土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)

關(guān)于土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)第1頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三一、課題背景1、尿素的利用尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、細(xì)菌利用尿素的原因土壤中的細(xì)菌分解尿素是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕窩O(NH2)2脲酶+CO22NH3+H2O第2頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三3、常見的分解尿素的微生物芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。4、課題目的①從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌②統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌一.研究思路㈠.篩選菌株㈡.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目㈢.設(shè)置對照第3頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三

1、實(shí)例：啟示：尋找目的菌種時要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。原因：因?yàn)闊崛獪囟?0～800C，淘汰了絕大多數(shù)微生物只有Taq細(xì)菌被篩選出來。DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種在體外將少量DNA大量復(fù)制的技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。科學(xué)家從水生耐熱細(xì)菌Taq中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶。㈠.篩選菌株第4頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三要分離一種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點(diǎn)，包括營養(yǎng)、生理、生長條件等；配置合適的培養(yǎng)基方法：⑴抑制大多數(shù)微生物生長⑵造成有利于該菌生長的環(huán)境，結(jié)果：培養(yǎng)一定時間后，該菌數(shù)量上升，再通過稀釋涂布平板法等方法對它進(jìn)行純化培養(yǎng)分離。2、實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理：人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。第5頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)所需培養(yǎng)基：①從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？從功能上屬于哪類培養(yǎng)基？固體培養(yǎng)基②在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素選擇培養(yǎng)基第6頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三培養(yǎng)基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。4、培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理選擇培養(yǎng)基：在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。第7頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三1、顯微鏡直接計(jì)數(shù)：利用血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。㈡.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運(yùn)動細(xì)菌的計(jì)數(shù)；需要相對高的細(xì)菌濃度；個體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；缺點(diǎn)第8頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三2.間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法）（1）常用方法：每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。

當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌，通過統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。（2）原理：稀釋涂布平板法。第9頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三？說明設(shè)置重復(fù)組的重要性。第一位同學(xué)只涂布了一個平板，沒有設(shè)置重復(fù)組，因此結(jié)果不具有說服力。第二位同學(xué)考慮到設(shè)置重復(fù)組的問題，涂布了3個平板，但是，其中1個平板的計(jì)數(shù)結(jié)果與另2個相差太遠(yuǎn)，說明在操作過程中可能出現(xiàn)了錯誤，因此，不能簡單地將3個平板的計(jì)數(shù)值用來求平均值。這個實(shí)例啟示學(xué)生，在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時，一定要涂布至少3個平板，作為重復(fù)組，才能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說服力與準(zhǔn)確性。在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時，一定要考慮所設(shè)置的重復(fù)組的結(jié)果是否一致，結(jié)果不一致，意味著操作有誤，需要重新實(shí)驗(yàn)。第10頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三注意事項(xiàng)①為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。②為使結(jié)果接近真實(shí)值可將同一稀釋度加到三個或三個以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計(jì)算出菌落平均數(shù)。③統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。這是因?yàn)楫?dāng)兩個或多個細(xì)胞連在一起時，平板上觀察到是只是一個菌落。第11頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三設(shè)置對照的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測試因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。㈢.設(shè)置對照：設(shè)置對照的方法：空白對照：不給對照組任何處理因素。條件對照：給對照組施以部分實(shí)驗(yàn)因素，但不是所要研究的處理因素。自身對照：對照組和實(shí)驗(yàn)組都在同一研究對象上進(jìn)行。相互對照：不單設(shè)對照組，而是幾個實(shí)驗(yàn)組相互對照。

A同學(xué)的結(jié)果與其他同學(xué)不同，可能的解釋有兩種。一是由于土樣不同；二是由于培養(yǎng)基污染或操作失誤。第12頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三小結(jié)：通過這個事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的。方案一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。結(jié)果預(yù)測：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。第13頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三二.實(shí)驗(yàn)的具體操作

㈠.土壤取樣

從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3-8cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中?！羧⊥翗佑玫男¤F鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。㈡.制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。第14頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三◆應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g?！粼谙♂屚寥廊芤旱倪^程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行◆分離不同的微生物采用不同的稀釋度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保證獲得菌落數(shù)在30～300之間、適于計(jì)數(shù)的平板(三)樣品的稀釋第15頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細(xì)菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？這是因?yàn)橥寥乐懈黝愇⑸锏臄?shù)量（單位：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為2185萬，放線菌數(shù)約為477萬，霉菌數(shù)約為23.1萬。因此，為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離，同時還應(yīng)當(dāng)有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。第16頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三㈣.取樣涂布◆實(shí)驗(yàn)時要對培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等。◆如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30——300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗(yàn)不精確，需要重新實(shí)驗(yàn)。第17頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三㈤.微生物的培養(yǎng)與觀察在菌落計(jì)數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。細(xì)菌：30～37℃培養(yǎng)1～2d放線菌：25～28℃培養(yǎng)5～7d霉菌：25～28℃的溫度下培養(yǎng)3～4d。第18頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三微生物的培養(yǎng)與觀察第19頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三操作提示[一]無菌操作1、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。2、應(yīng)在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。3、在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。[二]做好標(biāo)記注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期、平板培養(yǎng)樣品的稀釋度等。[三]規(guī)劃時間對于耗時較長的生物實(shí)驗(yàn)，需要事先制定計(jì)劃，以便提高工作效率，在操作時做到有條不紊。第20頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三三.結(jié)果分析與評價1.通過對照實(shí)驗(yàn)，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。2.提示：選擇每個平板上長有30—300個菌落的稀釋倍數(shù)計(jì)算每克樣品的菌數(shù)最合適。同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示實(shí)驗(yàn)不精確。第21頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三課題延伸CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3脲酶pH升高指示劑（酚紅）將變紅第22頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三大腸桿菌呈黑色中心,有或無金屬光澤大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)上典型特征

第23頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三本課題知識小結(jié):第24頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三1.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（）

A.培養(yǎng)細(xì)菌

B.培養(yǎng)真菌

C.使需要的微生物大量繁殖

D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是()A.CO2和N2B.葡萄糖和NH3

C.CO2和尿素D.葡萄糖和尿素實(shí)踐訓(xùn)練CD第25頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三3.下列說法不正確的是（）

A.科學(xué)家從70－80度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶

B.統(tǒng)計(jì)某一稀釋度的5個平板的菌落數(shù)依次為M1、M2、M3、M4、M5，以M3作為該樣品菌落數(shù)的估計(jì)值

C.設(shè)置對照實(shí)驗(yàn)