99mTc示蹤法初步研究注射NGF家兔藥代動(dòng)力學(xué)

99mTc示蹤法初步研究注射NGF家兔藥代動(dòng)力學(xué)

作者：付昌文，呂天潤(rùn)，曹小建，劉軍

【摘要】目的使用99mTc示蹤初步研究注射用NGF在家兔體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)。方法將NGF用99mTc標(biāo)記，利用同位素示蹤法和TCA沉淀法測(cè)得NGF含量與放射性計(jì)數(shù)的線性關(guān)系，并由靜脈注射至家兔體內(nèi)，通過上述檢測(cè)方法得到不同時(shí)段血漿中微量NGF濃度，使用3P87軟件分析藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)并初步分析組織分布。結(jié)果NGF靜脈注射后的家兔體內(nèi)代謝符合二隔室分布模型；按劑量40μg/kg靜注后，測(cè)得T1/2α=、T1/2β=、AUC=·h·ml－１。結(jié)論99mTc具有較好的示蹤效果，適用于體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究。

【關(guān)鍵詞】99mTc-NGF；藥代動(dòng)力學(xué)；TCA沉淀法

【Abstract】ObjectiveTostudythepharmacokineticsofNGFinrabbitbyisotopictracing.MethodsNGFwaslabeledwith99mTc，anditsγ-raycountswasdetectedbyisotopictracingandtrichloroaceticacid(TCA)precipitationmethod.Fromcpmofγ-rayandNGFcontentofsamples，thestandardcurvewasdrawnanditwasnearlyawasinjectedintorabbit(n=30)bodyfromvenaauris.Samplesofrabbitbloodwerecollectedindifferenttime(，，，，，，，1，，2，，3，，4h).ThetechniquesabovewereusedtodetectNGFconcentrationinrabbitbloodanddatawereinputtedintocomputertoanalysisthepharmacokineticparameterbysoftware(3P87).ResultsThemetabolisminvivoconformsthedouble-compartmentsmodel.Withthedoseof40μg/kg，thepharmacokineticsparameterswereasthefollows：T1/2α=、T1/2β=、AUC=·h·ml－１。ConclusionThemarkof99mTChasbettereffectonpharmacokineticresearchofnervegrowthfactor.

【Keywords】99mTc-NGF；pharmacokinetics；TCA

神經(jīng)生長(zhǎng)因子是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中最重要的生物活性物質(zhì)，其對(duì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、再生和功能表達(dá)具有重要的調(diào)控作用。現(xiàn)階段其在應(yīng)用上已經(jīng)公認(rèn)對(duì)腦和脊髓損傷、早老性癡呆［1～3］、糖尿病周圍神經(jīng)性疾?。?］等有很好效果。發(fā)現(xiàn)者StanleyCohen和RitaLevi-Montalcini于1986年獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)［5］。有關(guān)NGF的血藥濃度檢測(cè)已有很多報(bào)道，但都比較復(fù)雜。本文將NGF用99mTc標(biāo)記，利用同位素示蹤法和TCA沉淀法測(cè)得NGF含量，從而初步研究NGF脂質(zhì)體在家兔體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)，以期為其他相關(guān)試驗(yàn)及今后的臨床應(yīng)用提供必要的參考資料。

1材料與方法

儀器與試劑

儀器GC-911γ射線計(jì)數(shù)儀；Ultrospec2000紫外分光光度儀(Pharmacia公司)；DFM-96多排放射免疫計(jì)數(shù)儀；FJ-391A1型活度儀；3P97軟件(江蘇省人民醫(yī)院藥劑科合作提供)；FA1004電子天平。

試劑小鼠頜下腺NGF；99mTcO4(北京原子高科核技術(shù)應(yīng)用股份有限公司)；亞錫；Kieselgel60F254硅膠板；檸檬酸緩沖液；三氯乙酸；SephadexG-25(南京森科醫(yī)藥公司提供)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用新西蘭兔(雌雄各半、，南京愛立默動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限公司)。

方法

同位素示蹤法與TCA沉淀法檢測(cè)血漿中微量NGF用放射性元素99mTc標(biāo)記NGF，對(duì)99mTc-NGF用TCA沉淀［6］，然后對(duì)沉淀物進(jìn)行γ計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，數(shù)值與NGF的含量存在線性關(guān)系，從而測(cè)定在血漿中微量NGF的濃度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備99mTc－NGF的制備：配制％亞錫－檸檬酸緩沖液。取NGF20ml、cit溶液100ml及配制的％Sn2＋-cit溶液20ml，將其置于小瓶中，充入氮?dú)?～5min，即制備完藥箱置于4℃冰箱待標(biāo)記時(shí)取出。加10mgVitC于cit溶液中，制備成10mg/mlVitC溶液；取出制備的藥箱，在其小瓶中加高锝酸(具體放射量根據(jù)需要)，然后加入配制的10mg/mlVitC溶液，混勻。即制備完99mTc－NGF。

樣品經(jīng)SephadexG-25凝膠柱分離純化，收集各組分，測(cè)量每管的γ計(jì)數(shù)，合并各峰收集組分并取出60μl，加考馬斯亮藍(lán)R-250染色，用紫外分光光度儀測(cè)定595nm處的吸光度，計(jì)算NGF的化學(xué)量。以收集99mTc-NGF峰的總放射性除以上樣層析時(shí)的總放射性，即得99mTc-NGF的標(biāo)記率。99mTc-NGF峰的總放射性除以該峰的總蛋白質(zhì)量，即得比活度。紙層析法測(cè)定99mTc-NGF的放化純度。

配制10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml及1000ng/ml99mTc-NGF溶液各1份，各吸取20ml于試管中，加150μl生理鹽水及30μl兔血清，加20％三氯乙酸200μl，5000rpm離心3min。去上清，測(cè)定各試管中沉淀物放射性計(jì)數(shù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程及回歸系數(shù)。

測(cè)定方法的確證通過檢測(cè)回收率及重復(fù)性試驗(yàn)研究證明該方法的可行性。(1)回收率的測(cè)定：配置99mTc-NGF濃度為250、500、750ng/ml各5份，然后按照上述方法測(cè)定實(shí)測(cè)99mTc-NGF的濃度；共進(jìn)行5次計(jì)算該方法及線性關(guān)系回收率。每次測(cè)定前同時(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品沉淀物的放射性計(jì)數(shù)并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線以去除核素衰變影響。(2)精確度的測(cè)定：配制成濃度為250、500、750ng/ml的99Tc-NGF樣品各5份，按照上述方法測(cè)定NGF濃度，每個(gè)濃度一天內(nèi)重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差；每天測(cè)定1次，連續(xù)5天測(cè)定，計(jì)算日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，測(cè)定當(dāng)日重新標(biāo)記和配制標(biāo)準(zhǔn)液。

實(shí)驗(yàn)方法操作當(dāng)日標(biāo)記99mTc－NGF，按上述方法測(cè)定放化純度和比活度。取5只等重健康家兔，靜脈注射NGF，劑量均為40mg/kg?？焖儆谝粋?cè)耳緣靜脈注射后，壓迫止血，立即于另外一側(cè)耳緣靜脈用采血針頭從近心端向遠(yuǎn)心端分別于30s、1min、3min、5min、10min、15min、30min、1h、、2h、、3h、及4h采血，采血時(shí)使用20ml定量毛細(xì)虹吸管吸取血樣，快速將血液加入內(nèi)有1ml生理鹽水的試管中，然后再加入20％三氯乙酸，5000rpm離心3min。去上清，沉淀物封口保存后待統(tǒng)一測(cè)定。

血藥濃度的測(cè)定待所有血樣和標(biāo)本采集完成后，配制10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml及1000ng/ml99mTc-NGF溶液各1份，各吸取20ml于試管中，按處理標(biāo)準(zhǔn)品后，沉淀物與處置后的待測(cè)樣本同時(shí)置于多樣本放射免疫計(jì)數(shù)儀中，測(cè)定各試管中放射性計(jì)數(shù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測(cè)定各血樣的放射性計(jì)數(shù)。將計(jì)數(shù)帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線即相應(yīng)的血藥濃度。

靜脈推注NGF在家兔體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的分析將所測(cè)定的NGF在家兔體內(nèi)不同時(shí)間的血藥濃度輸入計(jì)算機(jī)，用3P87軟件分析藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)及房室模型。

2結(jié)果

標(biāo)記率為%，比活度為30mCi/mg，放化純度99%。

配制10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml及1000ng/ml99mTc-NGF溶液各1份，各吸取20ml于試管中，加150μl生理鹽水及30μl兔血清，加20％三氯乙酸200μl，5000rpm離心3min。去上清，測(cè)定各試管中沉淀物放射性計(jì)數(shù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程及回歸系數(shù)。

經(jīng)測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=+(x值為NGF濃度)，R2＝。

將所測(cè)定血樣放射性計(jì)數(shù)經(jīng)曲線方程處理后得到相應(yīng)血藥濃度，血藥濃度經(jīng)3P87軟件分析后根據(jù)F檢驗(yàn)和AIC值選擇相應(yīng)房室模型為二室模

型為宜并得到藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果見表1。表1靜脈注射99mTc－NGF兔體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

注：n＝5

結(jié)果顯示：當(dāng)給藥劑量為40μg/kg時(shí)，NGF藥動(dòng)學(xué)參數(shù)為T1/2α=、T1/2β=、AUC=·h·ml－１。

3討論

檢測(cè)血液中NGF濃度常用方法有ELISA、HPLC等，這些方法靈敏度和精確度均較高，相關(guān)文獻(xiàn)很多，但是操作繁瑣，費(fèi)用較高，影響結(jié)果因素較多。本實(shí)驗(yàn)在選擇同位素示蹤法來檢測(cè)NGF血藥濃度，此方法通過放射性原理避免了對(duì)NGF的檢測(cè)方面的影響。

同位素示蹤常用核素有125I、99mTc等，125I半衰期長(zhǎng)較為穩(wěn)定，但標(biāo)記率很低，且對(duì)環(huán)境和同位素防護(hù)及處理要求非常高，因此在使用時(shí)收到很多限制；99mTc標(biāo)記率高［7］，同位素處理簡(jiǎn)單，對(duì)人員身體影響小，但半衰期短，對(duì)檢測(cè)時(shí)間要求相對(duì)較高。本實(shí)驗(yàn)中筆者通過99mTc標(biāo)記NGF，使用TCA沉淀法及同位素示蹤法進(jìn)行血液中微量NGF濃度檢測(cè)，通過藥代動(dòng)力學(xué)相關(guān)參數(shù)分析，證明靜脈注射NGF在小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)符合雙隔室模型，是一種很好的藥物代謝研究方法?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】

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3GustiloMC，AlicjaL，MarkowskaAL，etal.Evidencethatnervegrowthfactorinfluencesrecentmemorythroughstructuralchangesinseptohippocampalcholinergicneurons.JCo