石蠟包埋組織的DNA提取及影響因素

福爾馬林固定石蠟包埋組織DNA的提取及影響因素2012.12婁全博現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)越來(lái)越廣泛地被用于人類的疾病研究，為了解病理狀態(tài)下基因組DNA的變化積累了新資料。目前認(rèn)為，人類基因組并非人們想像的那樣穩(wěn)定，諸如基因重排、擴(kuò)增、缺失，突變和DNA甲基化類型改變等時(shí)有發(fā)生，這些改變對(duì)于基因表達(dá)和調(diào)控，以及疾病過(guò)程的發(fā)展等方面均具有重要意義。醫(yī)院病理科檔案中積存的大量石蠟包埋組織，是一個(gè)可靠的分子生物學(xué)研究的材料來(lái)源。在石蠟切片上進(jìn)行原位雜交或原位PCR分析的分子生物學(xué)方法，是免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的重要延伸。通過(guò)對(duì)DNA或mRNA分析亦可直接證實(shí)或補(bǔ)充免疫細(xì)胞化學(xué)的發(fā)現(xiàn)。Goelz(1985)成功地從蠟塊中提取出高質(zhì)量的DNA，完全可以滿足某些腫瘤分子生物學(xué)研究的需要，結(jié)束了DNA研究依賴于新鮮或冰凍組織細(xì)胞的歷史，而且可以廣泛地應(yīng)用于大宗病例的回顧性研究，對(duì)腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制的探討，診斷與鑒別診斷研究和患者預(yù)后評(píng)估等方面均具有重要價(jià)值。石蠟包埋組織DNA提取的流程圖組織包埋組織固定取材切片脫蠟消化提純組織包埋制作過(guò)程中的影響因素1.1福爾馬林固定福爾馬林固定液的主要成分：甲醛是最小的含氧有機(jī)物，具有較高的反應(yīng)活性，可以和帶有-OH（羥基）、-SH（巰基）、-NH2（氨基）的分子發(fā)生親核加成反應(yīng)，最終作為亞甲基(-CH2-)的提供者，與上述基團(tuán)中的兩個(gè)基團(tuán)反應(yīng)，使自由的分子鏈被交聯(lián)起來(lái)，從而發(fā)揮對(duì)組織固定的作用，同時(shí)也對(duì)DNA分子產(chǎn)生不利的影響。最早表現(xiàn)為DNA分子呈可逆性亞氨基和氨基的羥甲基化，隨固定時(shí)間延長(zhǎng)，生物大分子之間緩慢形成廣泛的亞甲基交聯(lián)橋，導(dǎo)致DNA鏈的脆性增加，在受到剪切力作用時(shí)，更容易發(fā)生隨機(jī)斷裂[1]。甲醛介導(dǎo)的DNA損傷，在固定3h后已發(fā)生。固定時(shí)間越長(zhǎng)，甲醛所致DNA損傷越嚴(yán)重，越不易從中獲得大片段DNA。相關(guān)文獻(xiàn)記載固定時(shí)間分別為3、7、16、32d且保存15年的包埋組織進(jìn)行研究的結(jié)果顯示，固定16d可成功獲取250bp左右的DNA片段，固定32d則僅能獲取100bp左右DNA片段[2]。甲醛除本身可造成DNA分子損傷外，其與氧化性物質(zhì)接觸后形成的甲酸，可改變環(huán)境pH，從而影響DNA分子穩(wěn)定性，使核酸中嘌呤基的β糖苷鍵容易發(fā)生水解而導(dǎo)致DNA鏈斷裂[3]。實(shí)驗(yàn)證明，中性緩沖型福爾馬林固定劑能有效中和甲醛氧化生成的甲酸，使環(huán)境pH得以穩(wěn)定，在所提取DNA的質(zhì)和量上都明顯優(yōu)于其他固定劑。1.2浸蠟與包埋用于組織包埋的固體石蠟為多種烴烷混合物，溶程為50℃～65℃，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在通常條件下不與酸性（除硝酸外）和堿性溶液發(fā)生作用。迄今尚無(wú)石蠟?zāi)苤苯訉?dǎo)致包埋組織中DNA降解的報(bào)道。但有文獻(xiàn)記載，在石蠟包埋過(guò)程中DNA更容易發(fā)生降解。其可能的機(jī)制是組織浸蠟與包埋時(shí)需要加熱到62℃左右，此時(shí)DNA部分解鏈，組織內(nèi)殘留的痕量甲醛可對(duì)解鏈后的DNA單鏈進(jìn)行甲基化修飾，修飾后的DNA單鏈在冷卻后不易復(fù)性而導(dǎo)致的降解[4]。另外，石蠟可阻礙消化液對(duì)組織的滲透，從而抑制蛋白酶K與組織內(nèi)蛋白的接觸，影響組織消化和DNA釋放。在DNA提取過(guò)程中，如未能有效去除石蠟，形成的DNA-石蠟混合液，不利于PCR擴(kuò)增[5]。1.3切片規(guī)格為保證包埋組織中提取的DNA量能夠滿足后續(xù)檢驗(yàn)的需求，可通過(guò)增加切片厚度或增加切片的張數(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。但切片過(guò)厚不利于組織脫蠟和蛋白酶消化，而切片過(guò)薄易造成DNA的機(jī)械損傷，同時(shí)切片總面積的增加，其表面黏附的PCR抑制因子將可能增多[6]。文獻(xiàn)中對(duì)比觀察切片厚度為2.5μm、5.0μm和10.0μm三種情況下進(jìn)行二甲苯脫蠟后，有機(jī)溶劑法提取DNA的質(zhì)量差異。三者比較，10.0μm切片DNA質(zhì)量最好，2.5μm切片提取的DNA在PCR擴(kuò)增后電泳，雖可見(jiàn)目的基因條帶，但條帶較淡，目的基因測(cè)序圖混亂，難以讀出堿基序列，效果遠(yuǎn)不如其他兩種情況[7]。DNA提取的預(yù)處理—脫蠟為消除石蠟對(duì)DNA提取和PCR擴(kuò)增的不良影響，必須在保證不增加外源性PCR抑制因子的和盡量減少DNA額外損傷的前提下對(duì)組織進(jìn)行徹底地脫蠟，這是與其他生物性檢材提取DNA過(guò)程的最大不同點(diǎn)。2.溉1有機(jī)純?nèi)軇┣缑撓炌卜ǘ滓虮绞蔷d被常鴨用于駐包埋廚組織竟脫蠟困的高戲效有足機(jī)溶樹(shù)劑。穗首先吼將石及蠟包葵埋的悔組織咬浸泡眉在二估甲苯史溶液駝中于艷室溫痛下脫獨(dú)蠟，刪一般階進(jìn)行顯兩次情，分頭別為2h和12烈h。然造后用杏梯度戲乙醇(1腸00厭%至70貸%)復(fù)水以，使賊組織符結(jié)構(gòu)大疏松,利于瘦消化藥液滲瓶入，遲同時(shí)概去除鉆組織牛中痕吹量的亡二甲渴苯和溪甲醛駐。待帝乙醇鴨自然餡揮發(fā)香后將壞組織叛浸泡符于消償化緩批沖液貨。根寫據(jù)需造要，嘆可適遍當(dāng)提娃高二壟甲苯竟脫蠟隔的溫尚度(4守8℃或65畜℃)、增遇加脫判蠟的體次數(shù)皮、延肢長(zhǎng)脫遮蠟或祖復(fù)水袋時(shí)間計(jì)等。凍該法具脫蠟尤比較重徹底床，利拾于組桿織消蜻化，鞏但是奸過(guò)多伴的操濕作步箱驟增育加了DN它A受污庸染的行可能票，亦器容易執(zhí)人為堂地造剩成DN嗽A機(jī)械捉性損詠傷，理并且伏需要嫂接觸濫有毒普物質(zhì)炕二甲目苯。2.黎2加熱厭脫蠟荒法通過(guò)驕加熱何使石眠蠟溶功解，械繼而麻從組數(shù)織中很分離溪出來(lái)斑的方是法，剖比較做省時(shí)昨省力霧，同造時(shí)也素避免感了接辟觸有招毒化劫學(xué)試悠劑。走但DN陰A受熱驚后不聾穩(wěn)定變，組擁織內(nèi)待釋放伴出的更一些凝金屬娃離子沸以及鉛核酸殺酶等視易對(duì)吉其造辯成損浸傷，值加熱個(gè)溫度矩越高首時(shí)間禿越長(zhǎng)母，DN遷A受損鑼則越孝嚴(yán)重?fù)АＡ肀仆?組織軋受熱炮不均,脫蠟雜有不予徹底附的可唐能。2.告2.啟1水浴漫加熱但脫蠟棒法將組親織樣閃本浸忽泡于繳生理益鹽水枝中，裕在接嫌近石械蠟熔旨點(diǎn)的崗溫度猾（65敲℃）下裁水浴隙，重橫復(fù)1次～2次，虜可達(dá)緒到去器除石筆蠟的粱目的悅。有裁研究統(tǒng)表明擴(kuò)，水徒浴加他熱時(shí)煮間與躲大片狂段DN珠A檢出煎率成等反比,建議較采用65眠℃水浴10翅m視in效果訊較好[8章]。也驕有研航究提寺出用TE霸S液（10救m播mo顫l昆Tr濟(jì)is跨-H晨Cl、1促mm均ol喬E醬DT庫(kù)A、0.貸5%纏S卷DS）代弓替生創(chuàng)理鹽步水進(jìn)搖行水擔(dān)浴加假熱脫智蠟,能有逗效提傲高DN葛A的產(chǎn)封量和腦質(zhì)量[9體]。2.黨2.歪2微波溝加熱芽脫蠟塞法將裝埋有組嘗織切率片的蘿離心朽管中倒加入括消化偷緩沖懼液(5溜0體mm絲式ol形/L攝T砌ri抓s，1境mm營(yíng)ol逼/L土E械DT絲式A，0.械5%喉T滔we恐en更20追p棉H斯8.口5)，密懂封后扭，置降于微禿波爐吵中加俯熱2m忙in（時(shí)細(xì)間長(zhǎng)桂短視拍石蠟秩而定錘），絡(luò)利用購(gòu)電磁亡波的菊穿透植力，疑對(duì)組味織進(jìn)鋒行深困層加恢熱，偉可在解短時(shí)甩間內(nèi)呢對(duì)組件織進(jìn)惕行比任較徹萌底地發(fā)脫蠟[1督0]。該倒法與慮傳統(tǒng)疤的二封甲苯字脫蠟日法相仿比，俊具有刷高產(chǎn)睬量提塌取，廟高效寬率擴(kuò)酸增的常優(yōu)勢(shì)護(hù)，而肆且具拜有操騾作簡(jiǎn)寫單、枝實(shí)驗(yàn)蛛消耗扛少、辜污染炒危險(xiǎn)位性小宇等優(yōu)頂點(diǎn)，熔是一娃種值裁得提印倡的宿方法稻。包埋奇組織蜘中D熊NA唇提取郊的注丟意事雅項(xiàng)3.箏1薄蛋白菊酶K抱的消竭化作幫用3.逆1.蛾1酶用濃度適當(dāng)匙地增闊加蛋攜白酶爽K濃指度和爸延長(zhǎng)凝消化挺時(shí)間鄰將有足利于柿組織剪消化慚和D割NA右的釋醫(yī)放。對(duì)通過(guò)撕比較肌不同快濃度令蛋白眠酶K（0.辟5mg抽/m目L，1.脅0mg孔/m臭L和爬4.樂(lè)0墨mg倍/m刊L）對(duì)包埋吐組織的消閑化效潔果后葵發(fā)現(xiàn)水，消崖化液她中蛋勝白酶員K濃沈度越課高，伸消化墻時(shí)間齒越長(zhǎng)域獲取診的D犬NA幸量越駁多。勇然而笨，隨另著蛋乖白酶煎K濃代度的摘升高控，提淺取的概DN蹄A數(shù)揪量雖協(xié)然增奪多，歉但質(zhì)惡量反落而有追所下抹降，港對(duì)較候大D厭NA渴片憂段（銜大于剃20秤0b量p）進(jìn)行故PC火R擴(kuò)模增的王成功相率也碼下降讀，其挽原因肚不明[11]。3.礎(chǔ)1.捕2消化權(quán)溫度蛋白踢酶K的最左佳工幕作溫俗度是56游℃,溫度替過(guò)低笨不利充于發(fā)才揮蛋狀白酶K活性討，過(guò)態(tài)高則撤不利摩于保浙護(hù)DN峰A的完姥整性洪，故徹新鮮誼組織漏與冰收凍組車織通標(biāo)常選善擇37少℃下消歌化過(guò)副夜。遞研究乞表明37觀℃和56座℃兩個(gè)銳溫度夠下蛋清白酶K消化仙包埋正組織頂?shù)男г使M(jìn)圖行了典比較貪，發(fā)敗現(xiàn)56躬℃消化港不僅盟可獲就得較光多量辟的DN嶄A，而集且可披產(chǎn)生途高質(zhì)角量的DN曠A[1它2]。3.豆1.利3消化浙緩沖蘆液的托離子唯強(qiáng)度在高輕離子僑強(qiáng)度守的環(huán)如境下增，生秤物大仆分子浩鏈趨止于高緩度螺屑旋收酸縮狀綱態(tài)，喝因此村，甲面醛介針導(dǎo)的DN筍A與核夾蛋白忠之間撿的交惡聯(lián)結(jié)損構(gòu)，張?jiān)谥匈|(zhì)、高粥離子答強(qiáng)度注下將確得以腰穩(wěn)定跡存在蛾。反死之，乎采用專低離徐子強(qiáng)綠度的蓮消化高緩沖辛液將踏利于敢舒展?fàn)I其分城子結(jié)行構(gòu)，張從而側(cè)促進(jìn)懂蛋白恭酶的槐消化壇作用落。3.施2選擇瘦合適斜的DN輔A提取階方法DN蛾A分子墻因受討甲醛馬作用辨脆性護(hù)增加零，受際機(jī)械全剪切鵝力作付用后茂容易塊發(fā)生豆斷裂襲。因蔽此，紡提取DN搶A過(guò)程煩中，屆應(yīng)當(dāng)?shù)辣苊庀蓜×医┱袷幉：瓦^(guò)胡高的炎溫度其，盡痰量減額少提氣取過(guò)按程中仔的操顆作步搜驟，框以減耐少對(duì)DN納A分子初的額班外損降傷。梢包埋剪組織潔中DN醋A提取翅方法穗主要叼分為甘兩類趣。一妻類是故基于猾蛋白詠酶K消化才的DN密A提取安方法,其中互有機(jī)近溶劑哈法提俘取的DN翼A在純地度上杯有著死明顯絡(luò)的優(yōu)疼越性堆，但集其實(shí)乘驗(yàn)過(guò)島程中驗(yàn)需多哨次移在管、提震搖閘和離凡心操富作，條既容趣易加倍重DN同A的機(jī)吵械損票傷，蠅又容漂易導(dǎo)寺致外喚來(lái)PC廁R抑制輕物的禍污染證。氯化燦鈉鹽壘析法司是通塊過(guò)在甘包埋淹組織信經(jīng)蛋奴白酶K消化華后的討溶液慮中加紅入高馬濃度園鹽溶泥液（水等體嚴(yán)積3爸mo衛(wèi)l/刮L的Na替Cl溶液顧），愁破壞膽蛋白偷質(zhì)在西水中汗的穩(wěn)貓定性叛因素惕而達(dá)防到沉殿淀的赤目的忙，其浙實(shí)驗(yàn)絨過(guò)程鞭簡(jiǎn)便斥快捷亂、造汽價(jià)低概廉、萍無(wú)須克接觸打有毒捎化學(xué)再試劑狂，而DN端A產(chǎn)量刮和PC碗R分型史成功羨率與誦前者忌效果課相當(dāng)搜。另一碎類是把基于棚水煮曬加熱揮的一爺步提蹦取法臨，在般水煮親液中究加入爭(zhēng)終濃尖度10佩%的Ch里el辭ex兩-1游00或終墻濃度1%的Tr過(guò)it粗onx-1膜00。Ch糊el狐ex固-1咳00是一歲種由煤聚乙售烯乙田二烯京苯組懷成的同螯合東基團(tuán)均，能聚螯合宜包埋蘋組織柿在高程溫裂道解后怖釋放辱的內(nèi)欺源性貸二價(jià)底金屬部離子嫁，如Mg2+、Ca2+等,從而導(dǎo)阻止狐其在更高溫慘下與流斷裂DN舞A的作預(yù)用;更Tr凱it雨onx-1葬00則是克一種且強(qiáng)的休非離委子表銀面活怖性劑決，能淡促進(jìn)余蛋白鼻成份擾變性剖溶解要。3.般3去除PC輔R抑制木因子包埋撓組織鴨提取DN褲A中存含在著冠一些杠不能增通過(guò)如蛋白陰酶K消化輪和有艷機(jī)萃軟取法聚去除景的PC晚R反應(yīng)樓抑制敵因子酸，隨嫂包埋血組織油取量澇的增肺加,其抑坊制效郵果越你明顯[1聰3]。例喜如，起包埋拳組織壞中DN粥A嚴(yán)重搭降解育后出籌現(xiàn)的刮大量熟寡核樓苷酸憂碎片巷，在PC涂R擴(kuò)增緩時(shí)，鞋可競(jìng)籮爭(zhēng)性旺結(jié)合狠反應(yīng)目體系至中的Mg2+，降錄低Mg2+的有德效濃漸度，決從而配降低DN易A聚摩合酶酶的量活性爬，同奶時(shí)還惕可干折擾引易物與土模板秧的結(jié)屈合而搶降低PC勤R擴(kuò)增語(yǔ)效率半。采增用凝喝膠層蝦析技肥術(shù)可專以有潔效地合去除燥寡核脈苷酸晌片段枕的影假響總而在言之根，包痰埋組掛織中DN掘A的提奧取和PC唇R的擴(kuò)箱增比甘較困失難，捷影響卷因素仙頗多惹，研慰究還弦不是攤十分儉透徹讀。上跨述各洞種方富法雖滴各具諸針對(duì)疼性，模但是紡基于監(jiān)效率練、衛(wèi)蜘生、插經(jīng)濟(jì)搜，尤叨其實(shí)恩驗(yàn)穩(wěn)踢定性慨的考踏慮，暑都不賴很理透想。但對(duì)于彩包埋牲組織向中客洽觀存達(dá)在的PC磚R擴(kuò)增輪抑制隙因子徒的研儲(chǔ)究并茂不明衣朗，30鑼0b枯p以上DN歡A片段插的提存取和PC智R擴(kuò)增筐的成招功率繼非常賤低,爆50廟0b娛p以上坦片段恰的成第功率喂則是短偶有樣報(bào)道[1籃2]，這宗很難燈滿足繪醫(yī)學(xué)聚科研傻需要左。因尤此，援建立捷一種扇實(shí)用殺、有銀效的表從包綠埋組助織中賓提取DN徐A的方擺法，做合理孟調(diào)整喝制定PC后R擴(kuò)增匪對(duì)策弊等問(wèn)組題,還將播有待霉進(jìn)一處步深疫入的歡研究談。[參考喘文獻(xiàn)][1撓]培Mi惜es握C壯,冷Ho聯(lián)ul雀ds顏wo那rt然h賄J,煌C啦ha爛ga磨nt悉i贊RS碎.產(chǎn)Ex械tr姜ac笛ti櫻on辰o雄f散DN打A棚fr煤om余p扛ar揚(yáng)af姥fi蜓n望bl和oc馬ks鳳f養(yǎng)or傳S層ou帳th落er代n馬bl蠅ot獻(xiàn)a羨na吉ly恭si沒(méi)s牙[J膠].仆A蔽m懂J遇Su惱rg貧P侵at銅ho蔑l,古1籮99距1,哈15壟(2謹(jǐn)):雄16特9-啦17鍬4.[2誦]淡Le熄gr叉an嘗d拳B,頭M釣az不an狼co娃ur蕉t榮P,資D杠ur頌ig燦on乎M改,茄et孝a汁l.躺D斯NA沙ge單no世ty司pi愁ng借o罪f浴un產(chǎn)bu您ff而er宣ed開(kāi)f冰or接ma喂li餃n手fi蓬xe勵(lì)d萌pa棉r(nóng)a州ff跡in釀e銹m-捧be仆dd奪ed捏t冠is擠su森es仿[J毫].節(jié)F挨or攀en品si瀉c惕Sc煤i喜In館t,胞20著02鉗,1記25河:2侮05集-2妄11吳.[3藥]率V怪Zs策ik棵la深,失Ba鋼um謠an前n議M,匙C段at驅(qū)ho粒ma松s材G.摩E棟ff無(wú)ec舊t桐of覽b鵝uf袍fe嗓re餓df碎or齒ma賓li弦n欄on詠a施mp卷li軋fi丙ca毀ti躁on厘o球f唯DN雹A翁fr齡om督p榨ar襖af乓fi塌n扔wa鈔xe草mb臘ed汽de輸d免sm恩al嗎l譽(yù)bi孕op墳si成es米u(yù)漢si煩ng奇r醒ea福l-被ti余me奮P懂CR攀[碼J]知.銅Cl寒in漂Pa暑th稿ol代,2嶄00倆4,較57精:6億54洲-6辰56潔.[4]旱Mo傭er擺ke忌rk志P深T,被K戲es爸se租ls復(fù)H膝J,惑T伶en夾K最at滿e靜J,鋼e談t肚al馳.乒So策ut濃he刑rn周an著d債do稼t僻bl頃ot尾a杏na綢ly克si至s模of膽D挽NA身f涌ro神m妻fo效rm檔al無(wú)in穩(wěn)-e樹(shù)mb頂ed擺de鑒d利ti棵ss釀ue內(nèi)s穴am仇pl琴es穴f咐ro衡m橋co建lo烤ni嗎c襪ca架rc貸in嫌om浸as懶[炎J]璃.泊Vi敵rc悔ho毯ws色A震rc匆hB本Ce涌ll葉P饅at紗ho門l步In定cl醋M披olPa烘th勿ol匪,1子99相0,點(diǎn)58機(jī)(5癢):壞35機(jī)1-宿35繳5.[5]吉Lo度nn刷U圾,冊(cè)Lo渠nn疲S啟,Ni狹ls追so腦n角B,巖e娃t飽al邪.De暴mo鋤ns胳tr畢at坡io買n醬of挑ge葵ne索am縣pl億if無(wú)ic柿a-ti芒on秘b瓜y禮PC礎(chǔ)R趴in同a步rc歪hi裹va何l僵pa島ra錘ff輸in董em斗be稈dd繪ed云b舉re僑as能t宅ca釘nc箭er縮慧t群is豆su譯e為[J摔].示B吹re幕as堵t瞧Ca朋nc耀erRe垃sT殖re永at剪,1央99洗4,乖30縣(2志):14碎7-搬15伙2.[6釋]怠Le乖gr脊an盛d痰B,繭M全az毛an射co虎ur莖t吃P,狹D吳ur簽ig愿on懸M傳,滿et承a礎(chǔ)l.硬D緣瑞NA矩g梁en沈ot舒yp饞in重g零of宵u編nb游uf查fe紛re卸d叛fo朽rm坦al騰in狼f脖ix蔽ed怨p忘ar駛af盒fi劇n絕em廚-b駕ed嫂de料d蔑ti李ss趨ue亭s[嗎J]櫻.錢Fo頌re畫ns客ic寇S黃ci響I縱nt火,2疑00盲2,底12恭5:滋20山5-雅21想1.[7]養(yǎng)蓋寶償東,目房鏟學(xué)東顧,餐金仲獸田.腦提晉高石槐蠟包柱埋組震織中序提取茅DN藍(lán)A質(zhì)哲量的稠實(shí)驗(yàn)面研究氏[J允].吉林益大學(xué)贈(zèng)學(xué)報(bào)穴(醫(yī)巾學(xué)版犧),桐20埋03后,2乏9(孤1)鋤:1這15倆-1娛18維.[8]骨周毅崖,驢嚴(yán)紅強(qiáng),慮李萬(wàn)貨水,捏等燭.鍛石蠟嬌包埋果人體珍組織口DN繼A分勢(shì)型的晌研究籍[J師].挖刑宜事技脊術(shù),澆20亮03刻,4龜:1合7-及18驢.[9]劉德華莉.公一明種石幼蠟包殃埋組秧織D糟NA輸提取俘方法火[J遮].罵上取海醫(yī)頑學(xué)檢分驗(yàn)雜志,2依00昏0,恒15逮(2儉):蘆12舊8.[10]補(bǔ)Sa腐to長(zhǎng)Y濫,遭Su蘇gi歐e勢(shì)R,啊T累su病ch活iy彼a立B,疑e屑t靈al渾.技Co財(cái)mp父ar俘is脫on烘o幻玉f餡th竹e師DN偏Aex萬(wàn)tr殿ac淺ti泥on界m叼et剩ho為ds改f棚or裂p神ol吉ym叨er縫as擦e仁ch糧ai腥n斷re成ac當(dāng)ti育on頂a睛mp燃li返fi勢(shì)ca顫ti當(dāng)on秀f假ro籃m冊(cè)fo站rm述al驚in卵f搜ix瘡ed囑a修nd膊p個(gè)ar宜af謝fi偷n半em會(huì)be抗dd絞ed駱t拉is膚su累es獻(xiàn)[勝J]兄.津Di段ag焦n缸Mo隊(duì)lPa艷th敘