過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定方法及試劑配制

過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定方法及試劑配制1.引言過(guò)氧化物酶（peroxidase,POD）和過(guò)氧化氫酶（catalase,CAT）是常見(jiàn)的酶類(lèi)，在生物醫(yī)學(xué)、食品科學(xué)、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用。本文將介紹過(guò)氧化物酶及過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定方法，以及試劑的配制。2.過(guò)氧化物酶活性測(cè)定方法2.1.原理過(guò)氧化物酶的催化作用是通過(guò)氧化還原反應(yīng)完成的，其催化底物通常為一種含氫過(guò)氧基的化合物，如過(guò)氧化物、酚類(lèi)、芳香胺等。測(cè)定過(guò)氧化物酶活性的常見(jiàn)方法是用氫過(guò)氧化物（H2O2）作為底物，測(cè)定其催化下產(chǎn)生的過(guò)氧化氫（HO·）析出量或吸光度的變化。2.2.測(cè)定步驟（1）提取樣品：將待測(cè)樣品（如組織、血液、尿液等）使用適當(dāng)?shù)木彌_液（如苯甲酸/磷酸緩沖液）混合均勻，并離心沉淀，去除上清液。（2）制備反應(yīng)液：將適量的苯酚/過(guò)氧化氫緩沖液（如0.05mol/L，pH7.0）加入適量的待測(cè)樣品中，混勻后即形成反應(yīng)液。（3）開(kāi)始反應(yīng)：將反應(yīng)液加入含過(guò)氧化氫酶的培養(yǎng)基中，反應(yīng)10~20分鐘。其產(chǎn)生的HO·會(huì)與某些離子或某些化學(xué)物質(zhì)起反應(yīng)，使其變色。將反應(yīng)液在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間內(nèi)讀取其吸光度或顯色度，即可計(jì)算出樣品中的POD活性。2.3.注意事項(xiàng)該方法通常適用于活體組織、血清、尿等生物樣品的測(cè)定。（1）若測(cè)定血清或尿液樣品，則應(yīng)使其澄清后再進(jìn)行測(cè)定。（2）在反應(yīng)液中添加較高濃度的雙胍類(lèi)物質(zhì)，如肌酐、乳酸等，可能會(huì)干擾測(cè)定結(jié)果。（3）計(jì)算過(guò)氧化物酶活性時(shí)，需要考慮到反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)物濃度等因素的影響。3.過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定方法3.1.原理過(guò)氧化氫酶可以催化H2O2的分解反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為水和氧氣。在適當(dāng)?shù)膒H范圍內(nèi)，過(guò)氧化氫的分解速率與過(guò)氧化氫酶的濃度呈正比。因此，測(cè)定過(guò)氧化氫酶活性的方法通常是測(cè)定其催化下H2O2的分解速率。3.2.測(cè)定步驟（1）制備反應(yīng)液：首先，配置適當(dāng)濃度的H2O2緩沖液。然后，將濃度為50U/mL的過(guò)氧化氫酶加入反應(yīng)液中，使其最終濃度為1U/mL。混勻后，直接進(jìn)入后續(xù)反應(yīng)。（2）開(kāi)始反應(yīng)：向上述反應(yīng)液中加入50μL的樣品，反應(yīng)5~10分鐘。將樣品在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間內(nèi)讀取其吸光度，或使用其他測(cè)定法測(cè)定樣品中的過(guò)氧化氫酶活性。3.3.注意事項(xiàng)該方法通常適用于測(cè)定血清、尿液等樣品中的過(guò)氧化氫酶活性。（1）在反應(yīng)過(guò)程中，過(guò)氧化氫的濃度不宜過(guò)高（如大于1mmol/L），以免催化劑們活化過(guò)多，導(dǎo)致酶的失活。（2）在反應(yīng)前，應(yīng)考慮樣品中其他可能存在的過(guò)氧化物或維生素C等物質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。4.試劑配制4.1.苯酚/過(guò)氧化氫緩沖液的配制苯酚/過(guò)氧化氫緩沖液是一種常用的POD活性測(cè)定液。其配制方法如下：（1）配制1mmol/L的苯酚：取100mg的苯酚溶于1mL的甲醇中，搖勻。取適量的甲醇/mQ水混合液，調(diào)整其pH值為5.0~7.0，然后加入適量的上述苯酚溶液，最終濃度為1mmol/L。（2）配制0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH7.0）：取11.43g的MglH2PO4和7.1g的Na2HPO4溶于500mL的mQ水中，調(diào)節(jié)pH到7.0，最終體積調(diào)整到1L。（3）緩沖液的配制：將上述1mmol/L苯酚和0.1mol/L磷酸鹽緩沖液按比例混合即可。4.2.過(guò)氧化氫酶的制備過(guò)氧化氫酶可以通過(guò)微生物發(fā)酵、蛋白質(zhì)純化、合成等多種方法制備。在實(shí)驗(yàn)室中，可以使用商家提供的酶試劑或進(jìn)行自主制備。（1）過(guò)氧化氫酶的純化：用分子生物學(xué)或生物化學(xué)的方法將目標(biāo)酶從純化華麟中分離得到，然后進(jìn)行純化。（2）過(guò)氧化氫酶的發(fā)酵：選用產(chǎn)酶菌株進(jìn)行液態(tài)或固態(tài)發(fā)酵，收集發(fā)酵液，分離純化目標(biāo)酶。5.結(jié)論以上是過(guò)氧