細(xì)胞培養(yǎng)基本知識基本技術(shù)

主要內(nèi)容：1、細(xì)胞培養(yǎng)基本知識2、培養(yǎng)細(xì)胞生長的條件3、細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)本文檔共63頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期二\5點21分一、

細(xì)胞培養(yǎng)把取得的組織用機(jī)械或消化的方法分散成單個細(xì)胞，用培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，在體外適宜條件下，使細(xì)胞生長繁殖，并保留其一定的結(jié)構(gòu)和功能特性。本文檔共63頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期二\5點21分培養(yǎng)細(xì)胞的特性1-生長方式及類型貼附型、懸浮型本文檔共63頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期二\5點21分培養(yǎng)細(xì)胞的特性2-增殖特點體外培養(yǎng)的細(xì)胞既保持了一定的體內(nèi)細(xì)胞的基本特性，但也具有本身的一些特點。貼附-伸展接觸抑制-增殖的密度抑制本文檔共63頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期二\5點21分貼附-伸展本文檔共63頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期二\5點21分接觸抑制當(dāng)一個細(xì)胞被其他細(xì)胞圍繞導(dǎo)致無處可去而保持接觸時，細(xì)胞不再移動，在接觸區(qū)域的細(xì)胞膜活動將停止。因此，一般正常細(xì)胞并不相互重疊于其上生長。本文檔共63頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期二\5點21分細(xì)胞增殖密度抑制當(dāng)細(xì)胞生長匯合形成單層時，細(xì)胞變得比較擁擠，這時其分裂停止，這種細(xì)胞可在靜止?fàn)顟B(tài)下維持存活一段時間，但不會繼續(xù)分裂生殖。轉(zhuǎn)化細(xì)胞或惡性腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞不同，他們的接觸抑制和增殖密度抑制常常降低，因而可以增殖至較高的終末細(xì)胞密度。本文檔共63頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期二\5點21分培養(yǎng)細(xì)胞的特性3-生長過程單個細(xì)胞增殖：細(xì)胞周期本文檔共63頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期二\5點21分高等生物體，細(xì)胞周期時間的長短變化主要集中在G1期，S，G2和M期基本保持穩(wěn)定。Hela8-16h5-9h2-8h20-28h本文檔共63頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期二\5點21分一群細(xì)胞的增殖：細(xì)胞生長曲線接種后，每天進(jìn)行檢測計數(shù)，以細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，以時間為橫坐標(biāo)，繪制成曲線。測定細(xì)胞絕對生長數(shù)的常用方法，也是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)，是培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一。飽和密度：在特定條件下，培養(yǎng)器皿內(nèi)能達(dá)到的最高細(xì)胞數(shù)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到飽和密度后細(xì)胞群體停止繁殖。本文檔共63頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期二\5點21分潛伏期/滯留期指數(shù)增長期平臺期/停滯期退化或死亡本文檔共63頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期二\5點21分細(xì)胞系的生長過程細(xì)胞系：原代培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)首次傳代成功后即成為細(xì)胞系，可泛指一般可以傳代的細(xì)胞。細(xì)胞株：通過篩選或克隆化，從原代細(xì)胞或細(xì)胞系中獲得具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物的細(xì)胞。細(xì)胞系亞系：由某一細(xì)胞系分離出來，在性狀上與原細(xì)胞系不同的細(xì)胞系，稱該細(xì)胞系的亞系本文檔共63頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期二\5點21分有限細(xì)胞系：如果不能繼續(xù)傳代或傳代有限，可稱為有限細(xì)胞系。連續(xù)細(xì)胞系：能夠連續(xù)傳代的細(xì)胞叫做“連續(xù)細(xì)胞系或無限細(xì)胞系?？膳囵B(yǎng)50代以上并無限培養(yǎng)下去。大多數(shù)的二倍體細(xì)胞為有限細(xì)胞系。無限細(xì)胞系大多已發(fā)生變異。本文檔共63頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期二\5點21分原代細(xì)胞：從機(jī)體取得組織材料，在體外培養(yǎng)生長，到第一次傳代前。傳代細(xì)胞：當(dāng)原代細(xì)胞持續(xù)生長繁殖一段時間，達(dá)到一定的細(xì)胞密度后傳代的細(xì)胞。本文檔共63頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期二\5點21分培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法方法：將培養(yǎng)對象直接接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，再放入培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)點：1、可以避免培養(yǎng)瓶表面粗糙等原因?qū)ε囵B(yǎng)物的影響。2、可以方便地進(jìn)行顯微鏡觀察、染色等操作，以及永久保存。3、增加了培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)面積。本文檔共63頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期二\5點21分培養(yǎng)板培養(yǎng)法方法：將培養(yǎng)細(xì)胞接種在培養(yǎng)板的孔內(nèi)，然后在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。應(yīng)培養(yǎng)量較小也稱為微量培養(yǎng)。本文檔共63頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期二\5點21分懸滴培養(yǎng)法也稱植塊懸滴培養(yǎng)法，是最早建立的體外培養(yǎng)技術(shù)基本要點：將組織或器官植塊接種在一張蓋玻片上，滴上一滴培養(yǎng)液，然后翻轉(zhuǎn)蓋玻片使植塊及營養(yǎng)液懸掛在蓋玻片下，再放置于一凹形載片之上，最后用溶蠟密封后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本文檔共63頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期二\5點21分1907年-Harrison用細(xì)胞培養(yǎng)解決一個難題蓋玻片覆蓋凹型載玻片懸滴培養(yǎng)法本文檔共63頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期二\5點21分懸滴培養(yǎng)法基本步驟1、在蓋玻片上滴加胚胎提取液、血漿和植塊，混勻。培養(yǎng)基凝固后將植塊包埋。2、在凹載片周圍涂凡士林。將凹載片向下壓向蓋玻片3、將凹載片反轉(zhuǎn)，蓋玻片周圍涂溶蠟。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)本文檔共63頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期二\5點21分1910至1923年–Carrel和早期的組織培養(yǎng)卡氏瓶培養(yǎng)法本文檔共63頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期二\5點21分1943年Earle、Dulbecco等創(chuàng)建單層細(xì)胞培養(yǎng)法，首建長期傳代的L-細(xì)胞系。1951年Gey首建人腫瘤細(xì)胞——Hela細(xì)胞系。從50年代末開始，組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用進(jìn)入了一個繁盛的階段，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究各個領(lǐng)域。本文檔共63頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期二\5點21分無血清培養(yǎng)無血清培養(yǎng)基:是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。但是它們可能包含個別蛋白或大量蛋白組分?；境煞譃榛A(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。觀察一種生長因子對某種細(xì)胞的作用，這時需要排除其他生長因子的干擾作用。而血清中可能含有各種生長因子；又如需要測定某種細(xì)胞在培養(yǎng)過程中分泌某種物質(zhì)（抗體、生長因子）的能力；或者要大規(guī)模的培養(yǎng)某種細(xì)胞，以獲得它們的分泌產(chǎn)物。往往針對性很強(qiáng)，價格偏高。本文檔共63頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期二\5點21分三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

將具有三維結(jié)構(gòu)不同材料的載體與各種不同種類的細(xì)胞在體外共同培養(yǎng),使細(xì)胞能夠在載體的三維立體空間結(jié)構(gòu)中遷移、生長,構(gòu)成三維的細(xì)胞-載體復(fù)合物。本文檔共63頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期二\5點21分普通的細(xì)胞培養(yǎng)由于細(xì)胞在體外改變的環(huán)境下增生逐漸喪失了原有的性狀，往往和體內(nèi)情況不相符，而動物實驗完全在體內(nèi)進(jìn)行,但由于體內(nèi)的多種因素制約以及體內(nèi)和外界環(huán)境相互影響而變得復(fù)雜化,難以研究單一過程，且難以研究中間過程。三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是介于單層細(xì)胞培養(yǎng)與動物實驗之間的一種技術(shù)，既能最大程度的模擬體內(nèi)環(huán)境，又能展現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的直觀性及條件可控性的優(yōu)勢。應(yīng)用：軟骨和骨組織（軟骨細(xì)胞和干細(xì)胞，再生損傷的軟骨、骨）循環(huán)系統(tǒng)和心臟（有目的地改變血管形成）本文檔共63頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期二\5點21分目前常用的三維培養(yǎng)模型：基質(zhì)覆蓋培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)燒瓶培養(yǎng)微載體培養(yǎng)預(yù)置支架培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)自發(fā)性細(xì)胞聚集本文檔共63頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期二\5點21分細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的特點及應(yīng)用優(yōu)點：1）研究的條件可以人為控制2）研究的樣本均一3）研究內(nèi)容方便觀察、檢測、記錄4）研究的費用相對于經(jīng)濟(jì)缺點：體外培養(yǎng)的細(xì)胞不能完全等同于體內(nèi)的細(xì)胞。本文檔共63頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期二\5點21分應(yīng)用病毒學(xué)：病毒鑒定，病毒抗原作用，疫苗生產(chǎn)……免疫學(xué)：雜交瘤-單克隆抗體……遺傳學(xué)：染色體分析……腫瘤學(xué)：篩選重要的抗腫瘤藥物……分化及發(fā)育：刺激使細(xì)胞群體發(fā)生改變……細(xì)胞毒實驗：藥效測試……臨床醫(yī)學(xué)及生物技術(shù)：干細(xì)胞培養(yǎng)定向誘導(dǎo)分化后移植；組織工程軟骨損傷修復(fù)；試管嬰兒……本文檔共63頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期二\5點21分營養(yǎng)需要環(huán)境要求無毒及無污染二、培養(yǎng)細(xì)胞生長的條件本文檔共63頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期二\5點21分1、細(xì)胞的營養(yǎng)需求（1）氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)離子（2）促生長因子等完全培養(yǎng)基的組成：基礎(chǔ)培養(yǎng)基80％一95％血清5％一20％碳酸氫鈉2.0g/L青、鏈霉素各100單位／毫升本文檔共63頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期二\5點21分基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇參考：(1）建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基?？梢圆殚唴⒖嘉墨I(xiàn)，或在購買細(xì)胞株時咨詢。(2)其它實驗室慣用的培養(yǎng)基不妨一試，許多培養(yǎng)基可以適合多種細(xì)胞。(3)用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長狀態(tài)，可以用生長曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實驗結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。常用的培養(yǎng)基種類RPMI-1640（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-高糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-低糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-F12等……本文檔共63頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期二\5點21分血清熱滅活：56℃,30分鐘加熱已完全解凍的血清(目前少用）熱滅活目的：滅活血清中的補(bǔ)體成分。如果不做細(xì)胞因子和免疫相關(guān)的實驗，建議血清不要滅活。

熱處理造成血清沉淀物增多，影響血清質(zhì)量。甚至嚴(yán)重影響細(xì)胞生長速度，且細(xì)胞貼壁率降低。血清中的沉淀物絮狀物：血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會影響血清本身的質(zhì)量?？捎秒x心3000rpm,5分鐘去除，也可不用處理顯微鏡下“小黑點”：經(jīng)過熱處理過的血清，沉淀物的形成會顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象“小黑點”，常誤認(rèn)為血清受污染。一般情況下，此小黑點不會影響細(xì)胞生長，但如果懷疑血清質(zhì)量，則應(yīng)立即停止使用，更換另一批號的血清本文檔共63頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期二\5點21分血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵。常用血清：胎牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、病毒污染。本文檔共63頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期二\5點21分pH調(diào)整液NaHCO3溶液（堿）常用濃度為7.5%。配制時用三蒸水溶解后，過濾除菌或高壓滅菌，分裝，4℃保存HEPES（分子量238.31）溶液一種弱酸，羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細(xì)胞無毒性主要作用:防止培養(yǎng)基pH迅速變動。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時可以維持pH7.0左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時要添加HEPES使用終濃度一般為10-50mmol/L常配成1M儲存液：用20ml雙蒸水溶解4.76克HEPES，過濾除菌或高壓滅菌，分裝小瓶，4℃保存。使用時可向100ml培養(yǎng)液中加入2mlHEPES濃縮液，終濃度為20mmol/L本文檔共63頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期二\5點21分抗菌素的使用：在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長。通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。最終使用濃度為每毫升100單位。

本文檔共63頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期二\5點21分制備1000mlRPMI

1640培養(yǎng)基RPMI

1640

干粉培養(yǎng)基10.4g（1包）

超純水

400ml

↓

磁力攪拌至完全溶解

↓

加超純水定容至1000ml

在超凈臺內(nèi)無菌條件下，用滅菌后的并置有0.22μm孔徑濾膜的過濾器除菌，分裝200ml/瓶，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用前取一瓶溶解，每200ml培養(yǎng)液加滅活的小牛血清至終濃度為10%，即加22ml。加青霉素和鏈霉素至終濃度各為100U/ml。本文檔共63頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期二\5點21分消化液分離組織和分散細(xì)胞常用：胰蛋白酶、二乙胺四乙酸二鈉(EDTA)

單獨或混合使用本文檔共63頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期二\5點21分胰蛋白酶溶液：

胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。

胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，但超過一定限度會損傷細(xì)胞。胰蛋白酶液消化時間：2-10分鐘。用含血清培養(yǎng)液終止其對細(xì)胞的消化作用本文檔共63頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期二\5點21分胰蛋白酶粉末置燒杯中，用少許D-Hanks平衡鹽溶液調(diào)成糊狀，再補(bǔ)足D-Hanks平衡鹽溶液（常用濃度為0.25%）攪拌混勻，置室溫4小時或冰箱過夜，不斷攪拌振蕩次日，先用濾紙粗濾，再進(jìn)行過濾除菌，分裝入瓶中，-20℃保存?zhèn)溆茫ㄒ悦夥纸馐В?，胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氫鈉溶液調(diào)pH至7.2左右胰蛋白酶溶液配制本文檔共63頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期二\5點21分EDTA·4Na溶液一種化學(xué)螯合劑，對細(xì)胞有一定的離散作用，而且毒性小，價格低廉，使用方便常用工作液濃度為0.02%。

注意：使用EDTA處理細(xì)胞后，要用平衡鹽液沖洗干凈，因殘留的EDTA會影響細(xì)胞生長本文檔共63頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期二\5點21分D-Hanks’

平衡鹽溶液(D-HanksBalancedSaltSolutions,D-HBSS)KCl0.40gKH2PO40.06gNaCl8.00gNaCO30.35gNa2HPO40.048gD-Glucose1.00gPhenolRed0.01g

本文檔共63頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期二\5點21分2、

環(huán)境要求細(xì)胞培養(yǎng)必須具備細(xì)胞生存并繁殖的生理學(xué)能接受限度內(nèi)的物理化學(xué)特性（1）溫度（2）氣相（3）PH本文檔共63頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期二\5點21分溫度體外培養(yǎng)的細(xì)胞需要在保持一定恒溫的環(huán)境中才能生長。在達(dá)到最適溫度（37°）前，一般細(xì)胞繁殖率因溫度的升高而增加，但是，溫度逐步升高并超過最適溫度時，繁殖會被抑制。當(dāng)溫度在25°-35°，細(xì)胞的生長速度很慢，但能夠生存；細(xì)胞在4°也能存活數(shù)天；只要溫度不低于0°，細(xì)胞都能生存；加了保護(hù)劑還能放到液氮中保存。當(dāng)高溫時，在41°-42°中培養(yǎng)1h，細(xì)胞損傷嚴(yán)重，43°以上，則多數(shù)細(xì)胞死亡。高溫比低溫對細(xì)胞的影響更為明顯。本文檔共63頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期二\5點21分氣相和PH5%CO2+95%空氣混合氣體（O2）。CO2既是細(xì)胞生長所需，同時又是細(xì)胞代謝的產(chǎn)物，并與維持培養(yǎng)基的PH有關(guān)。最適PH7.2–7.4低于PH6.8或高于PH7.6可能對細(xì)胞有害，甚至死亡。酚紅指示劑：黃–6.6–橙–8.0–紅本文檔共63頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期二\5點21分3、無毒無污染無毒：無毒是培養(yǎng)細(xì)胞的必需條件。凡與細(xì)胞直接或間接接觸的東西都必須是無毒的。若具細(xì)胞毒性，細(xì)胞容

易導(dǎo)致死亡。因此，選用器皿和材

料時必須注意。本文檔共63頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期二\5點21分無污染微生物的污染不同細(xì)胞類型的交叉污染細(xì)菌霉菌支原體體外培養(yǎng)的細(xì)胞缺乏機(jī)體免疫系統(tǒng)，無防御能力，一旦發(fā)生細(xì)菌等污染，細(xì)胞最終會死亡。交叉污染容易使細(xì)胞系失去原有特性。本文檔共63頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期二\5點21分三、細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)1、原代細(xì)胞培養(yǎng)2、傳代細(xì)胞培養(yǎng)3、培養(yǎng)細(xì)胞生長狀況的觀察4、細(xì)胞凍存、復(fù)蘇、運輸本文檔共63頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期二\5點21分無菌操作中的注意事項在無菌操作中，一定要保持工作區(qū)的無菌清潔操作前,無菌室及無菌操作臺以紫外燈照射30分鐘滅菌，以75%或70%ethanol擦拭無菌操作臺面，并開啟無菌操作臺風(fēng)扇運轉(zhuǎn)10分鐘操作時，小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用操作過程中注意，有菌意識，無菌操作！本文檔共63頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期二\5點21分1、原代細(xì)胞培養(yǎng)原理：將動物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出，經(jīng)各種酶（常用膠原酶）或組織貼壁法處理，得到單個細(xì)胞或細(xì)胞群，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長和繁殖。儀器、材料及試劑：CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)瓶、平皿、燒杯、吸管、移液槍、手術(shù)器械、計數(shù)板、離心機(jī)、水浴箱（37℃）1640/DMEMF12培養(yǎng)基（含10%血清），2%膠原酶II，PBS，酒精本文檔共63頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期二\5點21分組織消化法1.準(zhǔn)備：取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺面，紫外線消毒30分鐘。開始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。2.處理組織：采集的標(biāo)本必須在4H內(nèi)完成。取出6-10cm長臍帶，置于燒杯或平皿中，用PBS液漂洗2~3次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30~60分鐘。本文檔共63頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期二\5點21分3.剪切：用手術(shù)剪將組織塊剪成2~3立方毫米大小，然后再用眼科剪把組織剪細(xì)成1立方毫米的小塊，以便于消化。加入與組織塊總量1：1的2%膠原酶II，然后一并倒入瓶中，封口。4.消化：或用恒溫水浴，或置于37℃溫箱消化均可，消化中每隔20分鐘應(yīng)搖動一次，如用電磁恒溫攪拌器消化更好。消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定。37℃空氣搖床100轉(zhuǎn)/min，1.5-2h本文檔共63頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期二\5點21分5.分離：待組織已分散成細(xì)胞團(tuán)或單個細(xì)胞，立即終止消化，并倒入至少5倍體積的PBS稀釋消化液，隨即通過200目的不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊。2500rmp離心消化20分鐘，吸出上清，加入8-10mlPBS，1000rmp離心5min，吸出上清，加入適量含有血清的培養(yǎng)液。6.計數(shù)：用計數(shù)板計數(shù)，如細(xì)胞懸液細(xì)胞密度過大，再補(bǔ)加培養(yǎng)液調(diào)整后，分裝入培養(yǎng)瓶中。7.換液：24-48H后觀察細(xì)胞是否貼壁，如已有部分細(xì)胞貼壁，可換液繼續(xù)培養(yǎng)。本文檔共63頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期二\5點21分2、傳代細(xì)胞培養(yǎng)傳代前的準(zhǔn)備1.酒精，棉球，鑷子，雜物盒，試管，吸管筒，離心管，培養(yǎng)瓶或板，計時器，筆2.0.25%胰蛋白酶3.含血清培養(yǎng)基，PBS本文檔共63頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期二\5點21分傳代步驟（貼壁細(xì)胞）：1.鏡下觀察細(xì)胞生長至融合狀態(tài)2.吸出舊的培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)液或PBS清洗兩次（切記要清洗干凈）。3.消化細(xì)胞：最常用的方法是在培養(yǎng)瓶中添加1ml0.25%含EDTA的胰酶，培養(yǎng)箱中37°消化5-15s?？筛鶕?jù)不同的細(xì)胞類型調(diào)整消化時間及程度。在電鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞突起回縮，細(xì)胞之間間隙增大，細(xì)胞近乎縮成圓形即可。本文檔共63頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期二\5點21分4.終止消化：立即加入含有血清的培養(yǎng)基，用吸管吹打分散細(xì)胞，吹打動作不可過猛，力度要適中，否則容易損傷細(xì)胞并產(chǎn)生能傷害細(xì)胞的氣泡。5.1000rmp離心5min，棄上清。6.用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度。本文檔共63頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期二\5點21分3、培養(yǎng)細(xì)胞生長狀況的觀察常規(guī)觀察：培養(yǎng)液顏色（是否變黃）生長增殖變化（經(jīng)歷到哪個時期，長滿否）形態(tài)變化（透明度、折光性、細(xì)胞輪廓）微生物污染（細(xì)菌、霉菌）可用顯微鏡觀察活細(xì)胞及其動態(tài)本文檔共63頁；當(dāng)前第55頁；編輯于星期二\5點21分細(xì)胞生長狀況的觀察細(xì)胞計數(shù)：當(dāng)待測細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。

本文檔共63頁；當(dāng)前第56頁；編輯于星期二\5點21分1.

將計數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板。

2.

將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間，靜置3min，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。

3.

計數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計左側(cè)和上方的。然后按公式計算：

細(xì)胞數(shù)/mL=四大格細(xì)胞總數(shù)/4×104說明：公式中除以4，因為計數(shù)了4個大格的細(xì)胞數(shù)。

公式中乘以104因為計數(shù)板中每一個大格的體積為：

1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）=0.1mm3

而

1ml=1000mm3

（注意：鏡下偶見有兩個以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個細(xì)胞計算，若細(xì)胞團(tuán)10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液本文檔共63頁；當(dāng)前第57頁；編輯于星期二\5點21分細(xì)胞生長曲線（細(xì)胞計數(shù)）細(xì)胞周期（流式）細(xì)胞分裂指數(shù)（細(xì)胞群中每1000個細(xì)胞中的分裂相數(shù)）細(xì)胞貼壁率本文檔共63頁；當(dāng)前第58頁；編輯于星期二\5點21分4、細(xì)胞凍存、復(fù)蘇及運輸及時進(jìn)行細(xì)胞凍存十分必要：細(xì)胞一旦離開活體開始原代培養(yǎng)，它的各種生物特性都將逐漸發(fā)生變化并隨著傳代次數(shù)的增加和體外環(huán)境條件的變化而不斷有新的變化。細(xì)胞冷凍儲存在