探討聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR

探討聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR一、PCR歷史PCR的最早設(shè)想：核酸研究已有100多年的歷史，本世紀(jì)6070年代初人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)，Korana于1971年最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：“DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過(guò)程便可克隆tRNA基因”。PCR的實(shí)現(xiàn)：1985PE-CetusKaryMullis等發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提供以致一種合適的條件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時(shí)間。PCR的改進(jìn)與完善：Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺點(diǎn)是：①Klenow酶不耐高溫，90℃會(huì)變性失活，每次循環(huán)都要重新加。②引物鏈延伸反應(yīng)在37℃下進(jìn)行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯(cuò)配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術(shù)雖較傳統(tǒng)的基因擴(kuò)增具備許多突出的優(yōu)點(diǎn)，但由于Klenow酶不耐熱，在DNA模板進(jìn)行熱變性時(shí)，會(huì)導(dǎo)致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)周期，給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得PCR技術(shù)在一段時(shí)間內(nèi)沒(méi)能引起足夠重視。

1987年KaryMullis等完成了自動(dòng)化操作裝置，使PCR技術(shù)進(jìn)行實(shí)用階段。

1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增的DNA片段很均一，真實(shí)性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。PCR的突破：1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermusaquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點(diǎn)：①耐高溫，在70℃下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來(lái)的90%，在93℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來(lái)的60%，在95℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來(lái)的40%。②在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。③大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增長(zhǎng)度(2.0Kb)。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶IKlenow片段區(qū)別，將此酶命名為TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR使PCR自動(dòng)化成為可能。PCR的確認(rèn)：1993年度，KaryMullis因發(fā)明了“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”而獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。20世紀(jì)80年代末，PCR技術(shù)成為遺傳和分子分析的重要技術(shù)。多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)：是一種對(duì)特定的DNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的方法。二、PCR的特點(diǎn)及應(yīng)用：PCR操作簡(jiǎn)便、省時(shí)；靈敏度高；對(duì)原始材料的質(zhì)和量要求低；特異性強(qiáng)。因此，廣泛應(yīng)用于許多領(lǐng)域?；蚩寺〖岸?、擴(kuò)增特異性片段用于探針、體外獲得突變體、提供大量DNA用于測(cè)序等；遺傳病的產(chǎn)前診斷；致病病原體的檢測(cè)；癌基因的檢測(cè)和診斷；DNA指紋、個(gè)體識(shí)別、親子關(guān)系鑒別及法醫(yī)物證；動(dòng)、植物檢疫；在轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物中檢查植入基因的存在。二、PCR反應(yīng)系統(tǒng)的組成PCR反應(yīng)系統(tǒng)的組成主要包括：引物、寡核苷酸、TaqDNA聚合酶、模板DNA、緩沖液。1、引物：要擴(kuò)增模板DNA，首先要設(shè)計(jì)兩條寡核苷酸引物,實(shí)際上就是兩段與待擴(kuò)增靶DNA序列互補(bǔ)的寡核苷酸片段。兩引物間距離決定擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度。兩引物的5’端決定擴(kuò)增產(chǎn)物的兩個(gè)5’末端位置。引物是決定PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度、位置和結(jié)果的關(guān)鍵。引物設(shè)計(jì)十分重要。PrimerIPrimerIIAmplifiedtargetfragment（1）、引物的設(shè)計(jì)：長(zhǎng)度最高不超過(guò)30個(gè)核苷酸，最佳長(zhǎng)度為15～25個(gè)核苷酸。有時(shí)可在5’端添加不與模板互補(bǔ)的序列，如限制性酶切位點(diǎn)或增強(qiáng)因子等，以完成基因克隆和其它特殊需要，但要在酶切位點(diǎn)的5‘端加上額外的3－4個(gè)核苷酸，以確保附加的酶切位點(diǎn)有效。兩個(gè)引物之間不應(yīng)發(fā)生互補(bǔ)，特別是在引物3’端，即使無(wú)法避免，其3’端互補(bǔ)堿基也不應(yīng)大于2個(gè)堿基，否則易生成“引物二聚體”或“引物二倍體”（Primerdimer）。(G+C）%含量：引物的組成應(yīng)均勻，盡量避免含有相同的堿基多聚體，45%-55%為宜。G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。兩個(gè)引物中（G+C）%含量應(yīng)盡量相似。引物內(nèi)部應(yīng)避免內(nèi)部形成明顯的次級(jí)結(jié)構(gòu)，尤其是發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpinstructures）。5、Tm

值高于55C

。Tm允許的范圍內(nèi)選擇較高的退火溫度可大大減少引物和模板的非特異性結(jié)合，提高PCR的特異性。6、引物3’端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)。7、引物擴(kuò)增跨度以300-500堿基為宜。8、引物的特定性，引物應(yīng)與核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列物有明顯同源性。（2）、引物的濃度：

引物在PCR反應(yīng)中的濃度一般在～1μM（或10～100pmol）之間。濃度過(guò)高易形成引物二聚體且產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。一般來(lái)說(shuō)用低濃度引物經(jīng)濟(jì)、特異，但濃度過(guò)低，不足以完成30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)，則會(huì)降低PCR的產(chǎn)率。（3）引物退火溫度決定PCR特異性與產(chǎn)量；溫度高特異性強(qiáng)，但過(guò)高則引物不能與模板牢固結(jié)合，DNA擴(kuò)增效率下降；溫度低產(chǎn)量高，但過(guò)低可造成引物與模板錯(cuò)配，非特異性產(chǎn)物增加。一般實(shí)驗(yàn)中退火溫度Ta(annealingtemperature)比擴(kuò)增引物的融解溫度Tm(meltingtemperature)低5℃，可按公式進(jìn)行粗略計(jì)算：Ta=Tm-5℃=4(G+C)+2(A+T)-5℃其中A，T，G，C分別表示相應(yīng)堿基的個(gè)數(shù)。在典型的引物濃度時(shí)（如）,退火反應(yīng)數(shù)秒即可完成。（4）、引物延伸溫度取決于DNA聚合酶的最適溫度。一般取70～75℃，在72℃時(shí)酶催化核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)速率可達(dá)35～100個(gè)核苷酸/秒。每分鐘可延伸1kb的長(zhǎng)度，其速度取決于緩沖溶液的組成、pH值、鹽濃度與DNA模板的性質(zhì)。根據(jù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度的不同來(lái)設(shè)計(jì)引物延伸的溫度。對(duì)于1kb以上的DNA片段，可根據(jù)片段長(zhǎng)度將延伸時(shí)間控制在1～7min。2、寡核苷酸（dNTP）（1）、dNTP的質(zhì)量與濃度

dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1MNaOH或1MTrisHCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到～，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。（2）、dNTP與PCR反應(yīng)在PCR反體系中,dNTP終濃度高于50mM會(huì)抑制Taq酶的活性。使用低濃度dNTP可以減少在非靶位置啟動(dòng)和延伸時(shí)核苷酸錯(cuò)誤摻入。高濃度dNTPs易產(chǎn)生錯(cuò)誤摻入，而濃度太低，勢(shì)必降低反應(yīng)物的產(chǎn)量。

PCR常用的濃度為50～200μM，不能低于10～15μM。尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過(guò)低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量，或過(guò)早終止反應(yīng)。TaqDNA聚合酶最早是從嗜熱水生菌中提純出來(lái)的。催化一典型的PCR所用酶量為2U。常用范圍為1～4U/100μl。由于DNA模板的不同和引物不同，以及其它條件的差異，聚合酶的用量亦有差異，酶量過(guò)多會(huì)導(dǎo)致非特異產(chǎn)物的增加。3、TaqDNA聚合酶:Taq酶的活性單位定義（Takara公司）：用活性化的大馬哈魚DNA作為模板/引物，在740C、30分鐘內(nèi)，攝入10nM的全核苷酸為酸性不溶物的活性定義為一個(gè)活性單位。（1）、模板的種類：?jiǎn)?、雙鏈DNA或RNA都可以作為PCR的樣品。若起始材料是RNA，須先通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄得到第一條cDNA。用質(zhì)粒作模板時(shí)，線性化的比環(huán)狀的效果好，但在實(shí)際操作中，往往不需要將質(zhì)粒線性化，而直接用做模板。當(dāng)使用高分子量的DNA（如基因組DNA）做模板時(shí)，如果用適當(dāng)?shù)拿赶冗M(jìn)行消化再作為模板，擴(kuò)增效果會(huì)更好。4、模板(靶基因)核酸（2）、模板的用量雖然PCR可以僅用極微量的樣品，甚至是來(lái)自單一細(xì)胞的DNA，但為了保證反應(yīng)的特異性，還應(yīng)用ng級(jí)的DNA。（3）、模板變性溫度它決定PCR反應(yīng)中雙鏈DNA解鏈的溫度，達(dá)不到變性溫度就不會(huì)產(chǎn)生單鏈DNA模板，PCR也就不會(huì)啟動(dòng)。變性溫度低則變性不完全，DNA雙鏈會(huì)很快復(fù)性，因而減少產(chǎn)量。一般取90～95℃。樣品一旦到達(dá)此溫度宜迅速冷卻到退火溫度。DNA變性只需要幾秒種，不需要時(shí)間過(guò)久；反之，在高溫時(shí)間應(yīng)盡量縮短，以保持DNA聚合酶的活力。加入TaqDNA聚合酶后最高變性溫度不宜超過(guò)95℃。（4）、模板核酸的量與純度它PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS處理標(biāo)本。SDS的主要功能是：溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；用乙醇或異丙醇沉淀核酸。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。5、Mg2+濃度

Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響。在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為～為宜。Mg2+濃度過(guò)高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低會(huì)降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。6、PCR緩沖液:用于PCR的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液為10～50mM的Tris–HCl緩沖液（）和1.5mMMgCl。在72℃時(shí)，反應(yīng)體系的pH值將下降1個(gè)單位，接近于。二價(jià)陽(yáng)離子的存在至關(guān)重要，影響PCR的特異性和產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)表明，Mg2+優(yōu)于Mn2+，而Ca2+無(wú)任何作用。首次使用靶序列和引物結(jié)合時(shí)，都要把Mg2+濃度調(diào)到最佳，其濃度變化范圍為1～10mmol/L。7、PCR循環(huán)次數(shù)常規(guī)PCR循環(huán)次數(shù)一般為25～40個(gè)周期。一般是循環(huán)次數(shù)過(guò)多，非特異性背景嚴(yán)重，復(fù)雜度增加。當(dāng)然循環(huán)反應(yīng)的次數(shù)太少，則產(chǎn)率偏低。所以，在保證產(chǎn)物得率前提下，應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。三、PCR擴(kuò)增過(guò)程

在微量離心管中加入適量緩沖液、微量模板DNA、四種脫氧單核苷酸（dNTP）和耐熱Taq聚合酶及兩個(gè)合成DNA引物，并有Mg2+存在。其循環(huán)的溫度取決于引物的Tm值、模板的種類以及聚合酶的耐熱性。(1)變性階段加熱使模板DNA在高溫下（90℃-95）變性，雙鏈解鏈；(2)退火階段降低溶液溫度，使合成引物在低溫（35－65℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），與模板DNA互補(bǔ)退火形成部分雙鏈；(3)延伸階段溶液反應(yīng)溫度升至中溫(72℃)，在Taq酶作用下，以dNTP為原料，引物為復(fù)制起點(diǎn)，模板DNA的一條雙鏈在解鏈和退火之后延伸為兩條雙鏈。PCR

原理類似于DNA的變性和復(fù)性過(guò)程，即在高溫（93-95℃）下，待擴(kuò)增的靶DNA雙鏈?zhǔn)軣嶙冃猿蔀閮蓷l單鏈DNA模板；而后在低溫（37～65℃）情況下，兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補(bǔ)的單鏈DNA模板結(jié)合，形成部分雙鏈；在Taq酶的最適溫度（72℃）下，以引物3’端為合成的起點(diǎn)，以單核苷酸為原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新鏈。這樣，每一雙鏈的DNA模板，經(jīng)過(guò)一次解鏈、退火、延伸三個(gè)步驟的熱循環(huán)后就成了兩條雙鏈DNA分子。如此反復(fù)進(jìn)行，每一次循環(huán)所產(chǎn)生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板，每一次循環(huán)都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區(qū)拷貝數(shù)擴(kuò)增一倍，PCR產(chǎn)物得以2n的批數(shù)形式迅速擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)25～30個(gè)循環(huán)后，理論上可使基因擴(kuò)增109倍以上，實(shí)際上一般可達(dá)106～107倍。PCR儀、臺(tái)式離心機(jī)、滅菌的微量離心管、凝膠電泳系統(tǒng)等TaKaRaTaq(5U/l)10XPCRBuffer(Mg2+Plus)dNTPMixture(each10mMor2.5mM)模板(10ng，實(shí)驗(yàn)1自提質(zhì)粒)引物（Primer1and2,10M)四、實(shí)驗(yàn)儀器及材料10xPCRBuffer：(100mMTris-HCl,pH8.3,500mMKCl,15mMMgCl2)InsertEcoR1Xho11.9kbpCMV-Myc-T10Primer1(FrompCMV-Myc827-847):5’TTCC

AAGCTTCACCATGGCATCAATGCAGAAGC保護(hù)性堿基

HindIIIMyctagTm=4（G＋C）＋2（A＋T）＝4×12＋2×11＝700C.Primer2(FromT101249-1270):5’TCGC

GGATCCAGTGGCATCAGAGACTTGCTAATC保護(hù)性堿基BamHITm=4（G＋C）＋2（A＋T）＝4×11＋2×13＝700C.PCRMixture:TemplateDNA:1l(10ng)Primer1:1l(10M)Primer2:1l(10M)dNTPs:4mM)TaqDNApolymerase:0.5l(5U/l)10×buffer（Mg+）:5ll

50lPCR條件：

94℃變性5min后開始以下循環(huán)

94℃變性反應(yīng)45sec；

65℃退火反應(yīng)45sec；

72℃延伸反應(yīng)1min；進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃反應(yīng)7min；

4℃冷卻恒定。五、PCR產(chǎn)物分析取3-5lPCR產(chǎn)物，采用％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物的量、引物擴(kuò)增的特異性。并可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DNA的量粗略計(jì)算PCR產(chǎn)物的總量。PCR結(jié)果：DNAMarkerPCRproduct六、PCR污染與對(duì)策（一）、污染原因

1、標(biāo)本間交叉污染:收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時(shí)，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染;標(biāo)本核酸模板在提取過(guò)程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染;有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染.

2、PCR試劑的污染:

主要是由于在PCR試劑配制過(guò)程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.

3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染（1）、PCR產(chǎn)物拷貝量大(一般為1013拷貝/ml)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可造成假陽(yáng)就可形成假陽(yáng)性.（2）、氣溶膠污染。在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染.據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆?？珊?8000拷貝，因而由其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問(wèn)題.

4、實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過(guò)程中需用較多的用具及試劑，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖的簡(jiǎn)便性及具有很強(qiáng)的生命力.其污染可能性也很大.（二）、防止污染的方法

1、合理分隔實(shí)驗(yàn)室:最好能劃分①標(biāo)本處理區(qū);②PCR反應(yīng)液制備區(qū);③PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū);④PCR產(chǎn)物鑒定區(qū).實(shí)驗(yàn)用品及吸樣槍應(yīng)專用.實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA.

2、吸樣槍:由于操作時(shí)不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個(gè)嚴(yán)重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時(shí)要十分小心，吸樣要慢，吸樣時(shí)盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染.

3、預(yù)混和分裝PCR試劑:所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝，如有可能，PCR反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好，然后小量分裝，-20℃保存.以減少重復(fù)加樣次數(shù)，避免污染機(jī)會(huì).另外，PCR試劑，PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱.

4、防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應(yīng)一次性使用.

5、設(shè)立適當(dāng)?shù)年?yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照以能出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的最低量的標(biāo)準(zhǔn)病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應(yīng)都應(yīng)有一管不加模板的試劑對(duì)照及相應(yīng)不含有被擴(kuò)增核酸的樣品作陰性對(duì)照.

6、減少PCR循環(huán)次數(shù)，只要PCR產(chǎn)物達(dá)到檢測(cè)水平就適可而止.

7、選擇質(zhì)量好的Eppendorf管，以避免樣本外溢及外來(lái)核酸的進(jìn)入，打開離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部.開管動(dòng)作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。

七、熒光定量PCR

熒光定量PCR（也稱TaqManPCR,以下簡(jiǎn)稱FQ-PCR）是美國(guó)PE（PerkinElmer）公司1995年研制出來(lái)的一種新的核酸定量技術(shù)，該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針來(lái)實(shí)現(xiàn)其定量功能的，與變通PCR相比，F(xiàn)Q-PCR具有許多優(yōu)點(diǎn)。（一）、熒光定量PCR技術(shù)定義是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。二、熒光定量PCR原理1.

Ct值的定義在熒光定量PCR技術(shù)中，有一個(gè)很重要的概念——Ct值。C代表Cycle，t代表threshold（域值），Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。故必須確定Ct值。

2.

熒光域值（threshold）的設(shè)定

PCR反應(yīng)的前15個(gè)