基因芯片的操作流程及步驟

關(guān)于基因芯片的操作流程及步驟第1頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三1CELL=23PAIRSOFCHROMOSOMES第2頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三

23PAIRSOFCHROMOSOMES=~3,200,000,000BASES第3頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三1HUMANBODY=100,000,000,000,000CELLS第4頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三基因芯片結(jié)構(gòu)示意圖第5頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三第6頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三生物芯片的制作步驟

細(xì)胞對(duì)mRNA進(jìn)行標(biāo)記雜交基因表達(dá)資料第7頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三基因芯片研制的總體藍(lán)圖研制方向的確定基因組序列分析與待檢基因探針序列的確定檢測(cè)樣品的制備探針陣列的準(zhǔn)備檢測(cè)設(shè)備的研制雜交檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析第8頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三簡(jiǎn)介基因芯片探針固相原位合成技術(shù)與照相平板印刷技術(shù)激光共聚焦顯微技術(shù)大量探針?lè)肿樱ㄍǔＣ科椒嚼迕c(diǎn)陣密度高于500）于固定支持物上檢測(cè)每個(gè)探針?lè)肿拥碾s交信號(hào)強(qiáng)度與被標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息一次性對(duì)樣品大量序列進(jìn)行檢測(cè)和分析，解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交（SouthernBlotting和NorthernBlotting等）技術(shù)操作繁雜、自動(dòng)化程序低、操作序列數(shù)量少、檢測(cè)效率低等不足。第9頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三基因芯片是信息時(shí)代的產(chǎn)物橫跨：生命科學(xué)、物理學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、微電子技術(shù)光電技術(shù)、材料科學(xué)等現(xiàn)代高科技。第10頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三中科院遺傳所人類(lèi)基因組中心北京大學(xué)聯(lián)合基因集團(tuán)有限公司我國(guó)第一家批量生產(chǎn)基因芯片擁有近2千條基因藥物發(fā)明專(zhuān)利東南大學(xué)吳健雄實(shí)驗(yàn)室中科院計(jì)算所生物信息學(xué)實(shí)驗(yàn)室上海生科院4.我國(guó)主要研究單位第11頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三我國(guó)基因芯片的研究現(xiàn)狀目前，我國(guó)尚未有較成型的基因芯片問(wèn)世，但據(jù)悉已有幾家單位組織人力物力從事該技術(shù)的研制工作，并取得了一些可喜的進(jìn)展。標(biāo)志著我國(guó)相關(guān)學(xué)科與技術(shù)正在走向成熟。涉及領(lǐng)域：生命科學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、精密機(jī)械科學(xué)第12頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三生物芯片分類(lèi)根據(jù)用途還可以把生物芯片分為兩類(lèi)：信息生物芯片（information-biochip）和功能生物芯片（function-biochip）。第13頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三6400點(diǎn)的基因芯片（面積12X14mm)第14頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三基因芯片（genechip）的原理基因芯片的測(cè)序原理是雜交測(cè)序法，即通過(guò)與一組已知序列的核酸探針雜交進(jìn)行核酸序列測(cè)定的方法。在一塊基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探針。當(dāng)溶液中帶有熒光標(biāo)記的核酸序列TATGCAATCTAG，與基因芯片上對(duì)應(yīng)位置的核酸探針產(chǎn)生互補(bǔ)匹配時(shí)，通過(guò)確定熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的探針位置，獲得一組序列完全互補(bǔ)的探針序列。據(jù)此可重組出靶序列的核酸。第15頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三基因芯片又稱(chēng)DNA微陣列（DNAmicroarray）三種主要類(lèi)型：1）固定在聚合物基片（尼龍膜、硝酸纖維膜等）表面上的核酸探針或cDNA片段——通過(guò)同位素標(biāo)記的靶基因與其雜交，通過(guò)放射顯影技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)2）用點(diǎn)樣法固定在玻璃板上的DNA探針陣列——通過(guò)與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進(jìn)行檢測(cè)3）在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核苷酸探針陣列——與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進(jìn)行檢測(cè)把大量分子檢測(cè)單元集成在一個(gè)微小的固體基片表面，可同時(shí)對(duì)大量的核酸和蛋白質(zhì)等生物分子實(shí)現(xiàn)高效、快速、低成本的檢測(cè)和分析?；蛐酒偷?6頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三主要類(lèi)型多種方法將寡核苷酸或短肽固定到固相支持物上原位合成（insitusynthesis）合成點(diǎn)樣支持物：玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等薄膜型、玻片型微板型集成電路型第17頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三

基因芯片

/DNA微陣列

GeneChip/DNAMicroarray第18頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三核酸雜交技術(shù)是基因芯片應(yīng)用的基礎(chǔ)。第二節(jié)、基因芯片技術(shù)第19頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三核酸體外雜交技術(shù)第20頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三

表達(dá)型基因芯片的設(shè)計(jì)第21頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三一、基因芯片（DNA微陣列）

寡核苷酸芯片、cDNA芯片、Genomic芯片模式一：是將靶DNA固定于支持物上，適合于大量不同靶DNA的分析，模式二：將大量探針?lè)肿庸潭ㄓ谥С治锷?，適合對(duì)同一靶DNA進(jìn)行不同探針序列的分析。

第22頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三1.基因芯片原理

基因芯片是在基因探針的基礎(chǔ)上研制出的。它將大量探針?lè)肿庸潭ㄓ谥С治锷?，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度及分布來(lái)進(jìn)行分析?；蛐酒汛罅糠肿訖z測(cè)單元集成在一個(gè)微小的固體基片表面，可同時(shí)對(duì)大量的核酸和蛋白質(zhì)等生物分子實(shí)現(xiàn)高效、快速、低成本的檢測(cè)和分析。

基因芯片技術(shù)是建立在Southernblot基礎(chǔ)之上的，可以說(shuō)它是Southernblot的改進(jìn)和發(fā)展，它的原理是：變性DNA加入探針后在一定溫度下退火，同源片段之間通過(guò)堿基互補(bǔ)形成雙鏈雜交分子。第23頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三2.基因芯片的基本原理分析任何線狀的單鏈DNA或RNA序列均可被分解為一個(gè)序列固定、錯(cuò)落而重疊的寡核苷酸，又稱(chēng)亞序列（subsequence）。例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG分解成5個(gè)8nt亞序列：第24頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三這5個(gè)亞序列依次錯(cuò)開(kāi)一個(gè)堿基而重疊7個(gè)堿基。亞序列中A、T、C、G4個(gè)堿基自由組合而形成的所有可能的序列共有65536種。假如只考慮完全互補(bǔ)的雜交，那么48個(gè)8nt亞序列探針中，僅有上述5個(gè)能同靶DNA雜交?？梢杂萌斯ず铣傻囊阎蛄械乃锌赡艿膎體寡核苷酸探針與一個(gè)未知的熒光標(biāo)記DNA/RNA序列雜交，通過(guò)對(duì)雜交熒光信號(hào)檢測(cè)，檢出所有能與靶DNA雜交的寡核苷酸，從而推出靶DNA中的所有8nt亞序列，最后由計(jì)算機(jī)對(duì)大量熒光信號(hào)的譜型（pattern）數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，重構(gòu)靶DNA的互補(bǔ)寡核苷酸序列。

第25頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三

原理--通過(guò)雜交檢測(cè)信息一組寡核苷酸探針—TATGCAATCTAGCGTTAGATACGTTAGAATACGTTAGATCTACGTTAG由雜交位置確定的一組核酸探針序列GTTAGATC雜交探針組TATGCAATCTAG重組的互補(bǔ)序列靶序列TACGTTAGACGTTAGAATACGTTACGTTAGATGTTAGATC

ATACGTTA第26頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三基因芯片熒光標(biāo)記的樣品共聚焦顯微鏡獲取熒光圖象雜交結(jié)果分析探針設(shè)計(jì)雜交第27頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三提出問(wèn)題芯片設(shè)計(jì)芯片制作●點(diǎn)樣方法●

在片合成試樣處理芯片雜交雜交檢測(cè)數(shù)據(jù)分析實(shí)際應(yīng)用●PCR擴(kuò)增●靶基因標(biāo)記●表達(dá)差異分析●多態(tài)性分析●再測(cè)序●生物信息學(xué)●數(shù)學(xué)優(yōu)化●數(shù)據(jù)庫(kù)基因芯片的相關(guān)技術(shù)示意圖第28頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三二、基因芯片基本操作流程制備總RNA→mRNA經(jīng)RT--PCR用Cy3（正常對(duì)照組）和Cy5（實(shí)驗(yàn)組）熒光標(biāo)記目的基因，得到cDNA探針→混合標(biāo)記探針→與表達(dá)譜芯片上核苷酸片段（或基因）雜交→掃描→分析雜交結(jié)果→結(jié)論載體+寡核苷酸-探針?lè)肿?熒光染料-點(diǎn)樣儀-掃描儀-計(jì)算機(jī)+專(zhuān)業(yè)軟件第29頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三基因芯片流程樣品制備芯片制備雜交雜交信號(hào)檢測(cè)數(shù)據(jù)分析第30頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三基因芯片的操作流程第31頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三基因芯片流程（一）1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)2.樣品制備（指mRNA或總RNA樣品，包括對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。將mRNA或總RNA分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，然后將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組cDNA分別標(biāo)記Cy3和Cy5熒光信號(hào)）3.芯片制備（寡核苷酸探針或cDNA探針，包括PCR，純化，點(diǎn)樣等步驟）第32頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三例基于芯片的基因測(cè)序第33頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三基因芯片流程（二）4.芯片雜交（將用Cy3和Cy5熒光標(biāo)記的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的cDNA等量混合，與芯片進(jìn)行雜交）5.芯片掃描（采用激光掃描儀，分別用532nm和635nm波長(zhǎng)激光掃描芯片，對(duì)于每張芯片，得到Cy3和Cy5通道兩幅圖象）第34頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三cDNAspottedmicroarrays第35頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三基因芯片流程（三）6..圖象處理（采用專(zhuān)門(mén)軟件，對(duì)圖象進(jìn)行分析，提取每個(gè)點(diǎn)上的數(shù)字信號(hào)，得到原始數(shù)據(jù)表）7.數(shù)據(jù)校正和篩選（對(duì)Cy5或Cy3信號(hào)進(jìn)行校正，消除實(shí)驗(yàn)或掃描等各環(huán)節(jié)因素對(duì)數(shù)據(jù)的影響，同時(shí)利用篩選規(guī)則對(duì)數(shù)據(jù)中的“壞點(diǎn)”，“小點(diǎn)”，“低信號(hào)點(diǎn)”進(jìn)行篩選，并作標(biāo)記）第36頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三基因芯片流程（四）8.目的基因或序列的確定（采用ratio值對(duì)差異基因進(jìn)行判斷，或采用統(tǒng)計(jì)方法如線性回歸、主成分分析、調(diào)整P值算法等對(duì)差異基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)推斷）9.生物信息學(xué)分析（如cluster算法、差異基因的同源性比對(duì)，差異基因的相關(guān)文獻(xiàn)檢索等）第37頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三微流控芯片檢測(cè)儀第38頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三基因芯片的閱讀分析系統(tǒng)第39頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三芯片掃描儀

第40頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三芯片雜交盒第41頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三三、基因芯片設(shè)計(jì)步驟1.

基因芯片設(shè)計(jì)的一般性原則基因芯片設(shè)計(jì)主要包括兩個(gè)方面:探針的設(shè)計(jì)指如何選擇芯片上的探針探針在芯片上的布局指如何將探針排布在芯片上。第42頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三確定芯片所要檢測(cè)的目標(biāo)對(duì)象查詢(xún)生物分子數(shù)據(jù)庫(kù)取得相應(yīng)的DNA序列數(shù)據(jù)序列對(duì)比分析找出特征序列，作為芯片設(shè)計(jì)的參照序列。數(shù)據(jù)庫(kù)搜索得到關(guān)于序列突變的信息及其它信息。第43頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三在進(jìn)行探針設(shè)計(jì)和布局時(shí)必須考慮以下幾個(gè)方面：

(1)互補(bǔ)性

(2)敏感性和特異性

(3)容錯(cuò)性

(4)可靠性

(5)可控性

(6)可讀性第44頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三

基因芯片使用步驟芯片制作把探針固定于載體表面樣品處理目標(biāo)分子富集分子間的雜交結(jié)果檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析第45頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三基因芯片的制作方式原位合成直接點(diǎn)樣原位光蝕刻合成原位噴印合成

分子印章法針式點(diǎn)樣噴墨點(diǎn)樣光導(dǎo)原位合成法

第46頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三原位合成法主要為光引導(dǎo)聚合技術(shù)（Light-directedsynthesis），不僅可用于寡核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。主要步驟為：首先使支持物羥基化，并用光敏保護(hù)基團(tuán)將其保護(hù)起來(lái)。每次選取適當(dāng)?shù)谋喂饽ぃ╩ask）使需要聚合的部位透光，其他部位不透光。每次通過(guò)控制蔽光膜的圖案（透光與不透光）決定哪些區(qū)域應(yīng)被活化，以及所用單體的種類(lèi)和反應(yīng)次序就可以實(shí)現(xiàn)在待定位點(diǎn)合成大量預(yù)定序列寡聚體的目的。優(yōu)點(diǎn)是可以用很少的步驟合成及其大量的探針陣列第47頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三1、原位光蝕刻合成

寡聚核苷酸原位光蝕刻合成技術(shù)是由Affymetrix公司開(kāi)發(fā)的，采用的技術(shù)原理是在合成堿基單體的5'羥基末端連上一個(gè)光敏保護(hù)基。合成的第一步是利用光照射使羥基端脫保護(hù)，然后一個(gè)5'端保護(hù)的核苷酸單體連接上去，這個(gè)過(guò)程反復(fù)進(jìn)行直至合成完畢。使用多種掩蓋物能以更少的合成步驟生產(chǎn)出高密度的陣列，在合成循環(huán)中探針數(shù)目呈指數(shù)增長(zhǎng)。某一含n個(gè)核苷酸的寡聚核苷酸，通過(guò)4×n個(gè)化學(xué)步驟能合成出4n個(gè)可能結(jié)構(gòu)。例如：一個(gè)完整的十核苷酸通過(guò)32個(gè)化學(xué)步驟，8個(gè)小時(shí)可能合成65,536個(gè)探針。第48頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三

目前美國(guó)Affymetrix公司已有同時(shí)檢測(cè)6,500個(gè)已知人類(lèi)基因的DNA芯片，并且正在制備含500,000-1,000,000個(gè)寡核苷酸探針的人類(lèi)基因檢測(cè)芯片。該公司每月投入基因芯片研究的經(jīng)費(fèi)約100萬(wàn)美元。該產(chǎn)品不僅可用于基因表達(dá)分析和基因診斷等，而且在大規(guī)模藥物開(kāi)發(fā)方面也具有誘人的前景。目前，用于分子診斷的DNA芯片不僅已可用于檢測(cè)愛(ài)滋病病毒基因還可用于囊性纖維化（CF）、乳腺癌、卵巢癌等疾病相關(guān)基因的基因診斷。鑒于光刻設(shè)備技術(shù)復(fù)雜，只能有專(zhuān)業(yè)化公司生產(chǎn)，加之成本高及合成效率不高的問(wèn)題，因此有待進(jìn)行以下研究：⑴對(duì)光刻技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，提高合成效率；⑵開(kāi)發(fā)新的原位合成技術(shù)，如噴印合成技術(shù)，該技術(shù)既能進(jìn)行原位合成又能進(jìn)行非原位合成。第49頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三2、光導(dǎo)原位合成法是在經(jīng)過(guò)處理的載玻片表面鋪上一層連接分子（linker），其羥基上加有光敏保護(hù)基團(tuán)，可用光照除去，用特制的光刻掩膜（photolithographicmask）保護(hù)不需要合成的部位，而暴露合成部位，在光作用下去除羥基上的保護(hù)基團(tuán)，游離羥基，利用化學(xué)反應(yīng)加上第一個(gè)核苷酸，所加核苷酸種類(lèi)及在芯片上的部位預(yù)先設(shè)定，所引入的核苷酸帶有光敏保護(hù)基團(tuán)，以便下一步合成。然后按上述方法在其它位點(diǎn)加上另外三種核苷酸完成第一位核苷酸的合成，因而N個(gè)核苷酸長(zhǎng)的芯片需要4N個(gè)步驟。每一個(gè)獨(dú)特序列的探針?lè)Q為一個(gè)“feature”，這樣的芯片便具有4N個(gè)“feature”，包含了全部長(zhǎng)度為N的核苷酸序列。這種原位直接合成的方法無(wú)須制備處理克隆和PCR產(chǎn)物，但是每輪反應(yīng)所需設(shè)計(jì)的光柵則是主要的經(jīng)費(fèi)消耗。運(yùn)用這種方法制作的芯片密度可高達(dá)106探針/平方厘米，即探針間隔為5－10μm，但只能制作II型DNA芯片。

第50頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三第51頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三3、原位噴印合成

芯片原位噴印合成原理與噴墨打印類(lèi)似，不過(guò)芯片噴印頭和墨盒有多個(gè)，墨盒中裝的是四種堿基等液體而不是碳粉。噴印頭可在整個(gè)芯片上移動(dòng)并根據(jù)芯片上不同位點(diǎn)探針的序列需要將特定的堿基噴印在芯片上特定位置。該技術(shù)采用的化學(xué)原理與傳統(tǒng)的DNA固相合成一致，因此不特殊制備的化學(xué)試劑。第52頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三4、點(diǎn)樣法

點(diǎn)樣法是將合成好的探針、cDNA或基因組DNA通過(guò)特定的高速點(diǎn)樣機(jī)器人直接點(diǎn)在芯片上。點(diǎn)樣分子可以是核酸也可以是寡核酸。

采用人工點(diǎn)樣的方法將寡核苷酸分子點(diǎn)樣于化學(xué)處理后的載玻片上，經(jīng)一定的化學(xué)方法處理非干燥后，寡核苷酸分子即固定于載玻片上，制備好的DNA芯片可置于緩沖液中保存。用多聚賴(lài)氨酸包被固相支待物玻片，經(jīng)過(guò)分區(qū)后用計(jì)算機(jī)控制的微陣列點(diǎn)樣機(jī)按照預(yù)先設(shè)計(jì)順序點(diǎn)上核酸分子，點(diǎn)樣量很小，約為5nl。大規(guī)模CDNA芯片多采用這種方法，與其寡核苷酸微芯片相比。DNA芯片的潛在優(yōu)越性是具有更強(qiáng)的親和勢(shì)和特異性雜交，但是需要大量制備，純化，量化，分類(lèi)PCR產(chǎn)物。第53頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三玻璃片基的處理：使玻璃表面獲得羥基、醛基、氨基等活性基團(tuán)。點(diǎn)樣針沾取探針溶液。點(diǎn)樣針把探針點(diǎn)到玻片表面，讓探針末端的化學(xué)集團(tuán)與玻片表面的集團(tuán)形成共價(jià)鍵。針式點(diǎn)樣的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：成本低，操作簡(jiǎn)單，密度高（幾千-幾十萬(wàn)點(diǎn)/cm2)，轉(zhuǎn)移過(guò)程中探針溶液損失小。缺點(diǎn)：定量準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性不好5.針式點(diǎn)樣第54頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三第55頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三

生產(chǎn)商Bio-Rad

性能介紹分辨率：1.25um(x，y軸)和0.25um(Z軸)，重復(fù)性：3um

球面精確性：l0um。

一次制成芯片數(shù)：126塊芯片每塊玻片點(diǎn)樣量>82,000個(gè)點(diǎn)2202芯片點(diǎn)樣儀第56頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三第57頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三噴墨點(diǎn)樣的方式類(lèi)似于噴墨打印機(jī)。將合成用探針溶液放入打印墨盒內(nèi)，由電腦依據(jù)預(yù)定的程序在xyz方向自動(dòng)控制打印噴頭在芯片支持物上移動(dòng)，并根據(jù)芯片不同位點(diǎn)探針序列需要將特定的探針試劑（不足納升）噴印到特定位點(diǎn)。噴印上去的試劑即以固相合成原理與該處支持物發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)。6.噴墨點(diǎn)樣第58頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三7.分子印章法根據(jù)陣列合成的要求設(shè)計(jì)并制作表面凹凸不平的分子印章，再按照合成的順序，將寡核苷酸合成試劑涂布在不同的印章上，逐個(gè)依次壓印到芯片特定位點(diǎn)進(jìn)行合成反應(yīng)。合成的后續(xù)反應(yīng)與壓電打印類(lèi)似。分子印章法不僅可用于制備原位合成芯片，還可用于DNA微集陣列的制作。第59頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三2.基因芯片樣品制備

第60頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三1．樣品制備。

一般所需mRNA的量是以一張表達(dá)譜芯片需要3μgmRNA計(jì)算的第61頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三2樣本采集過(guò)程關(guān)鍵點(diǎn)．

氰代磷酸二乙酯(DEPC)第62頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三離體新鮮組織，切成多個(gè)1cm3小塊，剔除結(jié)締組織和脂肪組織。胃、腸組織應(yīng)剪除外膜；肝、腎、脾應(yīng)剪除門(mén)部血管神經(jīng)，腫瘤組織應(yīng)將周?chē)恼＝M織切除干凈（正常組織也應(yīng)將周?chē)哪[瘤組織切除干凈）。在RNase-Free0.9％生理鹽水中漂洗樣品，以去除血漬和污物。用鋁箔包裹組織，或用5ml凍存管裝載組織(但最好統(tǒng)一采用鋁箔)。用記號(hào)筆在鋁箔或凍存管外表寫(xiě)明樣品編號(hào)，并貼上標(biāo)簽，迅速投入液氮冷卻。填寫(xiě)樣品登記表，寫(xiě)明樣品名稱(chēng)、種類(lèi)、編號(hào)、取樣日期、樣品處理情況等將液氮冷卻的組織放入樣品袋（每個(gè)樣品袋只保存同樣的組織），袋口留一根編號(hào)繩，繩上粘一張標(biāo)簽紙（標(biāo)簽上注明：樣品名稱(chēng)、編號(hào)、日期），迅速轉(zhuǎn)入便攜式液氮罐保留1-2張取材部位的病理切片。第63頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三

以上步驟應(yīng)在冰上進(jìn)行且不超過(guò)15分鐘，超過(guò)時(shí)間會(huì)導(dǎo)致樣品的RNA降解。對(duì)腫瘤組織的取材，要求盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤和正常組織，例如對(duì)于手術(shù)切除的整個(gè)或部分前列腺，可能要根據(jù)冰凍切片報(bào)告的結(jié)果來(lái)判定要進(jìn)行研究的取材部位。

第64頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三3.基因芯片雜交

第65頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三待分析基因在與芯片結(jié)合探針雜交之前必需進(jìn)行分離、擴(kuò)增及標(biāo)記。根據(jù)樣品來(lái)源、基因含量及檢測(cè)方法和分析目的不同，采用的基因分離、擴(kuò)增及標(biāo)記方法各異。當(dāng)然，常規(guī)的基因分離、擴(kuò)增及標(biāo)記技術(shù)完全可以采用，但操作繁瑣且費(fèi)時(shí)。高度集成的微型樣品處理系統(tǒng)如細(xì)胞分離芯片及基因擴(kuò)增芯片等是實(shí)現(xiàn)上述目的的有效手段和發(fā)展方向。為了獲得基因的雜交信號(hào)必須對(duì)目的基因進(jìn)行標(biāo)記，目前采用的最普遍的熒光標(biāo)記方法與傳統(tǒng)方法如體外轉(zhuǎn)錄、PCR、逆轉(zhuǎn)錄等原理上并無(wú)多大差異，只是采用的熒光素種類(lèi)更多，這可以滿(mǎn)足不同來(lái)源樣品的平行分析。用計(jì)算機(jī)控制的高分辨熒光掃描儀可獲得結(jié)合于芯片上目的基因的熒光信號(hào)，通過(guò)計(jì)算機(jī)處理即可給出目的基因的結(jié)構(gòu)或表達(dá)信息。第66頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三

雜交條件的選擇與研究目的有關(guān)，多態(tài)性分析或者基因測(cè)序時(shí)，每個(gè)核苷酸或突變位點(diǎn)都必須檢測(cè)出來(lái)。通常設(shè)計(jì)出一套四種寡聚核苷酸，在靶序列上跨越每個(gè)位點(diǎn)，只在中央位點(diǎn)堿基有所不同，根據(jù)每套探針在某一特點(diǎn)位點(diǎn)的雜交嚴(yán)謹(jǐn)程度，即可測(cè)定出該堿基的種類(lèi)。如果芯片僅用于檢測(cè)基因表達(dá)，只需設(shè)計(jì)出針對(duì)基因中的特定區(qū)域的幾套寡聚核苷酸即可。表達(dá)檢測(cè)需要長(zhǎng)的雜交時(shí)間，更高的嚴(yán)謹(jǐn)性，更高的樣品濃度和低溫度，這有利于增加檢測(cè)的特異性和低拷貝基因檢測(cè)的靈敏度。突變檢測(cè)，要鑒別出單堿基錯(cuò)配，需要更高的雜交嚴(yán)謹(jǐn)性和更短的時(shí)間。第67頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三第68頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三第69頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三第70頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三4.基因芯片檢測(cè)原理

第71頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三雜交信號(hào)的檢測(cè)是DNA芯片技術(shù)中的重要組成部分。由于DNA芯片本身的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，需要確定雜交信號(hào)在芯片上的位置，尤其是大規(guī)模DNA芯片由于其面積小，密度大，點(diǎn)樣量很少，所以雜交信號(hào)較弱，需要使用光電倍增管或冷卻的電荷偶連照相機(jī)(charged-coupleddevicecamera，CCD)攝像機(jī)等弱光信號(hào)探測(cè)裝置。此外，大多數(shù)DNA芯片雜交信號(hào)譜型除了分布位點(diǎn)以外還需要確定每一點(diǎn)上的信號(hào)強(qiáng)度，以確定是完全雜交還是不完全雜交，因而探測(cè)方法的靈敏度及線性響應(yīng)也是非常重要的。雜交信號(hào)探測(cè)系統(tǒng)主要包括雜交信號(hào)產(chǎn)生、信號(hào)收集及傳輸和信號(hào)處理及成像三個(gè)部分組成。第72頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三1．熒光標(biāo)記雜交信號(hào)的檢測(cè)方法

2．生物素標(biāo)記方法中的雜交信號(hào)探測(cè)第73頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三1．熒光標(biāo)記雜交信號(hào)的檢測(cè)方法（1）激光掃描熒光顯微鏡

探測(cè)裝置比較典型。方法是將雜交后的芯片經(jīng)處理后固定在計(jì)算機(jī)控制的二維傳動(dòng)平臺(tái)上，并將一物鏡置于其上方，由氬離子激光器產(chǎn)生激發(fā)光經(jīng)濾波后通過(guò)物鏡聚焦到芯片表面，激發(fā)熒光標(biāo)記物產(chǎn)生熒光，光斑半徑約為5－10μm。同時(shí)通過(guò)同一物鏡收集熒光信號(hào)經(jīng)另一濾波片濾波后，由冷卻的光電倍增管探測(cè)，經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換板轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)。通過(guò)計(jì)算機(jī)控制傳動(dòng)平臺(tái)X－Y方向上步進(jìn)平移，DNA芯片被逐點(diǎn)照射，所采集熒光信號(hào)構(gòu)成雜交信號(hào)譜型，送計(jì)算機(jī)分析處理，最后形成20μm象素的圖像。這種方法分辨率高、圖像質(zhì)量較好，適用于各種主要類(lèi)型的DNA芯片及大規(guī)模DNA芯片雜交信號(hào)檢測(cè)，廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)、基因診斷等方面研究。第74頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三

(2)激光掃描共焦顯微鏡激光掃描共焦顯微鏡與激光掃描熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)非常相似，但是由于采用了共焦技術(shù)因而更具優(yōu)越性。這種方法可以在熒光標(biāo)記分子與DNA芯片雜交的同時(shí)進(jìn)行雜交信號(hào)的探測(cè)，而無(wú)須清洗掉未雜交分子，從而簡(jiǎn)化了操作步驟大大提高了工作效率。通過(guò)計(jì)算機(jī)控制激光束或樣品池的移動(dòng)，便可實(shí)現(xiàn)對(duì)芯片的二維掃描，移動(dòng)步長(zhǎng)與芯片上寡核苷酸的間距匹配，在幾分鐘至幾十分鐘內(nèi)即可獲得熒光標(biāo)記雜交信號(hào)圖譜。其特點(diǎn)是靈敏度和分辨率較高，掃描時(shí)間長(zhǎng)，比較適合研究用?，F(xiàn)在Affymetrix公司已推出商業(yè)化樣機(jī)，整套系統(tǒng)約12萬(wàn)美元。第75頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三（3）采用了CCD相機(jī)的熒光顯微鏡

這種探測(cè)裝置與以上的掃描方法都是基于熒光顯微鏡，但是以CCD相機(jī)作為信號(hào)接收器而不是光電倍增管，因而無(wú)須掃描傳動(dòng)平臺(tái)。由于采用了CCD相機(jī)，因而大大提高了獲取熒光圖像的速度，曝光時(shí)間可縮短至零點(diǎn)幾秒至十幾秒。其特點(diǎn)是掃描時(shí)間短，靈敏度和分辨率較低，比較適合臨床診斷用

第76頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三（4）光纖傳感器

將DNA芯片直接做在光纖維束的切面上（遠(yuǎn)端），光纖維束的另一端（近端）經(jīng)特制的耦合裝置耦合到熒光顯微鏡中。光纖維束由7根單模光纖組成。每根光纖的直徑為200μm，兩端均經(jīng)化學(xué)方法拋光清潔?；瘜W(xué)方法合成的寡核苷酸探針共價(jià)結(jié)合于每根光纖的遠(yuǎn)端組成寡核苷酸陣列。將光纖遠(yuǎn)端浸入到熒光標(biāo)記的靶分子溶液中與靶分子雜交，通過(guò)光纖維束傳導(dǎo)來(lái)自熒光顯微鏡的激光（490urn），激發(fā)熒光標(biāo)記物產(chǎn)生熒光，仍用光纖維束傳導(dǎo)熒光信號(hào)返回到熒光顯微鏡，由CCD相機(jī)接收。這種方法快速、便捷，可實(shí)時(shí)檢測(cè)DNA微陣列雜交情況而且具有較高的靈敏度，但由于光纖維束所含光纖數(shù)目有限，因而不便于制備大規(guī)模DNA芯片，有一定的應(yīng)用局限性。第77頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三2．生物素標(biāo)記方法中的雜交信號(hào)探測(cè)

以生物素（biotin）標(biāo)記樣品的方法由來(lái)已久，通常都要聯(lián)合使用其它大分子與抗生物素的結(jié)合物（如結(jié)合化學(xué)發(fā)光底物酶、熒光素等），再利用所結(jié)合大分子的特殊性質(zhì)得到最初的雜交信號(hào)，由于所選用的與抗生物素結(jié)合的分子種類(lèi)繁多，因而檢測(cè)方法也更趨多樣化。特別是如果采用尼龍膜作為固相支持物，直接以熒光標(biāo)記的探針用于DNA芯片雜交將受到很大的限制，因?yàn)樵谀猃埬ど蠠晒鈽?biāo)記信號(hào)信噪比較低。因而使用尼龍膜作為固相支持物的這些研究者大多是采用生物素標(biāo)記的。目前應(yīng)用較多的是美國(guó)GeneralScanning公司開(kāi)發(fā)的基因芯片專(zhuān)用檢測(cè)系統(tǒng)(ScanArray3000)，采用激光共聚焦掃描原理進(jìn)行熒光信號(hào)采集，由計(jì)算機(jī)處理熒光信號(hào)，并對(duì)每個(gè)點(diǎn)的熒光強(qiáng)度數(shù)字化后進(jìn)行分析。近期又開(kāi)發(fā)出了ScanArray5000，其掃描精度和功能有較大的提高。第78頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三5.結(jié)果的分析第79頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三

樣品在被測(cè)定前，首先要經(jīng)過(guò)消化，使待測(cè)組織細(xì)胞中的DNA或RNA釋放出來(lái)，在經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增后，以熒光標(biāo)記物標(biāo)記，放入基因芯片自動(dòng)孵育裝置中，由其自動(dòng)控制反應(yīng)的時(shí)間、溫度以及緩沖液的配比等反應(yīng)條件，進(jìn)行雜交。雜交完成后，要對(duì)基因芯片進(jìn)行“讀片”，即應(yīng)用激光共聚焦熒光掃描顯微鏡，對(duì)基因芯片表面的每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)合到芯片表面位點(diǎn)的樣品片斷的熒光標(biāo)記，而待測(cè)樣品中未與芯片上探針結(jié)合的熒光標(biāo)記物，則懸浮于溶液中，由于不在聚焦平面上，因而不被檢測(cè)。樣品與探針的錯(cuò)配是影響雜交反應(yīng)結(jié)果的重要因素，但由于樣品與芯片上的探針正確配對(duì)時(shí)產(chǎn)生的熒光信號(hào)要比錯(cuò)配時(shí)強(qiáng)的多，因此，通過(guò)對(duì)信號(hào)強(qiáng)度的分析，就可以區(qū)分正確與錯(cuò)誤的配對(duì)。

第80頁(yè)，講稿共88頁(yè)，2023年5月2日，星期三為了使結(jié)果的檢驗(yàn)更加簡(jiǎn)便和快速，Affymetrix的基因芯片的分析系統(tǒng)中采用了基因陣列掃描儀和專(zhuān)用的基因芯片工作站，對(duì)一幅包含數(shù)萬(wàn)個(gè)