行一次英語作文測試，作文滿分為100分。將兩個班學(xué)生的后測英語作文成績及第二學(xué)期期末英語考試成績分別進(jìn)行比較。期末英語考試的總分為100分，其中作文占15分。表2顯示實驗班和對照班的后測作文平均分分別為79.34和76.28，兩個班的作文成績有顯著性差異（t=2.298，p小學(xué)語文新課程標(biāo)準(zhǔn)指出，要注重語文的熏陶感染作用，引導(dǎo)學(xué)生多讀書，好讀書，讀好書，幫助學(xué)生構(gòu)建健康的審美情趣，形成正確的人生態(tài)度和價值觀念。對于小學(xué)生來說，閱讀不僅可以提高小學(xué)生的學(xué)習(xí)成績、開拓小學(xué)生的知識視野，還能在一定程度上提高寫作能力，成為個體今后生存發(fā)展的重要技能。因而教師要探索更多適合小學(xué)生閱讀實際的教學(xué)方式，提高小學(xué)生閱讀能力。一、小學(xué)語文閱讀教學(xué)現(xiàn)狀1.閱讀教學(xué)載體缺乏創(chuàng)新小學(xué)生的身心發(fā)育尚不夠成熟，認(rèn)知能力較為薄弱，對事物缺乏精確的感知，注意力也缺乏穩(wěn)定持久性，認(rèn)識事物往往始于好奇心、終于興趣，然而，小學(xué)語文閱讀教學(xué)又是從字詞句概念入手，向篇章閱讀過過渡，這種枯燥的教學(xué)模式本身就在消耗著學(xué)生的好奇心，以說教為主的課堂模式更是讓學(xué)生視閱讀為完成任務(wù)，根本提不起閱讀興趣，再加上小學(xué)生自身的關(guān)注力有限，影響閱讀能力的同時也對構(gòu)建小學(xué)生的思維體系造成困擾。[1]2.課外閱讀導(dǎo)向缺乏標(biāo)準(zhǔn)作為閱讀教學(xué)的擴充模式，課外閱讀在新課程改革深入實施的當(dāng)下，已經(jīng)引起了多數(shù)教師的高度關(guān)注，能夠為學(xué)生列出符合年齡特征的課外書目，提出一些基本的閱讀要求，但是，仍然有一部分教師對待課外閱讀的認(rèn)識不夠清晰，把課外閱讀視為一種可有可無的閱讀教學(xué)方式，偶爾為學(xué)生推薦幾本課外參考讀物，不布置任何閱讀要求，學(xué)生對文章字句段落的理解情況、情緒情感體驗如何也不做相應(yīng)記錄，閱讀習(xí)慣難以形成，這些都是課外閱讀盲目性的體現(xiàn)，使得一些學(xué)生表面看來是進(jìn)行了課外閱讀，但卻收效甚微。[2]二、培養(yǎng)小學(xué)生閱讀能力的策略1.以培養(yǎng)興趣為抓手，引導(dǎo)學(xué)生走近閱讀俗話說，興趣是最好的老師，培養(yǎng)小學(xué)生的閱讀能力也應(yīng)當(dāng)以提高閱讀興趣為基本著力點，結(jié)合小學(xué)生身心發(fā)育特征，探索發(fā)現(xiàn)小學(xué)生閱讀興趣的基本規(guī)律。教師可以選擇一些趣味性十足的閱讀材料，如《哈利波特》、《了不起的小葉子》等等，讓學(xué)生對這些材料展開閱讀，吸引小學(xué)生對閱讀的初始注意力，并在教學(xué)過程中將這些趣味性材料與教材中的閱讀內(nèi)容相互融合，進(jìn)一步激發(fā)學(xué)生的閱讀興趣，實現(xiàn)閱讀能力的基礎(chǔ)性構(gòu)建。2.以革新理念為核心，帶動學(xué)生參與閱讀在進(jìn)行閱讀教學(xué)時，要摒棄預(yù)先設(shè)置問題的方式，讓學(xué)生進(jìn)行初步閱讀，在這個過程中自主發(fā)現(xiàn)問題并記錄下來，進(jìn)入到熟讀材料的階段，在熟讀材料的過程中，體會字詞句段落大意，把握文章基本架構(gòu)，帶著自主發(fā)現(xiàn)的問題，理解文章的主題，了解作者的寫作技巧以及文章編排方式，在精讀過程中，體會字里行間作者流露出的情緒情感，關(guān)照自身的情感體驗，真正實現(xiàn)對靈魂的洗滌。這樣的閱讀理念讓教師的主導(dǎo)地位逐漸削弱，成為學(xué)生閱讀程度逐漸遞進(jìn)的引導(dǎo)者，讓學(xué)生脫離了被動接受的學(xué)習(xí)地位，自主發(fā)現(xiàn)問題，在自主閱讀以及教師引導(dǎo)中自主解決問題，加深了情緒情感體驗，對文章的理解也更加深刻，久而久之能夠收獲一定的閱讀技巧，積累相應(yīng)的閱讀經(jīng)驗。3.以豐富教學(xué)手段為關(guān)鍵，敦促學(xué)生享受閱讀在進(jìn)行閱讀教學(xué)時，教師應(yīng)當(dāng)結(jié)合小學(xué)生形象思維發(fā)育比較成熟的特點，進(jìn)行閱讀教學(xué)手段的革新。教師可以采用翻轉(zhuǎn)課堂模式，在課前錄制好閱讀課程教學(xué)視頻，要求學(xué)生對這些閱讀視頻進(jìn)行預(yù)習(xí)，整理并記錄閱讀問題，在課程進(jìn)行中，開展師生互動、生生討論，得到答案的同時在互動過程中體會到不同的閱讀理解及情感體驗，達(dá)到創(chuàng)新性閱讀及人文素養(yǎng)的培育；對于低年級學(xué)生，教師可以采用游戲的方式，把閱讀內(nèi)容穿插到游戲過程中，設(shè)置特定情境讓學(xué)生進(jìn)行角色扮演，在不知不覺中獲取知識培養(yǎng)閱讀能力，比如在講解《我不是最弱小的》一課中，讓學(xué)生分別扮演媽媽和薩沙，體會媽媽心中弱小的薩沙和薩沙心中自己是勇敢者的感受，在角色體驗中獲得情緒情感共鳴，達(dá)到潛移默化的閱讀效果；教還可以運用多媒體技術(shù)，以聲形并茂的流動畫面，刺激學(xué)生的感官，讓學(xué)生如身臨其境般感受畫面中的意境，從而拓展想象空間，獲得情感體驗，在閱讀中更易于貼近作者寫作中的心靈感受。[3]4.以創(chuàng)新課外閱讀為補充，輔助學(xué)生愛上閱讀要解決課外閱讀中存在的盲目性，教師就要充分認(rèn)識到課外閱讀的重要性，發(fā)揮引導(dǎo)性作用為學(xué)生的課外閱讀制定規(guī)劃。要以學(xué)生的年齡特點為依據(jù)選擇相適應(yīng)的課外讀物，在此基礎(chǔ)上提出合理的閱讀要求，比如，限定閱讀時間，開展“圖書漂流”活動，根據(jù)課外讀物中摘抄的內(nèi)容辦班級板報，評選優(yōu)秀的板報作品等等；要規(guī)劃出特定時間對某一課外讀物進(jìn)行集中解讀，解答學(xué)生閱讀中普遍存在的難點問題，開展小組合作學(xué)習(xí)讓每個學(xué)生說明自己的見解，獎勵對這一課外讀物理解相對到位的學(xué)生，形成激勵機制，鼓勵學(xué)生積極參與到課外閱讀中，養(yǎng)成自主閱讀的好習(xí)慣；還要開展相應(yīng)的語文閱讀實踐活動，挑選以大自然為主題的課外書目，如《神奇的動物》、《科學(xué)與常識》等等，讓學(xué)生在自主閱讀中發(fā)現(xiàn)問題，教師安排固定時間引導(dǎo)學(xué)生走進(jìn)大自然，觀察自然界動植物特性，自主尋找答案，同時也開闊了視野，增長了見識，能夠以更加充分飽滿的情感體驗參與到接下來的閱讀當(dāng)中。結(jié)語總而言之，改變傳統(tǒng)的閱讀教學(xué)理念，不斷豐富教學(xué)手段是當(dāng)前小學(xué)語文教學(xué)最重要的任務(wù)，是國家教育事業(yè)發(fā)展的重要組成部分。隨著教學(xué)方式的不斷改革，傳統(tǒng)的教學(xué)方式已經(jīng)無法滿足當(dāng)代小學(xué)生的學(xué)習(xí)需要，在現(xiàn)階段的小學(xué)語文教學(xué)過程中必須堅持“以生為本”的教學(xué)原則，利用對話交流提高小學(xué)生的閱讀積極性，讓小學(xué)生在閱讀的過程中充分發(fā)揮主動性，為實現(xiàn)終身閱讀奠定基礎(chǔ)。分小組配置相關(guān)溶液1配制10XPBS及1XPBS10×PhosphateBufferedSolution（PBS）(pH7.4)：ReagentWeightFinalconcentrationNaClMW=58.4481.816g1.4MKClMW=74.552.01g27mMNa2HPO4·12H2OMW=358.1435.8g100mMKH2PO4MW=136.092.45g18mMH2OUpto1000ml注：1000ml溶液用約1ml10MNaOH調(diào)節(jié)pH值至7.4。因為實驗室所用蒸餾水、三蒸水和去離子水的本底pH值有一定差異，加之NaOH可能由于放置時間而產(chǎn)生pH值的變化，故實際用量需根據(jù)情況調(diào)整。2配制1NHCl，1NNaOH3配制組織固定液：4%PFA4配制熱修復(fù)液：Tris-EDTA5配制梯度酒精：75%，85%，95%6酒精：二甲苯=1:17石蠟：二甲苯=1:1分小組配置相關(guān)溶液動物的致死法動物處死方法：

1.麻醉法乙醚或4％戊巴比妥靜注

2.空氣栓塞法

3.斷頭法

4.斷頸法

5.二氧化碳窒息法

病人死亡后，一般要在數(shù)小時后才能做尸檢，因此，及時取材，盡早固定是開展IHC檢測的關(guān)鍵。尸檢組織的取材

抗原在組織中的分布常不均一，取材時應(yīng)考慮：主要病灶，病灶與正常組織交界處，遠(yuǎn)離病灶的正常組織。

組織大?。洪L1cm×寬1cm×厚0.2～0.3cm。手術(shù)切除標(biāo)本的取材

1.組織要求離體后30min內(nèi)浸入固定液，尤其是開展分子生物學(xué)工作。動物組織取材要求心臟還在跳動時取材。2.注意防止人為因素的影響

刀和剪要快，刀要足夠長。

3.組織塊的大小

厚為0.1～0.3cm，大小可根據(jù)需要而定

4.組織的取材位置

要視研究目的，觀察部位而定5.取材時間

原則上，應(yīng)盡快取材，但比較大的手術(shù)標(biāo)本如胃、肺、腸等器官，最好先固定后取材。組織取材注意事項

培養(yǎng)的活細(xì)胞可分貼壁和懸浮二種。貼壁細(xì)胞可將

（1）細(xì)胞大量培養(yǎng)后，經(jīng)消化將細(xì)胞制成懸液（106）涂在涂有切片粘合劑的載玻片上，涼干后固定。

（2）將細(xì)胞直接培養(yǎng)在蓋玻片上。

（3）將細(xì)胞直接培養(yǎng)在6孔或9孔板上，經(jīng)固定后可行IHC?；罴?xì)胞標(biāo)本的制備法

目的

(1)防止組織細(xì)胞的死后變化，防止自溶和腐敗，以保持組織細(xì)胞的固有形態(tài)。

(2)使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、糖和酶等各種抗原成份轉(zhuǎn)變成不溶性物質(zhì)，以保持它原有的結(jié)構(gòu)與生活時相仿。（3）使組織中的各種物質(zhì)沉淀和凝固起來而產(chǎn)生不同的折射率，造成光學(xué)上的差異，以便染色后易于鑒別和觀察。

（4）固定劑兼有硬化作用、使組織硬化、增加組織硬度、便于制片。（5）防止細(xì)胞過度收縮或膨脹而失去其原有形態(tài)結(jié)構(gòu)。

（6）經(jīng)過固定的組織能對染料產(chǎn)生不同的親和力而著色清晰，便于辨認(rèn)。組織標(biāo)本的固定

(1)甲醛固定液

10％福爾馬林

(2)4％多聚甲醛固定液

(3)BouinS液及改良BouinS液

固定液的種類(1)大小2cm×2cm×0.3cm

(2)及時固定(3)固定時間固定時間要視組織塊的厚薄，固定液的種類及濃度，溫度而定，原則上，組織塊大小與固定時間成正比，固定液的穿透力及濃度與固定時間成反比。

(4)組織固定后必須徹底沖洗。固定方法的選擇及注意事項實驗步驟組織取材與細(xì)胞制備。組織取材：小鼠子宮、淋巴結(jié)、胸腺、脾、骨髓。組織洗滌。將取到的材料在滅菌預(yù)冷的PBS中洗凈，盡量徹底洗掉血液，以免切片觀察時紅細(xì)胞影響結(jié)果；組織固定。所取材料于4％多聚甲醛中固定24小時（固定的時間依組織大小而定，組織較大可固定較長時間，如果一開始分小塊固定，則固定時間應(yīng)縮短，約6小時）；組織脫水。分別用50％和70％酒精脫水1h，樣品在70％酒精中置于4℃保存直至石蠟包埋；梯度脫水。組織塊從70％酒精中取出，在80％、95%、100％、100％酒精中各脫水1h；透明。組織塊在100％酒精/二甲苯（1:1）中透明30min；再到二甲苯中透明，具體時間根據(jù)組織塊大小而定，以組織塊完全透明為宜；浸蠟。包埋機可直接接取加溫并過濾好的石蠟液體，組織塊在二甲苯/石蠟(1:1)、石蠟、石蠟中各透蠟2h；實驗完畢整理實驗室及實驗臺實驗二組織包埋與切片及HE染色（4學(xué)時）實驗內(nèi)容：1經(jīng)脫水，透明，浸蠟的組織樣品進(jìn)行包埋：操作2包埋樣品的切片：石蠟切片3切片的HE染色：目的：

由于石蠟不溶于水和醇類試劑，只溶解在二甲苯類試劑中。因而,組織經(jīng)固定和水洗后含大量水分,需用乙醇類試劑進(jìn)行脫水,水脫完后,組織內(nèi)含有大量的乙醇,還必須用能溶解乙醇的二甲苯來置換,最后經(jīng)浸蠟,組織細(xì)胞內(nèi)被大量石蠟支撐,才使組織能用于石蠟切片。組織脫水、浸蠟及包埋(1)脫水：75％、85％乙醇，95％Ⅰ、Ⅱ、

Ⅲ乙醇，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。

(2)透明：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ(3)浸蠟：石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ、石蠟Ⅲ

(4)石蠟包埋：修蠟塊，標(biāo)號常規(guī)石蠟包埋過程一般的組織化學(xué)染色切片厚度要求在5～7μm左右，神經(jīng)組織切片的厚度要求比較特殊，一般在20～100μm之間，以便觀察神經(jīng)纖維的走行。對于不同的組化反應(yīng)在切片制作上有不同的要求。目前的切片技術(shù)主要有：冰凍切片、石蠟切片、超薄切片（電鏡學(xué)）。

組織切片⑴驟冷（Quenching）驟冷的目的①最主要的目的是防止標(biāo)本內(nèi)的水結(jié)成冰晶——破壞標(biāo)本結(jié)構(gòu)。②殺死組織（細(xì)胞）。③快捷制片。冰凍切片是酶組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)最常用的方法。它的突出特點：能比較好地保存組織的酶活性，較完好地保存組織抗原的免疫活性。

冰凍切片⑵切片驟冷后的組織塊切片機上切片，目前的切片機有兩類：1）開放式冰凍切片機（半導(dǎo)體制冷切片機、

甲醇制冷切片機及老式CO2、氯乙烷等切片機）。開放式冰凍切片機由于暴露于空氣中，溫度不易控制，技術(shù)難度大，現(xiàn)多已淘汰。2）恒溫冰凍切片機（Cryastat）——常用

恒溫冰凍切片機切片后如不染色，必須冷風(fēng)吹干，貯存于低溫冰箱內(nèi)或短暫預(yù)固定后，冰箱貯存。

冰凍切片LEICA冰凍切片機石蠟切片LeicaRM2235RotaryMicrotome

(1)連續(xù)切片按序貼在玻片的下1/3。

(2)52－60℃烤片。

(3)切片厚2～4μm。

(4)切片刀要快

(5)編上號

(6)切片可在4℃保存數(shù)年（石蠟切片）(7)冰凍切片后需涼干后立即固定

(8)冰凍切片分固定和新鮮組織，固定組織需經(jīng)庶糖處理24h，冰凍切片。

(9)冰凍切片固定后-80℃保存?zhèn)溆们衅蠹白⒁馐马棸?。在包埋盒底先鋪上一定厚度的石蠟，置于熱臺，將組織用鑷子放入，調(diào)整好方向，將包埋盒置于涼臺，使底部略微凝固，繼續(xù)澆上石蠟，放上切片托，涼臺冷凍，澆蠟，冷凍，直至整個蠟塊成型。置于涼臺，待石蠟徹底凝固后，利用切片托將蠟塊取出。組織切片。把切片刀架上，固定緊，然后利用切片托將蠟塊在切片機固定器上夾緊。若位置不夠平，可調(diào)整切片臺的位置，同時修塊。切片時，一開始可以將厚度調(diào)整至20μm。右手勻速轉(zhuǎn)動手柄，直到把組織全部切出，這時將厚度調(diào)為5μm，繼續(xù)切片。蠟片切成后，右手用小鑷子攝蠟片，左手用毛筆沿刀鋒輕輕把蠟片分開，切面朝下把切片放入42℃水中，展平后用鑷子輕輕將連續(xù)蠟片分開，再用載玻片撈起，晾干，放入切片盒。37℃烤片過夜。石蠟包埋及切片實驗步驟HE染色法，即是蘇木精-伊紅染色法。石蠟切片技術(shù)里常用的染色法之一。蘇木精染液為堿性，主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核糖體著紫藍(lán)色；伊紅為酸性染料，主要使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色。易于被堿性或酸性染料著色的性質(zhì)分別稱為嗜堿性和嗜酸性；若于兩種染料的親和力都不強，則稱中性。一般的組織變化和組織產(chǎn)物都可以通過這一染色法顯示出來。是形態(tài)學(xué)最常用的染色方法。HE染色HE染色步驟試劑時間×次數(shù)1二甲苯10min×32100％酒精5min×3395％酒精5min×1485％酒精5min×1570％酒精5min×1650％酒精5min×17蒸餾水5min×38蘇木精染液10min9自來水（緩流水）10min10蒸餾水2min×1111％HCl分色1-2s（浸入即取出）12自來水（緩流水）立即沖凈13蒸餾水2min×1140.1％氨水

返藍(lán)2-2.5min15蒸餾水2min×11650％酒精5min×11770％酒精5min×11885％酒精5min×119伊紅染液20s2095％酒精

脫浮色5min×12195％酒精

5min×122100％酒精5min×323二甲苯10min×324二甲苯&封片劑封片25通風(fēng)櫥晾干4h或過夜實驗三免疫組化染色（4學(xué)時）實驗內(nèi)容：1免疫組化原理2免疫組化操作免疫組化原理抗原＋抗體（特異性）＋酶標(biāo)記抗體，通過酶與底物作用生成有色反應(yīng)物，定位組織或細(xì)胞內(nèi)抗原的一門技術(shù)。設(shè)對照的目的是為了排除假陰性和假陽性。對照染色的目的假陰性的原因主要有：①組織處理不當(dāng)，抗原丟失過多或被遮蔽；②抗體失活、效價過低或稀釋度不合適（主要指一抗，即特異性抗體）；③染色步驟遺漏及差錯，或顯色劑的選擇、緩沖液的pH和離子強度不當(dāng)?shù)?。假陽性均系由多種因素造成的非特異著色所致，原因主要有：①自發(fā)熒光或內(nèi)源酶等干擾；②抗體試劑不純(特別是一抗）；③操作失誤，如污染、切片干枯或顯色劑操作不當(dāng)?shù)?；對照染色大致可分為陽性組織對照、陰性組織及陰性試劑對照和自身對照四大類：對照的種類及其選用目的陽