抗原多肽的設(shè)計(jì)偶聯(lián)策略

1抗原多肽的設(shè)計(jì)、偶聯(lián)策略抗體是生命科學(xué)研究中不可或缺的工具之一，應(yīng)用范圍包括蛋白質(zhì)表達(dá)檢測和鑒定、蛋白質(zhì)加工、蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位、免疫中和反響、蛋白質(zhì)同源結(jié)構(gòu)域研究、蛋白質(zhì)純化以及疾病的免疫診斷和治療。盡管抗體的制備過程不存在技術(shù)難點(diǎn)，但是抗原的選擇以及所制備抗體的用途對能否獲得一個(gè)優(yōu)質(zhì)高效的抗體至關(guān)重要。以下將對抗原多肽的設(shè)計(jì)、偶聯(lián)策略等逐一介紹.抗原設(shè)計(jì)首先選擇適宜的多肽序列，明確最終產(chǎn)物的用途對選擇序列非常重要。如果僅僅需要生產(chǎn)針對蛋白質(zhì)某個(gè)區(qū)域的特異抗體，比方研究蛋白質(zhì)N端的前提物，我們就需要設(shè)計(jì)N末端的多肽抗原。如果抗體的使用目的是識別修飾的氨基酸，如磷酸化的絲氨酸、蘇氨酸或者酪氨酸，乙?；嚢彼岬?，就必須對多肽進(jìn)行相應(yīng)的修飾。如果抗體最終用來識別自然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)，對抗原的設(shè)計(jì)就要求更高。一般情況下抗血清能夠識別用來免疫的多肽序列，但是不一定識別蛋白質(zhì)的折疊結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的抗原決定簇一般由6－12個(gè)氨基酸構(gòu)成，呈連續(xù)性或者非連續(xù)性序列。連續(xù)性抗原決定簇由連續(xù)的氨基酸序列構(gòu)成，而非連續(xù)抗原決定簇包括一組非連續(xù)氨基酸，這些氨基酸由于蛋白質(zhì)的折疊而形成在空間上相互毗鄰。針對連續(xù)性抗原決定簇的抗體能夠識別沒有被埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的序列，而非連續(xù)性抗原的抗體能否識別抗原決定簇取決于用于抗體生產(chǎn)的多肽是否存在二級結(jié)構(gòu)。氨基酸序列的親水性、表露性、柔韌性決定了多肽的抗原性。許多水融性的自然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)其親水序列暴露在外測，而疏水性氨基酸序列包埋在內(nèi)部?？贵w結(jié)合蛋白質(zhì)外表的抗原決定簇，另外抗原決定簇柔韌性比擬高。蛋白質(zhì)的C末端經(jīng)常暴露在外測并且有較高的柔韌性，因此經(jīng)常被用來作為抗體生產(chǎn)的抗原。但是如果C末端是跨膜蛋白質(zhì)的膜內(nèi)局部，該序列可能由于疏水性太強(qiáng)而不適合用來作為抗原。同C末端序列類似，蛋白質(zhì)的N末端序列也經(jīng)常暴露在蛋白質(zhì)的外表，同樣為首選抗原序列。預(yù)測蛋白特性〔例如親水性、疏水性〕及二級結(jié)構(gòu)〔例如α－螺旋，β－折疊，β－盤旋〕的一些算法有助于選擇表露性較高，有抗原性的內(nèi)部序列以用于抗體生成。常見預(yù)測性算法有如下三種，Hopp及Woods所描述的親水性曲線給蛋白序列中的每一個(gè)氨基分配一個(gè)平均親水性值，對于一系列的相鄰氨基，平均親水性的最高點(diǎn)通常就位于抗原決定簇或在其附近。Kyte及Doolittle所提出的另一算法略有不同，它主要是衡量蛋白序列的親水性及疏水性趨勢，該算法對于預(yù)測某蛋白的外部及內(nèi)部區(qū)域非常有用。蛋白的二級結(jié)構(gòu)那么可以通過CHOU/FASMAN或LIM所提出的算法來預(yù)測。表露性或易接近區(qū)常常和螺旋區(qū)或延展的二級結(jié)構(gòu)區(qū)相鄰。并且，具有β－盤旋或雙性螺旋特性的序列區(qū)也具有較好的抗原特性。目前有許多商用軟件包都使用了這些不同的算法，例如MacVectorTM，DNAStarTM及PC-GeneTM。要想預(yù)測準(zhǔn)確，不能只使用一種算法。結(jié)合各種不同的預(yù)測方法來預(yù)測抗原性區(qū)域，可使成功率大大提高?？乖詤^(qū)域確定以后，接下來要確定多肽的長度。關(guān)于選定多肽長度有兩種不同的觀點(diǎn)。一種觀點(diǎn)認(rèn)為長的多肽〔20－40個(gè)氨基酸〕比擬好，因?yàn)殚L的多肽無疑會增加抗原基的數(shù)量。另一種觀點(diǎn)那么認(rèn)為小的多肽更有效，使用小的多肽能保障所產(chǎn)生抗體的位點(diǎn)特異性。但有一點(diǎn)是明確的，不管長度如何，所選多肽必須能夠較容易地通過生化合成得到，并且能溶解到水溶性緩沖劑進(jìn)行載體蛋白的耦聯(lián)。由于受副反響的影響較大，高于二十個(gè)氨基酸的多肽通常很難進(jìn)行高純度合成，并且常常會含有缺失性序列。另一方面，太短的多肽〔<10個(gè)氨基酸〕那么會產(chǎn)生識別特異性很強(qiáng)的抗體，以至于無法識別整體蛋白，或親和性很低。因此綜合考慮制備性抗原地多肽有效長度一般是10－20個(gè)氨基。這種長度的多肽序列會最大程度的減小生化合成困難，具有一定的水溶性，也會具有一定程度的二級結(jié)構(gòu)?？乖瓬?zhǔn)備－耦聯(lián)方法化學(xué)合成的多肽抗原是小分子，本身很難具有好的抗原性，只能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生很弱的免疫反響，因而與載體蛋白耦聯(lián)是很重要的。載體蛋白含有很多抗原決定基，能夠刺激T－幫助細(xì)胞，進(jìn)而誘導(dǎo)B－細(xì)胞反響。用于與多肽耦聯(lián)的載體蛋白有多種，其中最常用的是keyholelimpethemacyanin(KLH),牛血清白蛋白〔bovineserumalbumin，BSA〕,卵清蛋白〔ovalbumin，OVA〕和牛甲狀腺球蛋白〔bovinethyroglobulin，THY)。KLH具有更高的抗原性，是最為常用的多肽耦聯(lián)載體。BSA也常用來作為多肽載體，但由于BSA經(jīng)常被用做檢測試驗(yàn)的阻斷劑而使得該方法生產(chǎn)的抗體在應(yīng)用上存在著一定的局限性。經(jīng)設(shè)計(jì)挪合成尿性多精肽常凍常被多忽略役的一油個(gè)方爸面是責(zé)如何往將多絕肽耦總聯(lián)到矛載體調(diào)蛋白淋上?；ɡ缑?，N采－端稻序列養(yǎng)需要付通過輕C－勢端氨慰基酸鋸耦聯(lián)無，而找C－芬端序壟列那么迅需要因通過童N－尸端氨毅基酸針耦聯(lián)石。內(nèi)砌部序梁列那么槳可以穿耦聯(lián)蛙到任企何一胞端。熄內(nèi)部控序列內(nèi)耦聯(lián)胖的另辮一考侵量那么臘是將期非共握軛端慮?；锘蚓戆被摶?，版因?yàn)榭淘八嚢追痔鹤有蛑橇兄行尾粫己星粠щ娯?zé)荷的聽末端艷。最航常用涌的耦呀聯(lián)方丹法都蘿是基乒于自柔由氨炎基(怎al企ph桶-氨稈基疊或港Ly天s)春、s煤uf習(xí)hy砌dr舊yl恭(逐Cy嘉s)坦或羧蝕基集封團(tuán)(悲As市p,纖G家lu繡,餓或認(rèn)al凳ph刺a-夕羧基漂)的偏存在暑。所勵(lì)有的通耦聯(lián)柿方法顫都應(yīng)秧該是萄通過摔羧基厚或氨晌基端撇殘基潑將多擾肽耦鬼聯(lián)到鞋載體努蛋白胞上。毅所選諒序列關(guān)不能煮有多罰個(gè)殘店基都李能參槐與所貼選耦森聯(lián)化周學(xué)反間應(yīng)。佳如果駝多個(gè)遮反響絮位點(diǎn)永存在親，可怖以考貪慮將失多肽繞序列獲縮短俊，或汪者選蜘擇所江有反枝應(yīng)位扒點(diǎn)都團(tuán)位于要一端元的多畫肽。青對于斯內(nèi)部慧序列惠通常道會使責(zé)用離浙所預(yù)辦測抗誤原位嬌點(diǎn)較那遠(yuǎn)的導(dǎo)一端如進(jìn)行朋耦聯(lián)硬，這圍樣可思以避典免可篇能的顛屏蔽料問題脾。愛除非時(shí)研究洪人員誤另做頃說明肺，我致們通記常使竟用E故DC幕(靈1-辦et臘hy災(zāi)l-亮3-芝(3剖-d夠im套et租hy建la蹦mi頂no奔pr乖op姿yl腰)比ca選rb物od鼻ii孤mi犁de承h塑yd嚼ro驗(yàn)ch似lo紐ri查de河)或啟ca犁rb活od挨ii紋mi收de偏方說法將否多肽添和載舟體進(jìn)既行耦森聯(lián)。勾Ca劃rb總od報(bào)ii怨mi戚de火s能將激活屯天冬合酰胺飼酸及跪谷氨侍酸的井側(cè)鏈之羧基打集團(tuán)釣及末膚端羧糧基集塵團(tuán)，夜使之顯與主厭胺基騙發(fā)生振耦聯(lián)錘反響拋。激騾活的說多肽閣與載洲體蛋者白混張合而叨產(chǎn)生掙最終嘉的共幻軛體反。如費(fèi)果載戒體蛋曉白先喘被激超活，疏ED念C方吊法那么訪通過誠N－襪末端印al繩ph應(yīng)a－鑰氨基肆，或霧者，保如果勻序列礎(chǔ)中有肝賴氨示酸的嫁話，海那么可拔以通遺過賴尸氨酸葛的側(cè)專鏈氨泰基與封載體捧蛋白價(jià)耦聯(lián)朽。m扇-M貪al攀ei佛mi薪do闖be政nz慨oy撒l-芒N-監(jiān)hy感dr抵ox眉ys務(wù)uc拌ci澇ni愁mi礎(chǔ)de塊酯危(M貢BS套)是顧一種正雙性粘多肽友耦聯(lián)饞試劑瞧，可邪以將語多肽身與載稼體蛋叼白通曾過半哥胱氨亦酸耦姿聯(lián)。采耦聯(lián)剖發(fā)生箏在半趙胱氨冷酸的俗硫醇困基。念如果惱多肽反序列唉中非凡包括睜半胱壁氨酸凳，可執(zhí)以將批一個(gè)倆半胱薄氨酸危加到棚多肽果的N猾-端每或C棄-端劫，以爹獲得粥可控吹性更楚強(qiáng)的致多肽晨與載松體蛋昆白的碗耦聯(lián)染。為轟了合肺成方鏟便，艷我們塔建議肆將半用胱氨擺酸加史到多含肽的購N-朵末端永。戊擾二醛撞是一姐種雙牢作用彎耦聯(lián)跪試劑嗚，可莊以將仿兩個(gè)童化合翻物通未過氨之基集兩團(tuán)耦槳聯(lián)在漠一起據(jù)。戊應(yīng)二醛古能起竹到非方常靈杯活的傷間隔鍛多肽身和載據(jù)體蛋賓白的圓作用土，時(shí)該多肽司能盡均可能菜的暴蓄露給鈔免疫貸系統(tǒng)復(fù)。但忽是，債戊二孤醛是無一種栗反響排性很誤強(qiáng)的癥化合童物，胡可以急和C雪ys攤,盾Ty爬r及橋Hi榆s等劈氨基爽酸發(fā)挑生一蠅定程堆度的厭反響張。反條應(yīng)后搭會形強(qiáng)成結(jié)佩構(gòu)很膠難預(yù)解測的點(diǎn)共軛悼體。枝因此敢，如軍果多悔肽序浴列末刃端只專含有日一個(gè)賊單一嫂的自播由氨懲基時(shí)僻，戊置二醛堤方法役非常貼有用騙。如桃果多取肽含麗有多港個(gè)自吼由氨桂基集飲團(tuán)，葉會形化成多租聚合第物，年結(jié)構(gòu)賤很難期預(yù)測島，盡貴管有荷很高途的抗博原性酬。排因?yàn)橄cB悉SA戒耦聯(lián)餐的多瞧肽刺包激產(chǎn)療生的慚抗血竭清也暗含有捎針對倆BS捐A的痛抗體匪，一距次可枝能導(dǎo)打致假棵陽性緒結(jié)果卻。盡脆管K那LH罷較大舞并有淚抗原魚行，鎖但它坦在耦是聯(lián)過協(xié)程中趁可能出會沉率淀，蛛因而陣有時(shí)直候會絞很難鉗處理腹。卵妄清蛋建白〔雙OV恒A〕南是另師一種蝦可以兆使用禿的載令體蛋府白。聽當(dāng)要目檢驗(yàn)薯抗體肅只是珍針對嗽多肽宮而不洲是針殊對載翼體蛋咸白時(shí)傘，O躁VA怖時(shí)用支作第疾二載鳳體的耀很好腔選擇喘。當(dāng)餡要將青抗體榆抗載減體蛋益白的擊反響矛降到團(tuán)最低研時(shí)，虧可以金使用希兔血拜清白戰(zhàn)蛋白冠做載掌體。懼用R暫SA遇耦聯(lián)王體免匠疫過啟的兔蜻子不禍太可聚能產(chǎn)去生針芒對載浮體的晌抗體啊，因螞為R晝SA閣是兔株子自賴身的晴蛋白愚。如假果注擾射動(dòng)極物不熊是兔預(yù)子R道SA獎(jiǎng)那么不液會被憑認(rèn)為殲是自圾體蛋扔白。煙免疫鉤系統(tǒng)蠟是對紀(jì)多肽脹－載楚體蛋臺白整園體發(fā)亭生反案應(yīng)的樂，即檔免疫淘反響挑有一翻局部鵲是針姥對耦泉聯(lián)多灑肽，偏一部應(yīng)分是侵針對氏中間母連接豪體，泥有一撐局部是是針溪對載穿體蛋蹦白。點(diǎn)當(dāng)用廟EL櫻IS詳A憂做篩前選時(shí)載建議濃使用禿不同導(dǎo)載體透蛋白似耦聯(lián)顛的多脂肽聚般合物蒼。如宮果E讓LI詳SA導(dǎo)是在駐非耦碼聯(lián)多編肽涂赤層的術(shù)多孔葡板上薦做時(shí)斯那么沒賺有必絲要這紡樣做幕。城多抗盟原位故點(diǎn)多近肽弄MA拐P稍體系羅代表表著生摩成抗賞多肽狹抗體冷的另槐一種途獨(dú)特出方式皇。該站體系隊(duì)基于陷一個(gè)論小的釘無抗宅原性齒的多成分枝剖賴氨碧酸核塌，在粘該賴桃氨酸遙核上魄同時(shí)編并行易合成述了多溜個(gè)多允肽。燙其結(jié)希果是尸形成攝了一繞個(gè)三迅維大腳分子專，因兄為它味有很浸高的支多肽抬抗原版比例筐，因馳而不鏡再需訴要使調(diào)用載己體蛋內(nèi)白來鴿誘導(dǎo)冒抗體枝反響宰。每蠅一個(gè)狡核分菠子可堡鏈接轎四個(gè)衰相同瘋多肽涉。錢理論雖上講蠶，與貢耦聯(lián)獨(dú)到載慘體蛋片白的換單分攻子多驚肽相萄比，劉ＭＡ切Ｐ具注有一追定的濁優(yōu)勢迷，因字為Ｍ丘ＡＰ坑的賴鄭氨酸竿核與臺多肽聽抗原汗相比活顯得零很小斜。這撕樣抗芽原的趟濃度笛就會屈到達(dá)瘦最高袋。因普而M拿AP律體系朽具有勺很高叔的抗科原性習(xí)，與曬耦聯(lián)皆到載娘體蛋許白的士單分嗓子多呼肽相毅比，腔具有據(jù)很高懷的有蝴效抗拉原濃駁度。訪有一您點(diǎn)要疲指出騎的是忽，Ｍ本ＡＰ束體系非在合延成是搏可能塊會有沸問題斧。賴觸氨酸科核的義多分聯(lián)枝性獅允許忠多拷御貝多限肽的挺合成辟，但負(fù)如果臟合成圣的多已肽較歪長，訴位阻跨(現(xiàn)畝象)休會成機(jī)為問擾題，瘋導(dǎo)致蠢該多塵聚體惑的有蒸些肽塌鏈臂割喪失五氨基撇，成惡為缺販?zhǔn)岳钱a(chǎn)品顫。復(fù)貨合體駕的高吉分子統(tǒng)量使頑質(zhì)量對控制故措施施〔質(zhì)鏟譜偶或棋分析說性H帳PL鍬C〕軋很難貨實(shí)行術(shù)。M奏AP栗的間僅接合的成那么妥解決蜘了分匠析問或題。舊間接昨合成迎時(shí)，聰多肽偉首先般合成瞎、純劉化，物并作寨質(zhì)譜渾或弱H趟PL鏟C分深析。雜合成栗的多硬肽抗蜻原再狀通過耳Cy演s鏈取接到邊賴氨器酸核扒上。酬動(dòng)物云選擇餡要生排成好播的抗倡體，執(zhí)必須譯選擇朱與抗眨原源否差異捉較大糞的動(dòng)摧物。哈要想萍獲得妥最大啞的免基疫反僑應(yīng)，言絕對轉(zhuǎn)不能幼讓免惠疫動(dòng)紡物對糾抗原昆產(chǎn)生的‘自像體識席別’掉。例慰如，無要想糾生成堆抗人刮體蛋勺白的盡抗體專，使圍用兔溜或老純鼠比招使用叢猴子邀要好漫。對裳于非權(quán)常保瓜守的閣哺乳響動(dòng)物扮蛋白缸，使?fàn)C用鳥在類動(dòng)竹物〔怪如雞?！承Ц^薯好。是動(dòng)物父免疫濁我們色通常摘使用唐弗氏歇佐劑煮〔F陵re漲un勢d'紗s〕甜與抗授原進(jìn)盾行混傭合。餓第一刑次注體射完很全使乘用F脹re棚un揪d'半s的慎免疫灰輔助爆劑。漿輔助午劑與研抗原反聯(lián)合幟使用拉，可硬以提并高免象疫反盛應(yīng)，優(yōu)從而憐用較禍少的郊疫苗玉可以桌產(chǎn)生役較強(qiáng)各的免便疫反分應(yīng)。趟佐劑五可以成使抗越原緩丑慢釋錄放，漫從而眾產(chǎn)生粒持續(xù)伶性刺跨激。厲注射憶方式胳為多眾位點(diǎn)盜的皮針下注辱射。哈每只扶注射館動(dòng)物巷都要沃先收煮集免毀疫前規(guī)血樣管，以屋用于賀和以送后的互免疫磨血樣鏡比擬許。所航采集黑的血摟清樣笛本含漿有不疏同的染免疫瘋型和戀亞型己。命抗體勇保存我存儲炭抗體董溶液暈的最睜常見吳問題背是掛細(xì)菌難污染繼。加片0.戚1％揀的疊銜氮化薯鈉保慰護(hù)劑爐那么可告以防竟止污璃染。鎮(zhèn)如果岸您想悲長期熊保存村血清史，建拉議使賤用疊炒氮化直鈉。浙抗體刮血清恨應(yīng)在卷－2池0度獄保存增?？箲M體溶戰(zhàn)液不撿宜反煩復(fù)凍捆融，懲這樣階易導(dǎo)幸致抗傭體失捉活。叢建議庭將血忠漿存盤儲在雨－2喇0度青的季櫻銨氯趙化物壤中。脖在該齒溫度旬下抗焦體可矛以穩(wěn)夕定保倆存多路年。知消過靠毒的腹血清牌或儲看存溫其度為亞－7柴0度洗時(shí)那么把不需嘉要添賠加防廈腐劑剝。當(dāng)桐保存秀時(shí)間光較長哨時(shí)，怪抗體羨溶液逆會產(chǎn)章生一儉種不災(zāi)溶性大的脂士類成況分。跪該脂打類成訊分可愚以通炭過離徐心去霜除。躁如果屢脂類善成分勵(lì)在水扣面上攪形成險(xiǎn)薄膜輸，只洞需將筒水溶園液部擠分取籍出，萬并按蒼上述否方法僚保存燥即可段。加扣入疊想氮化凱鈉保鋪?zhàn)o(hù)劑您的抗斗體溶乘液如汁果形堵成脂輕類薄正膜并長不表喬明細(xì)吹菌污惠染。能當(dāng)血稀清是復(fù)用作術(shù)細(xì)胞套培養(yǎng)墻或體槽內(nèi)研狐究時(shí)饑，那么阻不能門加疊巴氮化秧鈉。期抗體退鑒定王檢測潔抗多挪肽反風(fēng)應(yīng)是賠否發(fā)華生的亮最簡捏單方迷法就桿是抗源多肽染EL時(shí)IS捧A。凳有兩勻種技鎖術(shù)可押以將炎多肽兵鏈接貝到E章LI摸SA專板上抗。第山一種臉方法攝就是社直接習(xí)將多姓肽鏈綿接到撫盤上冷。但棗如果渴鏈接穩(wěn)氨基慨酸恰歇好是揚(yáng)抗原健決定礙簇的旬一部垮分，狂那么抗偶體無谷法和蜻多肽井進(jìn)一應(yīng)步鏈謙接，運(yùn)這樣?jì)D產(chǎn)生慧假陰表性結(jié)羅果的購可能偵性增微加。驗(yàn)第二溝種方劃法那么掛是先襲將多剝肽與肌載體告蛋白獅耦合哨，然膝后將茂多肽濤－蛋炮白耦啊合體歡鏈接些到E鳥LI扮SA廢盤上永。這培種鏈己接方覆法會痕使抗償體－鳥多肽辣的結(jié)耍合成暫功率騾提高蛙，因秀為多拜肽不炎是直豬接嵌猾入盤扮膜，猶因而涌會更談加暴善露給瞞抗體漂。這門種方義法因統(tǒng)而更紗可靠而，可泥重復(fù)寫性更忍高。向需要膠注意爬的是田，用女于該德方法浸的載薄體蛋擇白必竄須不只同于面用于覺免疫雕耦合奮的載址體蛋愉白。望這樣秧會避柳免血河清中采抗載歷體蛋卸白反提應(yīng)所瓦導(dǎo)致踏的高魚背景蘿反響姑。搖當(dāng)做寨血清鋤檢測益時(shí)，霉另一飼點(diǎn)需耐要記干住的國是，域由于虧免疫先多肽瞞與自掃然多充肽結(jié)激構(gòu)上鄭的差娃別，擾檢測疾時(shí)的戶抗多沖肽反對應(yīng)與銹試劑勾的抗衛(wèi)多肽謀反響富可能道是不售同的徹。任陵何檢披測，尺尤其脂是溫測定作滴定茄量以株決定捐收獲巴點(diǎn)時(shí)魔，必忠須包離括針損對天衛(wèi)然狀員態(tài)下城蛋白朱的檢斷測。們當(dāng)然旅可以浙做針見對天燃然狀罰態(tài)下揉蛋白扒的E糖LI津SA顏；但閣由于霸血清笨在不者同檢逝測體創(chuàng)系中買表現(xiàn)珠會不枝一樣斜，因選此最收好在榆血清通被日手常使賓用的腰體系歇中進(jìn)瓦行蛋姻白識偏別鑒凱定。尊如果幫血清索將用困于免促疫沉伯淀反迅應(yīng)，兆就應(yīng)繳該進(jìn)猴行針棒對該玻反響痕的檢水測。蛇抗體賺純化總?cè)缈挂蒲逑壥褂们羞^程反中出巴現(xiàn)很負(fù)高的傳背景求，可宇使用假幾種掛不同碌的方丙法對屯抗血爭清進(jìn)李行純膀化。厭非常拖重要爭的是于首先淺必須玉確定詠背景佩是非糞特異凱性的株，也展就是各說信汁號并很非由消抗血況清對豪多肽車的免詠疫反該應(yīng)造譜成的問。多養(yǎng)肽競塔爭是艘用來材研究接這一紐現(xiàn)象墻的很和好的欣方法膨。循硫酸齒氨沉溝淀損硫酸普氨沉棕淀是精從溶淡液中滾別離設(shè)蛋白乘質(zhì)的假設(shè)常用煙方法禮。這滴是一頓種比眼較原柱始，悼非特詢異性態(tài)別離爭技術(shù)頸，可差以用圣來分勢離大堆局部壇膜蛋尸白，心免疫強(qiáng)球蛋睛白會掏殘留乳于溶歲液中跳。在術(shù)溶液屆中，散蛋白聞質(zhì)會蜂通過倡暴露糊于外國的極童性和霉離子搏基團(tuán)走同水暗分子哄形成婦氫鍵甩。加促入象腿氨或研硫酸良根這霧樣的尤小分躁子可賄以使純蛋白筒質(zhì)失制去結(jié)雹合的退水分項(xiàng)子，灶從而盾使蛋頂白質(zhì)篩從溶去液中福沉淀姥出來串。需紋要強(qiáng)銹調(diào)的點(diǎn)是硫脂酸氨院沉淀奴法難疑以得鞭到高五純度金的抗管體。店其它紙大分額子蛋鼠白和盼混入黃絮狀劃沉淀擇中的茂蛋白搜會造講成對妹抗體玻的污鞠染。金我們正建議棍硫酸巡氨沉溪淀做擺為蛋亞白質(zhì)矩純化鵝的一獻(xiàn)步，軟并采堪用其結(jié)它方兆法對拉得到漆的蛋目白質(zhì)萬進(jìn)行晴進(jìn)一努步純派化。帥蛋白劣A/鐮G結(jié)蝴合法季A論蛋白識或G押蛋白漏對I鞠gG挨抗親體F盞c臂假設(shè)具有梯特異汪吸附肺，此襪特性逆可用閣于純聯(lián)化I備gG獲抗體段。蛋觸白A籌產(chǎn)于央葡萄善球菌臺〔S潤ta造ph方y(tǒng)l惜oc辱oc享cu蜜s憲au澤re燥us猛〕。槳它可飾以吸光附兩盛個(gè)I炕gG幟分子桿。此耐吸附軟基于堤對F匪c臂異的特叼異性嫩，不毀影響趟抗原哲吸附秤位點(diǎn)屠。G鳴蛋白蠟產(chǎn)于饅G型圈鏈球由菌〔掠Gr澡ou稠p踐G噴st從re憶pt霉oc禁oc秧ci殘〕,容G述蛋白遷以同必A蛋燭百類呀似的巾方式績吸附童Ig率G抗識體的岡Fc餓臂。服對不安同物螺種產(chǎn)桌生的釣Ig攝G，奔A蛋主白和憶G蛋響白的搖吸附狠能力廣有一胃定的盼差異記。選慮用方努法前秒應(yīng)對寺其吸挽附能迎力進(jìn)達(dá)行檢駱測。違比方鞏，G找蛋白希適合比羊I趁gG班，但宮A蛋科白不慈具有飯此特谷性。遷A蛋涉白和伯G蛋具白都痕沒有幣對雞漆Ig昨G的做吸附拔能力裁。從柱A蛋島白和輝G蛋斃白柱阻上洗惰脫抗炸體時(shí)洪，須請非常柳小心尖，以聽免抗拿體變弄性。孩免疫皺親和節(jié)純化奔法校免疫離親和綿純化冤法是如用于慣從原廚血清盼中分偵離抗押原特安異性款抗體喘的最閑長用沫方法頑。同畝A蛋菠白和興G蛋亞白不狐同，威這種守方法散不能狀取得吉非特演異性購的I壽g部虎分。結(jié)在此秤方法克中，點(diǎn)多肽灘抗原轟首先瓜共價(jià)首結(jié)合頸于分鑄離柱慶上的喝固定皮相。去這樣息，多險(xiǎn)抗樣里品中啦對此朝多肽灰抗原撇有特雜異吸嘩附的蠟抗體尊將由鉤于同蹈抗原搞的吸孫附而鎮(zhèn)留在盈別離膝柱上刪。鑰未能股結(jié)合策的抗拔體將從從分贏離柱州上首常先被興洗脫酬，進(jìn)誼一步風(fēng)洗脫坊將得蕉到特沖異性留抗體顯。用甲免疫便親和假設(shè)純化雖法得富到的撞抗體陜具有說很高餅的特腿異性洞。使喇用此籠方法般時(shí)，星會由蒼于洗無脫條示件的曠選擇禿，有廳時(shí)造抱成所觀別離民抗體筍的失驚活。動(dòng)所以嫁，比省較提態(tài)純后舍樣品疫同原消血清誓的抗格體活比性非設(shè)常重社要。萍常見呢問題藥1．奔采集示到的沾血清乒呈現(xiàn)需紅色箏，是列什么儉原因霉造成胸的？月對使穴用有始何影局響？資如何找去除停？

糠紅色奉是溶黃血造蠶成的年，也獅就是兆在血遺樣采墊集處備理過凍程中妹紅細(xì)注胞裂介解，碰將血蟻色素計(jì)釋放虹到抗性血清煉中。瓣這在聞某些抵兔群捏中時(shí)委有發(fā)崗生，野尤其蒸在較漁難放轉(zhuǎn)血的傻兔子吊中經(jīng)惰常碰寺到。捷沒有凳理由永擔(dān)憂獨(dú)溶血番會影貴響血旗清質(zhì)網(wǎng)量。挺抗血軌清中蛇含有輸血色壽素并杯不會璃影響瑞抗血惹清的守特性確。并烏且任窗何紅屑細(xì)胞私殘留蛛物經(jīng)舊過血贈(zèng)清處穗理中漢的標(biāo)飄準(zhǔn)離像心步潔驟后藏都會詞被去筍掉。徑如果惹需要苦，血湖色素祥可以戲通過莫以下憤方法迅去除荷：往供血清挪中加蒼入4械5％膛(N副H4麗)2話SO有4，奪在4章攝氏書度下停攪拌挎兩個(gè)廁小時(shí)缸。然球后將彎溶液糟離心癥，將償外表申漂浮擔(dān)物去經(jīng)除。匹沉淀照物可退以在義等量鈴的水裳中再池溶解挨，然廊后在膨所選步的測肅試體耐系中祥進(jìn)行倡同步譜檢測類。如吩果抗撲多肽筍反響丹已經(jīng)瀉確定消，那么置可以疏通過飲親和執(zhí)性純趁化將學(xué)非特膊異性壘局部租去除雹。牛值得初注意內(nèi)的是昂，將橡抗體炭從柱箭子上尋洗脫脈所需倉要的賞條件豐有可瀉能會燭使抗烈體變伸性，冠從而步導(dǎo)致因?qū)Φ爸喟椎陌捎H和涂性下堅(jiān)降或噴消失斤。因脫此我喇們建憂議，恥在大倒規(guī)模戒純化瓦血清終前，才可以耕先純掠化一陜個(gè)測搖試樣吸品。毀原始長血清坦比純謊化的協(xié)血清磨存儲喘時(shí)間閑要長涼的多竹?？蓜円栽趮鹦枰械臅r(shí)揪候純稠化一杜定的晌體積糕，這研樣作扯對抗饑體的佳保存士較為怨穩(wěn)妥皂。用交于純裁化的番親和菊柱一完經(jīng)制情備后鮮，可阿以儲質(zhì)存以釀備后猛用。咬要進(jìn)亂行親坊和性兵純化每需要闊將多會肽連宏接到白層析鍵樹脂股上。銷應(yīng)該亂選擇檢什么鼓樣的紹活化昌親和伐性樹類脂呢鏈？我喜們一喉般久推薦腎使用醫(yī)NH隊(duì)2鏈出接將短多肽拼耦聯(lián)繩到樹剖脂柱姜上。熱這種邁鏈接鼻最穩(wěn)標(biāo)定，寶可以傍選擇版NH拿S沖或援CN責(zé)Br島活化濁樹脂個(gè)(P鑼ha賠rm鳥ac盡ia萄B趣io粱te段ch督)進(jìn)沸行親崖和柱脊的抗北體耦膠聯(lián)。亮2．銀如何軍使用皺多肽售親和哨性樹旅脂純距化抗喝血清討？

地在4脂oC除將針血清居離心眼〔2列00舒0x妥g〕骨，以艇去除竟任何賤顆粒銷或紅倒細(xì)胞覺；利亂用P陸B(tài)S極或T掘BS滿〔p傻H7團(tuán).4允〕將禍血清窗按1森:1悲稀釋巡，每狼毫升濁親和稻樹脂爛施用段5免毫升使血贈(zèng)清，合流速獨(dú)不能際超過餃1腐毫升騎/分傍鐘，兔在2猶80嬌nm餐下測承試吸管光度求。將壯未結(jié)課合的蘋局部蚊按2府-5虧倍的首比例錄重新瘦過柱千。在酒4o禍C時(shí)車耦聯(lián)附效率壞最高個(gè)；收片集未蔥結(jié)合斤材料鴉，利看用濃螞縮裝溪置〔叉>1俘0k判d〕因進(jìn)行逗濃縮莊，以欺備測雅試；括利用稿0.窄2M慌氨基危乙酸惱〔g洲ly烏ci定ne擋〕進(jìn)悄行洗燥脫〔纖pH活1－紹2〕今，在顏pH磨2.薦0時(shí)茂開始斑洗脫雷，在像吸光塑度降門到基寒線以督下時(shí)夾收集揮洗脫襯液。慰將洗甲脫液鍬的p擾H降汗低0守.5卡-1狂，直軍到已柿沒有侍可檢冠測到截的抗昆體從脹柱上種洗下斷來；遙收集疼從純減化柱班上收壘集的估各個(gè)雪局部才，收胸集后回通過望參加記1/幟10蠢體積縫1斃M撥T跌ri父s-哪HC撕l〔屈pH右=8葡.0洞〕濃或p躍H屯8.趨0修的洗氣脫液衰將其鞏中和紅；將雹純化兇的多斤肽進(jìn)淘行E堤LI耳SA沿分析乓，以特決定低具有擺最高鑄親和象性的會洗液炊局部紡。將泳適當(dāng)享的抗天體洗債脫液慧濃縮嬸至2掏-5聯(lián)mg紋/m披l，貪混合訊50任％甘來油在治－2烈0o聚C下仔保存行，或紙混合疊0.望1%設(shè)B扔SA饑在4腰oC羊下保隆存。姻參加謙0.酬01他%至Na魄N3族作為繭防腐嚴(yán)劑。悅3．叛看起舅來有輝些渾綢濁的亮血清胞是否泉還可話以使舊用？浴一般念來講嶺，這今不會軌是問賞題。勺使用牽前可窯以用經(jīng)0.境2形m的古過濾裝器去中除血暖清中劇的小取顆?；贏n照ti母ge事n抄de衰si駁gn逼&京s筒er選a拋pu裁ri透fi藏ca街ti浩on蹤An婦ti寸bo找di吐es宗t藝o投sm臟al銀l防pe化pt絮id蘇es喚h烤av攪e亞be糠co我me鏡a康n捏es襖se掘nt改ia同l思to除ol富i停n搖li爹fe秒s寒ci還en巧ce戒r策es擱ea壤rc池h,蚊w躁it士h饒ap榮pl建ic通at扁io國ns慚i并nc逢lu穗di喊ng封g古en錄e囑pr守od王uc沾t材de唯te她ct嬌io改n澇an療d諷id臣en跪ti負(fù)fi鼠ca德ti濁on久,筆pr司ot作ei柜n俗pr墨oc右es組si認(rèn)ng閉s晴tu選di跡es何,枕di萌ag撐no鋸st剛ic而t山es值ts徒,梨pr屠ot色ei待n駕lo決ca堅(jiān)li筒za棋ti懷on踏,抬ac緒ti燭ve奪s塞it柔e制de袋te焦rm齊in己at沿io藥n,桶p絨ro引te憐in虛h液om舒ol毅og騾y齡st璃ud嘗ie爐s亮an項(xiàng)d帆pr暗ot呢ei鵝n滔pu醒ri影fi煌ca情ti詠on格.煤Wh踢il器e給it復(fù)i徒s芳qu荷it井e雷ea茂sy圣t色o原ge字ne鮮ra灶te悅a廢nt貸i-缸pe標(biāo)pt抵id菠e彼an陷ti效bo座di貝es悠,姐it服i爛s遣im述po丸rt煤an芳t剃to驅(qū)c潛ar痰ef融ul綿ly褲c告on岡si薦de濃r億th陪e幸ul死ti腹ma厘te兩u遵se鄙f雄or木t豪he陣a冒nt蹲ib腦od負(fù)y季an壇d仇th臉e漏se墨qu霜en濟(jì)ce肥u飄se萄d宏to素e眾ns聾ur埋e溫su勉cc銀es隊(duì)s.絕T滔hi付s所te著ch慌s忙he獎(jiǎng)et謝w暢il粥l(xiāng)扇br為ie注fl弦y康ex夫pl侍or瘡e朋pe肺pt襲id悲e孩se債le距ct唯io衡n宮an欺d娃de拐si寬gn掠,桂co暑up趣li示ng冬s柳tr妻at供eg束y,衣a律nd紗c蠢ar凍ri吊er旱p轉(zhuǎn)ro股te糞in版s混wh嚇ic梢h岡ar挑e惰im社po派rt傻an旦t渾fa肯ct嘴or六s培in捎a默nt季i-婚pe軟pt緒id協(xié)e屢an鈔ti根se予ra襖g口en貿(mào)er參at搬io仙n.懇S戀er望um鄰p釣ur顆if紹ic鵲at鋒io禮n追wi申ll被a白ls季o語be間d害is懇cu買ss蝦ed泉.巾Fo咳r憐mo勸re踩c蜂om梯pl頭et剖e狐c(diǎn)o任ve紅ra趙ge奔o(jì)慮f額an杠ti料ge捐n辰de瑞si趨gn秘,伸pl誦ea客se慢r時(shí)ef尼er舌t循o已th啟e加Re雕fe析re還nc監(jiān)es栽1,千2樂.撫Pe碎pt孟id柄e猴Se肉le島ct孫io鐮n將an歷d撥De與si竿gn容Th屯e沙fi租rs煎t凡st麻ep那i幼n搖th剛e哨pr胖oc墊es樸s努is剩t辣he挪s蕉el滴ec陪ti旁on讓o糖f谷th市e兔ap貞pr盼op竄ri做at壤e辦pe課pt汽id兆e唐se撇qu兆en捎ce淡.亞At搜t茅hi兼s診st畜ep電t粗he窗u于lt燙im增at降e假設(shè)us拔e藥fo財(cái)r鍋th交e阻an賽ti曠bo爹dy罰m吩us銷t仗be撫c乏on酒si竭de它re煌d.販I丈f稼th絕e李an軋ti序bo梢dy田i敏s皆ne買ed呀ed礙t彈o順pr貢ob窮e屢a島sp覽ec出if壓ic毫p煎ro鑼te使in鍛d惹om禽ai絨n戰(zhàn)th蒙en那t究he生c箏ho懇ic祖e消is榮s握im文pl迫e.呼F斧or西e劉xa之mp穗le輸,技if炊o摩ne斥i涌s他st惹ud極yi落ng脫p康ro臨te匠ol用yt童ic格p質(zhì)ro反ce煮ss罰in另g待of串a(chǎn)堅(jiān)n絞N-堤te聲r(shí)m狹in臣al宴p饑re害cu噸rs蝶or涂,訴an掙ti捏bo松di幕es遲a彈ga風(fēng)in滾st夢t槍he舒N暈-t輸er狠mi輝na庫l陪re求gi痛on酬o盛f治in讀te蹲re飄st舊w臂ou普ld胸b駕e鋤ra踏is梯ed戚.犯Li爺ke抵wi擠se偷i聚f稈th聰e浩go芬al綠i沖s速to吉m牲on獵it付or方t蔽he叔p瓣ho客sp獸ho家ry妖la豐ti展on誕s緣ta轉(zhuǎn)te泰o格f董a柏sp皺ec悶if億ic綠s溝eq清ue貢nc梅e,踢a淚nt浮ib估od處ie窄s聽to品t葬he供p宮ho映sp傳ho猛ry故la范te運(yùn)d千se漲qu校en閱ce缺c漿an衫b經(jīng)e接us森ed粒.乎If監(jiān)t衡he圖g鋒oa眠l傻is借t胳o榜ra蒜is掙e罰an茫ti什bo益di屬es鉆t翼ha孤t勇wi妙ll曠r威ec賀og愉ni度ze骨t抵he泛p劈ro值te晝in猾i戰(zhàn)n墨it數(shù)s艱na雪ti右ve敬s付ta盡te沒,魄th互e秋pr跑ob洗le扇m比be膜co穩(wěn)me海s獎(jiǎng)mo駱re盈c盟om晶pl胖ex弱.祥An野ti猾-p紀(jì)ep棕ti蝦de凝a吼nt損ib紡od路ie渾s榨wi且ll布a碗lw喘ay杯s腎re頃co安gn丟iz友e奴th色e炊pe歷pt黑id您e.測H戒ow勁ev勵(lì)er糠,鵲th仰e幻sa仙me伴a貧nt窗ib贏od據(jù)y夢ma早y寧no抬t排re拖co忘gn代iz田e汁th淡e宰se送qu零en催ce社w勿it榆hi循n旱th低e口fo開ld站ed噸i騎nt享ac回t腿pr襯ot柄ei令n.填S堵eq煌ue于nc嘗e荒ep腿it般op稼es最i壩n抬pr置ot麗ei候ns勇g找en懶er掩al窗l(fā)y歉c裕on牧si逐st嚇o挽f棒6-哲12趟a呆mi籌no譯a織ci途ds源a曲nd降c主an床b猛e眼cl隨as只si胳fi眠ed舟a搶s犬co析nt事in享uo葬us籠a躲nd停d寄is饞co垃nt市in懼uo闖us慮.采Co父nt承in答uo竿us外e皂pi踢to滿pe鉆s頸ar郊e貓co燙mp較os那ed歌o噸f招a德co雜nt取ig懷uo駁us加s鼻eq鴿ue偽nc蘭e拉of蛇a氣mi朽no奏a怪ci繼ds腔i亮n怖a扁pr蹦ot胞ei懇n.掀A生nt善i-傅pe墊pt榴id膜e煙an鵝ti雁bo紙di瓦es景w盒il員l英bi纏nd旁t私o耐th載es牢e絮ty芽pe誤s半of獄e鞏pi盞to認(rèn)pe對s系in約t芝he門n絨at指iv溉e牧pr詳ot盞ei韻n于pr毀ov具id懶ed亮t講he播s兄eq覽ue宴nc妥e甜is跌n副ot益b卵ur浩ie筑d槍in便t語he稍i通nt袖er己io責(zé)r慕of陣t房he征p阻ro姜te劉in物.糟Di復(fù)sc信on好ti模nu緞ou倡s奶ep碰it輩op譜es抗c挺on魄si逮st楚o抄f屑a趣gr淘ou位p糠of命a搬mi闖no駝a長ci頑ds陣t松ha茫t扶ar辣e呈no航t炊co達(dá)nt雷ig賤uo間us時(shí)b鋒ut蜓a(bǔ)心re音b陰ro慚ug瞞ht綠t稱og籠et彈he鹿r奴by特f筆ol煌di脊ng甘o卷f在th禁e愿pe誰pt登id厚e話ch農(nóng)ai鍵n疫or趴b疑y駕th掩e藍(lán)ju愚xt圓ap應(yīng)os秒it別io游n雜of駕t糾wo與s局ep陶ar賢at紹e胖po蠅ly秧pe遺pt暮id膝e主ch掩ai河ns松.之An帶ti格-p共ep設(shè)ti餡de售a巴nt注ib殘od反ie掃s艇ma吹y雷o(hù)r抹m犯ay僵n暈ot平r汗ec界og雹ni葬ze億t銀hi形s澇cl鑰as們s垃of遭e獵pi市to淋pe寺d年ep肝en飾di償ng旦o鐘n剛wh志et壞he跡r準(zhǔn)th循e帶pe炊pt戶id陜e眠us達(dá)ed掛f隨or捎a旋nt底is校er巷a蛛ge祖ne驕ra勒ti秀on競h查as丙s押ec售on丟da周ry媽s壇tr徐uc更tu政re將s泄im靈il悄ar繭t少o澇th尸e多ep例it綁op答e挎an暖d/弦or棋i需f完th出e腫pr讀ot脫ei賺n旗ep螞it粱op毒e躍ha撓s揉en脈ou嚼gh捉c夕on敵ti循nu牧ou佳s們se燙qu播en具ce擦f蠶or飼t陡he護(hù)a休nt禁ib糞od鏡y您to倦b銹in茫d芝wi花th被a友l突ow菌er黨a刮ff延in演it醋y.釣針Wh認(rèn)en錘e雕xa使mi經(jīng)ni惹ng臣a個(gè)p傳ro簡te好in躲s語eq祖ue雅nc跟e滑fo蠅r倉po狼te后nt構(gòu)ia慨l潔an警ti族ge仍ni匠c常ep惰it砌op泛es顯,限it搭i敲s杯im酒po植rt疼an淚t興to搶c臭ho般os捷e綱se員qu虹en剖ce走s禿wh繩ic皂h描ar禽e篩hy環(huán)dr云op折hi宗li津c,階s憑ur勝fa然ce鹽-o鼓ri最en含te瘋d,欠a交nd鵝f煎le隔xi傷bl海e屬3飛.暴Mo柱st弱n溪at找ur薪al召ly反o辛cc給ur她ri擺ng輛p箱ro某te陳in岡s爬in飲a豎qu盛eo佛us躍s豈ol穿ut姐io芬ns照h紗av箭e貪th弓ei企r彩hy齊dr賴op窗hi極li謀c椒re識si龜du式es追o詢n幻th界e淚su掏rf紀(jì)ac智e扁an冤d義th淹ei而r拘hy餃dr而op糊ho禍bi瀉c責(zé)re閘si示du俯es榨b交ur稈ie存d勉in謠t鍬he縮i炭nt拴er盲io屯r.扇A絹nt廟ib壁od燦ie艦s帖bi挪nd席t嘆o群ep誦it蠢op齒es業(yè)o球n象th辜e移su度rf派ac叫e粘of暖p兔ro劈te普in朵s.警A附dd饑it燒io掉na拆ll礙y,壞i益t咳ha安s巨be酷en緊s野ho涌wn方t頸ha頭t或ep已it酷op員es格h斥av叮e尚a灑hi愈gh僅d殃eg昨re流e序of分m棗ob渠il囑it純y半4菌.席Be月ca炭us看e襪th撓e雖C-西te害rm飄in柳i唯of結(jié)p突ro蹈te趕in私s眨ar耐e名of蚊te中n喪ex老po驅(qū)se音d誰an勾d厭ha伙ve洲a居h先ig映h壯de棒gr策ee且o卸f合fl巨ex霧ib錯(cuò)il碧it嚴(yán)y闊th猜ey陽a衫re吧u約su響al桂ly饞a轎g筐oo普d君ch捕oi竹ce缺f獨(dú)or干g覺en禁er據(jù)at惱in沉g粘an淺ti艇-p歪ep瞎ti公de干a陣nt隔ib眾od建ie跟s難di狀re統(tǒng)ct有ed睜a凈ga司in萍st綠t模he江i衰nt宣ac挑t攻pr屯ot巧ei脫n.且I遞f野th法e映pr燃o(jì)t念ei碧n錫is萍a瘋n典in象te衛(wèi)gr瘦al永m(xù)眠em猴br突an扒e妥pr賽ot構(gòu)ei曠n夢an走d脹th巡e佳C-滋te粒rm姿in嬌us撿i污s果pa蹈rt系o半f它th婦e融tr喪an揮sm漫em柳br再an損e窩se誓gm序en踩t,孩t倦hi陸s徹se與qu菠en掩ce挨w四il桃l錦be墳t此oo柏h牌yd墓ro唇ph斯ob夫ic錯(cuò)a森nd令n職ot捏a壽g賣oo滴d依ch輝oi冒ce雅.燃Li虎ke道t萬he類C診-t餓er亡mi踢nu播s,失t兇he帆N驗(yàn)-t巴er勢mi鳥nu猜s塔is絡(luò)a纏ls歐o柱fr魄eq抱ue沈nt叮ly脈e鳳xp時(shí)os左ed險(xiǎn)a嚇nd等o強(qiáng)n糕th隙e伐su檔rf贈(zèng)ac部e爸of甲t甚he雙p延ro或te岔in帥m釣ak半in鋸g鈔it于a嶄n蠻id茄ea驗(yàn)l向ca記nd角id言at廟e見fo府r帆an壽ti缸bo撤dy列g(shù)黃en羽er秤at針io絕n.候I旨f紫a賄pr缸o(hù)t廢ei具n棕se按qu療en戰(zhàn)ce堂i些s張de掌ri幼ve濃d岸fr導(dǎo)om嚴(yán)t紀(jì)he土c釘DN旱A(chǔ)誰se燭qu族e(cuò)n徒ce樓,策th斧e虎le宅ad虎er亡s倍eq草ue壩nc迷e妙sh鬼ou嘩ld凈n完ot癥b集e搖in花cl埋ud干ed待i株n德th括e慕se餓qu暑en縣ce舒s子el常ec搞te坐d粥fo趕r寫an姿ti麥bo炸dy圖g式en仆er趣at延io弱n.扛唇Al漿go落ri傳th睜ms么f承or探p街re弄di郵ct尖in防g略pr稈ot惹ei勉n庭ch蝶ar雹ac談te死ri嚷st晴ic擴(kuò)s盜su銅ch亦a北s肆hy布dr榨op夢hi智li叨ci遇ty癢/h讀yd杜ro嶺ph蕉ob欺ic晝it預(yù)y殖an侄d代se梅co抵nd促ar末y會st獨(dú)ru鼠ct泰ur預(yù)e駛re饒gi艇on精s貨su側(cè)ch厘a和s矮al見ph獎(jiǎng)a-沉he炎li萍x,系b損et培a-點(diǎn)sh屠ee更t筒an艱d雞be撕ta劇-t丘ur除n恨ai坊d踩se瞞le壇ct外io看n拜of個(gè)a殲p遭ot湖en啦ti凡al敗ly寫e冊xp擔(dān)os繩ed棵,跨im毛mu沙no地ge耐ni處c案in全te嗽rn閥al以s鼓eq戒ue申nc顯e廊fo糠r存an灣ti烏bo忙dy栽g環(huán)en蓄er稍at瘦io搬n.煌昨Hy她dr遍op劃hi佛li登ci認(rèn)ty養(yǎng)p拳lo獵ts按a魄s逮de笨sc敵ri例be地d浴by朗H辣op霜p第an包d括Wo片od分s間5神a系ss鋤ig成n左an混a鋸ve飯ra高ge擋h貝yd累ro菊ph漠il黑ic鐮it項(xiàng)y態(tài)va生lu太e臉fo蓬r即ea幣ch搬r肯es賴id訪ue惕i滋n燦th多e嘴se室qu影en擇ce疼.企Th賞e已hi椅gh擋es嘗t屑po全in勉t弓of遺a交ve鴉ra熄ge象h貢yd井ro猾ph鬼il罷ic墊it忍y酬fo緒r袍a做se禮ri孕es歡o均f躍co票nt繳ig要uo貨us龍r陸es氏id險(xiǎn)ue巖s塞is鋼u華su攻al航ly蓬a背t凳or育n質(zhì)ea訪r聽an涂a紡nt鳥ig襖en碗ic押d港et瓣er溫mi挽na流nt屑.杜A孟sl長ig精ht錯(cuò)ly朽d殊if走fe滅re偉nt榜a扁lg攝or毫it甲hm促d銀es察cr菜ib勤ed騰b慢y鞏Ky元te底a秀nd觀D慈oo身li愛tt庭le循6瓦e尸va鞋lu啦at固es妄t籌he白h豆yd叼ro宅ph葬il柜ic便a喘nd節(jié)h赤yd樂ro躬ph虜ob郊ic掘t探en充de西nc凈ie母s堪of投t羨he尿s皂eq瘦ue崗nc仆e.浴T帽hi診s轎pr析of證il付e神is恭u扣se我fu肅l蝕fo夫r隸pr腳ed耕ic腿ti荒ng布e龍xt諒er寇io寸r震vs度.齊in決te棋ri諸or紛r切eg彈io久ns腔o適f熊th寬e餅na鋪ti嘗ve維p暢ro瘦te匠in虎.高Se慧co鬧nd敵ar艘y撿st摩ru勺ct鳳ur蟻e補(bǔ)ca步n我be瑞i冬de繪nt紗if精ie憶d昏by攪t歲he毅u臘se杰o總f鴉al話go只ri耳th因ms公d里ev戒el刮op況ed剪b們y鴨Ch釣ou居a洪nd任F輩as現(xiàn)ma棄n宇7激o塊r嬌Li躲m很8燃.往Su驕rf與ac殼e尖re雀gi泰on蜜s周or室r擾eg肚io造ns帝o括f濕hi擁gh臺a收cc撓es見si堤bi林li竹ty字o摩ft片en乎b泡or銳de艙r述he衫li悔ca搭l酒or觀e晃xt鵲en沒de仆d炒se論co感nd現(xiàn)ar燃y冶st拆ru冶ct忽ur互e產(chǎn)re芹gi蠅on唐s.嚇I(yè)拒n形ad脾di虧ti臂on賄,奔se晉qu沾en逆ce吼r醬eg謙io彩ns把w味it訴h承be凱ta桑-t聚ur誤n帖or義a糊mp比hi盛pt窯hi周c互he碎li誼x孩ch犧ar質(zhì)ac妹te踢r竹ha銀ve法b葉ee它n治fo繼un瓣d聽to旺b懶e吐an錄ti拒ge叢ni烈c農(nóng)9謎.摸Ma潔ny杯c竹om早me宵rc爽ia龜l散so面ft雖wa毒re南p咱ac標(biāo)ka撲ge滑s防su揉ch廳a帳s站Ma壽cV看ec誓to癥r遞TM略,袋DN是AS哄ta航r京TM限,卻an悶d究PC撿-G垂en曾e拿TM帶i勾nc形or他po莊ra嫩te統(tǒng)t杯h(huán)e蔬se呆a盜lg恐or你it哄hm帥s.筒T愛o猛be狠s適uc拌es假sf闊ul屑,埋no秘ne劑o從f雅th也e且al端go虎ri沈th領(lǐng)ms您s井ho母ul部d帆be尖u日se挎d遲al嚇on階e.億C腔om龜bi滅ne納d浮us際e羊of蔑t冰he援p嚴(yán)re運(yùn)di懲ct仔iv野e和me兔th襖od鑼s期ma龜y詞re到su微lt熔i膚n答a通su盯cc漠es晌s溜ra植te貫a缸s慣hi任gh油a徐s牌86亞%結(jié)in專p古re墻di斗ct區(qū)in德g焦an系ti枕ge濱ni兇c辯de拴te玩rm元in束an敏ts庫9,動(dòng)10縱.銅On剪ce么t宗he剛p考ro癥te恰in著r零eg棒io懸n找of順i糾nt堪er密es絹t擾ha曬s怖be樣en窗i慨de劫nt蜻if凱ie恩d,唐t嬌he崇l躲en廣gt舒h奶of棚t好he仙p沫ep饑ti蓋de服m橋us漲t塞be賴s摟el耕ec理te毯d.知T靈he蠻re瓦a鳥re魯t前wo找d劍if架fe護(hù)ri迫ng僚t拘ho送ug培ht趕s霞o(jì)n勸t遇he撿t吉op贊ic長o逢f貿(mào)pe波pt乖id文e減le蝦ng樣th糖.撈On嗓e辰su哲gg桂es銳ts負(fù)t框ha欺t技lo金ng邁p供ep溪ti爆de五s踩(2桌0-別40回a家mi欣no呀a洲ci券ds笑i嫁n魔le記ng贏th做)熔ar帖e慚op闊ti押ma眉l部be全ca還us壞e相it霉i知nc怨re撓as吵es詢t瀉he蝦n化um薦be宗r聰of獵p劑os防si殖bl抓e悼ep分it肺op仁es豬.恥Th廉e晉ot候he拍r法su待gg魔es分ts課t務(wù)ha魚t斯sm挑al拌le倘r圖pe瞞pt貪id嶼es償a社re曾s凳uf稈fi帆ci悉en計(jì)t,涼a扯nd辟t紋he絮ir猜u稅se愉e以ns稱ur側(cè)es晴t頌ha績t液th男e解si務(wù)te誤-s蜘pe屢ci藍(lán)fi僻c震ch救ar催ac柱te兔r麻of站a求nt檢i-婦pe厭pt隱id敞e暮an鐮ti看bo拆di乖es肌i虹s苦re疊ta電in午ed慶.控Cl艷ea校rl唉y,屢a鍛ny忙p閘ep口ti舒de阻s構(gòu)el烏ec產(chǎn)te久d恢mu騾st冶b跨e扇ch漂em終ic稅al蟻ly晨s備yn緞th止es但iz燕ab斯le士a卻nd狹s捎ho淋ul產(chǎn)d齊be衡s東ol喊ub桶l(fā)e卻i臉n嘗aq那ue犁ou扮s約bu族ff遲er堆f史or位c據(jù)on估ju雞ga搭ti椅on臘t干o藏th冊e村ca既rr欺ie濁r堪pr盲ot抄ei系n.曠P膛ep鎮(zhèn)ti魄de般s蘿lo扛ng園er鐘t貢ha騙n習(xí)20暢r買es垃id葬ue隆s系in慰l蝴en棟gt屈h熊ar貝e彩of擁te榜n絮mo笛re掩d疑if扔fi扭cu令lt律t千o蒸sy井nt躺he蒼si返ze殼w麥it越h見hi嶄gh詢p嶼ur劑it適y址be梯ca殃us持e委th悼er醒e御is蕉g配re酸at腫er皆p梢ot壁en舅ti獵al散f腎or假s岔id顛e顛re珍ac劑ti就on各s,榜a搞nd通t截he游y楊ar關(guān)e的li摔ke題ly霉t鑒o蒜co獵nt協(xié)ai警n歉de讀le請ti丹on金s掀eq解ue腫nc英es藏.腦On難t夏he犧o肅th飾er呈h鉗an常d,橡s凳ho叛rt橋p風(fēng)ep跡ti北de被s蔥(1矛0訊am述in賢o趣ac統(tǒng)id檔s)鵲m雄ay世g葵en倡er鋒at倘e型an詳ti判bo堂di蕩es獲t廊ha術(shù)t辯ar異e由so占s盈pe瘋ci閣fi榮c動(dòng)in仰t阿he雪ir上r揭ec河og蔑ni往ti爪on軍t偉ha厚t護(hù)th賭ey惑c歷an信no介t訓(xùn)re盾co病gn殲iz燕e品th老e嗓na混ti鄰ve拉p鉗ro握te之in針o宏r橋do泄s溉o動(dòng)wi哈th總l硬ow臥a萄ff眉in抄it設(shè)y.幕T察he虎t卷yp自ic證al津l啄en波gt深h患fo津r場ge帳ne竭ra晨ti偷ng盜a添nt佳i-漲pe電pt漸id夾e練an讀ti枕bo拳di壇es欠i霜s描in飛t吵he壓r捧an融ge介o礦f亮10膚-2墻0侄re其si語du坐es棉.舒Pe各pt蠢id魚e繡se村qu杏en赴ce翼s倦of拉t挖hi盆s程le蠅ng倚th棚m北in我im鏈iz墻e平sy訊nt堂he永si憐s默pr啊ob處le石ms釣,砌ar遣e危re歲as捕on闊ab滑ly幻s精ol臘ub伏le壽i殖n能aq竹ue彈ou種s糟so億lu挖ti梅on乞a蟲nd踩m薪ay淋h痛av報(bào)e粒so合me認(rèn)d鴨eg收re泥e干of蚊s佛ec阻on境da拿ry材s援tr位uc槽tu碗re兇.瑞Co奸up卡li企ng稀S索tr漫at鄉(xiāng)eg狀y影A繁fa省ct賓or昆t項(xiàng)ha谷t伸is怕o插ft毛en混o芹ve云r-藍(lán)lo刃ok營ed往w斷he血n應(yīng)de鄭si園gn訊in債g筋a崗sy床nt眼he頭ti氧c僅pe卻pt賣id托e傍is烈t療he漆m元et遭ho覺d個(gè)of代c依ou游pl衣in灶g絡(luò)th矮e映pe蠟pt樣id忙e羨to帥t鋤he示c察ar良ri磚er汗p蛛ro屆te蓄in怪.獲Fo油r純ex該am濱pl兆e,張N撥-t腎er訊mi螞na烏l旨se柔qu議en笨ce面s敘sh首o(hù)u豎ld柏b鋤e懼co練up還le竿d挪th連ro齒ug腸h燭th卸e貞C-既te變r(jià)m沈in露al支a周mi土no飼a介ci蹲d蓮an脈d從vi結(jié)ce昏v測er篩sa柄f薦or誓C士-t僻er蹄mi梳na純l拼se宏qu肌en梅ce例s.轟I基nt辮er匆na毫l撞se站qu炸en弊ce影s挎ca盼n隸be棒c拼ou蓋pl掏ed廚a俱t旗ei斜th倚er述e虹nd還.冶An刺ot疑he炸r撐co態(tài)ns擋id礙er輕at聯(lián)io支n員fo餡r妻in億te戰(zhàn)rn恒al平s雁eq兔ue堅(jiān)nc噸es表i拿s惰to變a座ce稱tl絡(luò)ya割te圾o笨r否am童id目at踏e司th扒e瓣un漸co道nj鏟ug調(diào)at犯ed布e壺nd旦a屈s極th貸e耕se剪qu火en符ce撲i巖n君th仆e柴na嫩ti仙ve卵p耽ro奪te盟in包m蠻ol剩ec揪ul吳e膛wo立ul傲d裕no讓t勁co鈴nt秘ai誰n經(jīng)a析ch脖ar傻ge畢d贈(zèng)te嚷rm筋in擊us疾.詞Th畝e蕩mo皆st覆c勝om賞mo魔n環(huán)co月up著li嚼ng際m都et烘ho誰ds遙r姜el狗y損on重t抬he枯p牌re菊se屠nc用e炎o(hù)f雖f殘re帳e周am距in卵o積(a液lp族h-畝am撒in順o略or票煩Ly壽s割),劈s守uf會hy謝dr盤yl謠(絮Cy賀s)師,伐or撇c專ar軍bo漁xy漂li萬c泉ac梯id僵g我ro炸up糊s適(A獸sp適,狐Gl廊u,例o增r籠al浴ph來a-雖ca千rb掛ox梢yl饑).群C冰ou駕pl勝in酷g通me塔th味od否s樸sh么ou擔(dān)ld擠b屈e虜us像ed控t絮ha沿t稠li妥nk慚t濾he條p昆ep星ti堡de穩(wěn)t役o你th押e蛋ca私rr繭ie穩(wěn)r勿pr魂ot譜ei迫n依vi依a久th呈e完ca乞rb夠ox刷y-洞o莫r敘am清in披o-異te橡rm除in曾al劫r序es薦id初ue鳳.尖Th購e品se誕qu豐en乏ce輸c踩ho膏se變n參sh爭ou唉ld游n御ot獲h耳av姻e鏈mu揪lt零ip甘le貍r清e(cuò)s著id董ue陳s者th鋸at澡m圍ay侍r除ea糖ct擾w尊it禽h宜th絞e活ch那os卷en燒c列he罰mi撲st嘴ry禿.盟If犁m進(jìn)ul類ti艇pl嫂e互re味ac孫ti陸ve滋s檔it惡es未a忠re真p潔re慕se時(shí)nt恥,仔tr夢y初to茅s叮ho拿rt倘en溜t弦he痛p今ep撿ti呢de簡o腫r時(shí)ch耕oo聯(lián)se沙t最he絨s陳eq叛ue絲nc驚e畜so傷t策h(yuǎn)e陸y石ar艘e洪al競l柜lo師ca伯li踩ze援d際at訓(xùn)e旁it破he害r假th肅e索am芬in添o蛾or宰t流he段c擠ar愁bo蔽xy李l瞎te帳rm寫in貪us廊o你f香th只e屋pe皆pt仿id配e.脆F佛or群i均nt猶er毫na捧l啞se恒qu咽en佳ce蒜s歷th糧e卡en喇d乓fu餅rt蠢he鏈st鍛f揪ro叛m楚th鞭e撿pr富ed抵ic打te階d歡ep敞it指op禿e疾is題n欄or等ma凡ll墊y萌fa慨vo與re咽d孕as外t靠hi哲s校av綁oi冶ds宿p伯ot鐵en屢ti希al拋m販as互ki閑ng亦p季ro紐bl竊em箱s.骨蛇Th鍬e翻ED慘C榴(1攜-e釣th師yl尤-3珍-(場3-燭di加me燈th算yl珍am比in知op泡ro鍬py絞l)白c頓ar壟bo蠢di乒im田id細(xì)e縮hy張dr凱oc言hl惹or哄id百e)頌o羞r瞞ca榮rb漲od指ii備mi愚de脂m焦et開ho頑d暑is派r宴ou描ti盡ne善ly旨u棕se裕d險(xiǎn)in疾t野he季S獄ig程ma活-G粱en打os凳ys展l捧ab辨or要at犯or銅y駱un否le外ss斬o辣th因er擦wi瞇se前s顧ta助te蝦d級by參t投he挪r年es加ea丘rc添he被r.已C韻ar竊bo粒di銹im惹id幅es腳c叢an脅a葬ct邁iv籌at艙e勿th健e滴si影de涼c金ha例in肢c河ar具bo迎xy唯li褲c淡gr廢ou攪ps乖o否f勵(lì)as監(jiān)pa池rt泛ic您a沃nd遙g殖lu釣ta舊mi摘c干ac慮id窯a慕s猶we摩ll疏a籮s咱th招e糖ca佛rb歡oo閉xy伴l犬te副rm蠶in企al黑g巾ro魚up僑t醬o蛛ma慈ke已t背he酬m掛re遵ac巖ti癥ve配s栗it倚es際f泊or注c蔑ou觀pl葵in隱g秧wi西th廢p兄ri陸ma興ry網(wǎng)a撥mi隨ne夠s.籠T侵he辱a壩ct認(rèn)iv抵at捷ed錦p氏ep躍ti旱de寨s遼ar宰e溝mi罰xe繭d產(chǎn)wi支th抱t煤he疤c勉ar辯ri唇er蕉p鞏ro恭te煌in亭t捆o球pr纏od冒uc遲e路th龍e古fi咳na紹l癢co筑nj銜ug完at率e.纖I叮f音th朗e媽ca懸rr彩ie巾r袖pr歡ot子ei彼n朗is燦a舉ct彈iv寶at梅ed煮f魔ir辯st早,設(shè)th米e橡ED接C乒me障th瓦od燥w饑il洲l微co畜up跨le看t錯(cuò)he顫c殊ar沉ri捏er悅p六ro課te罰in善t緒hr芽ou魚gh鴉t盒he聚N但-t次er受mi葉na捎l單al悔ph最a蹲am譯in袍e偶an督d鬼po戒ss孟ib獄ly鮮t把hr劃ou氧gh牙t劉he幟a聲mi替ne根i造n嘩th那么e級si襲de患-c薯ha毛in犯o古f股Ly詳si穴ne而,買if抽p懼re無se畝nt織i厲n垮th吳e欣se轎qu全en紹ce籌.齒Th欺e饞m-畜Ma沫le上im立id偷ob尚en春zo節(jié)yl蒼-N制-h頁yd蟻ro兇xy刪su休cc紅in聾im罷id夏e授es陸te惹r睡(M帶BS灘)稼is值a胃h蓄et槍er壽ob呢if紫un活ct僻io膝na臘l幫re再ag勁en格t戚th韻at蛾c肌an胸b紐e眼us耀ed嚇t案o亮li鏟nk撈p呼ep鐵ti季de善s津to騙c宴ar王ri提er鞏p園ro妖te必in咐s膨vi舌a軟cy帖st老ei阿ne帳s.案T膚he吳c冷ou撓pl稅in床g修ta脆ke要s繭pl祥ac滔e痰wi嫩th動(dòng)t危he跌t帳hi乘ol惰g巖ro這up吉o草f本cy地st繳ei科ne握r擴(kuò)es懂id所ue戰(zhàn)s.釘I晝f看th士e板ch半os猶en藍(lán)s再eq炕ue圖nc彈e劉do炭es箭n燒ot鞏c骨on白ta授in偏C歌ys精i毫t棄is葬c慕om陡mo暢n婚to概p堡la弦ce且a征C謹(jǐn)ys堤r初es弟id奇ue初a絨t應(yīng)th攻e塌N-麻o絮r仁C-洽te魂rm洗in繁us惑t鑄o說ob留ta南in何h詞ig健hl揮y匪co衫nt泳ro候ll拋ed看l支in美ki貸ng俘o漲f星th蛾e卸pe岔pt晝id狐e覆to恭t放he羅c式ar期ri眾er炭p午ro蔽te穴in慎.券Fo鄰r醋sy緒nt殼he棉si闊s普pu鉗rp強(qiáng)os紡es足w炒e涂re拿co常mm哄e(cuò)n臘d偶th浩at洋t塘he總p吩la爸ce剝me腎nt郵o步f芹cy打st喉ei刪ne僚b豈e亞at咐t撤he虛N戒-t蜻er叨mi男nu疤s羨of棋t止he是p無ep瀉ti圈de蘭i第f征po道ss除ib府le驢.否Gl縱ut阻ar玉al蘆de計(jì)hy貴de遲i欺s股a鴿bi怪fu順nc蚊ti封on爺al霞c鈔ou脫pl到in餅g什re旗ag另en娃t扮th豬at戶l些in紐ks話t扒wo譜c術(shù)om現(xiàn)po是un蛛ds吵t悟hr真ou緊gh粘t嶄he獻(xiàn)ir罰a噸mi不no齊g急ro智up睛s.泥G糾lu井ta枕ra姥ld植eh寧yd紙e催pr癥ov軋id片es鐘a員h扶ig宴hl養(yǎng)y葵fl飄ex凝ib勤le慈s屬pa佳ce鼓r轎be袋tw講ee酬n它th知e壓pe備pt蜓id調(diào)e畝an喚d頓ca匆rr屈ie落r寫pr怒ot妹ei懂n顧fo妨r蓮fa難vo出ra有bl神e羞pr戲es屑en且ta享ti艦on竭t濤o壽th愁e衫im挺mu未ne介s衰ys賞te善m.毀U擱nf涌or坡tu慮na決te剃ly贊,連gl壤ut雁ar圍al鍬de東hy間de退i駛s冰a犬ve殊ry修r(nóng)自ea依ct帳iv屈e井co稿mp座ou澆nd被a膝nd受w孩il律l慣re店ac捷t雕wi番th蘆C返ys恐,綁Ty虧r湯an滅d蒼Hi強(qiáng)s憶to贈(zèng)a湊l久im刃it奮ed莖e疾xt殺en喪t.妨T誕he泥r喇es娃ul跌t嚼is鏡a拖p年oo裳rl述y養(yǎng)de自fi池ne今d演co曾nj幅ug語at原e.貓T撓he侍g駝lu另ta牽ra箭ld咐eh睬yd涌e陶me癢th壽od尖i億s飲pa馳rt沿ic岸ul祖ar落ly鋪u冤se抓fu卸l予wh收en顛a征p扮ep翼ti紡de溜c神on某ta姓in接s工on箭ly任a穿s敢in耳gl舒e軌fr就ee校a岸mi延no承g(shù)乒ro禽up孕a掙t夾it交s雹am引in幫o倉te途rm敘in對us魔.螞If筐t繪he輝p很ep兆ti盛de羅c杜on胃ta覆in遭s擦mo恢re飲t鍛ha記n脾on蝦e科fr攻ee省a掃mi磚no述g霉or慮up腫,販la尋rg脊e染mu娛lt尼im鳴er憐ic寇c梢om汗pl疾ex釀es侄c證an來b纏e貴fo有rm輕ed挑,喝wh呈ic伴h仆ar暫e訊no寒t花we奉ll鐘d萌ef鍋in俱ed章,叛bu符t滔ar店e母hi上gh您ly領(lǐng)i齒mm生un瘋og燦en攔ic紛.吵Se把le懇ct穩(wěn)in刻g萍th短e革Pr棟ot相ei壘n翼Ca欠rr旦ie妥r茅Co寨nj北ug撇at呼io勿n鍛to冬a拍c煩ar皇ri埋er罵p萄ro越te黑in徒i鞭s趴im劇po倡rt貸an割t埋be唐ca駝us禽e緩pe兇pt準(zhǔn)id闊es躲a盞re翅s盼ma旁ll草m源ol蠶ec既ul引es鎖,施th星at行a寧lo疑ne饞d禮o改no盟t晨te銹nd隨t返o鋤be桐i首mm鵝un籮og黨en懶ic福,謝th擴(kuò)us祥p絹os潑si庭bl歇y它el保ic梅it悶in駕g簡a阿we刷ak務(wù)i巷mm鳴un錄e港re橡sp雖on醋se賀.園Th士e臂ca度rr盈ie郊r你pr濕ot鈔ei萄n饞co滿nt返ai怒ns宋m吵an慢y財(cái)ep旺it漲op嶺es土t谷ha景t市st兄im形ul宇at駛e臨T-慮he談lp天er瘦c極el常ls越,筒wh忠ic摸h虎he烤lp細(xì)i先nd立uc姜e米th悄e既B-鼓ce張ll退r帆es贈(zèng)po看ns虹e.瞇M蛋an范y榴di吩ff秘er罵en酷t(yī)粥ca鼻rr刷ie帶r扯pr富ot蘭ei呈ns喉c待an狼b鼓e咽us顛ed怒f紹or干c查ou帽pl摔in肥g括to監(jiān)s擠yn貧th挖et客ic雹p戶ep份ti昌de戴s.鬼T誓he共m燙os墨t汗co對mm腎on超ly萌s蹦el婆ec肅te暗d舞ca吵rr愛ie服rs帥a錢re黨k避ey道ho融le格l爸im座pe苦t訪he齡ma豪cy最an吼in方(猜KL泄H)抗a羊nd釋b旦ov未in卷e慈se拋ru定m闖al闊bu開mi惹n商(B粗SA辮).踏T鈴he手h杠ig擔(dān)he頃r(shí)竄im棒mu近no產(chǎn)ge謊ni扇ci璃ty泡o疑f吹KL煎H堂of藏te牧n迫ma岡ke抄s準(zhǔn)it抄t帆he拐p陜r(jià)e自fe滾rr獨(dú)ed撤c洋ho裕ic纖e.問A陳no航th議er壽a眉dv婦an邊ta應(yīng)ge毛o奴f稈ch竟oo鉛si翻ng蜘K沒LH掏o凍ve道r傷BS雅A棗is蒜t姑ha姥t備BS澡A爬is要u賞se葛d療as蟲a恨b縣lo御ck臂in懇g羞ag進(jìn)en異t小in膨m厲an恐y歇ex焦pe曲ri辛me薪nt斷al環(huán)a考ss非ay得s.誘B擠ec務(wù)au跟se孫a沿nt駁is汪er衛(wèi)a燈ra趟is乘ed妹a邪ga約in伸st限p夏ep醋ti獨(dú)de怨s愈co阿nj前ug細(xì)at逗ed魚t勒o淡BS鵝A僵wi劫ll彈a顏ls采o木co吹nt犯ai兩n傷an啄ti瘋bo碌di依es漢t妨o沾BS洋A,燕f袋al眉se畝p轉(zhuǎn)os讓it著iv疑es是m叔ay器r織es振ul也t.鋪A籌lt給ho勻ug榨h溫KL通H壯is膨l膨ar零ge遲a傾nd觀i懲mm欺un跟og河en王ic鎮(zhèn),啄it孩m梢ay美p狀re陪ci喝pi丑ta戲te嚴(yán)d東ur寧in歪g拉cr假os職s-肉li澡nk鏟in姐g,段m繡ak肚in噸g喉it艙d棒if矩fi辮cu陶lt恭t勻o濃ha屯nd賣le前i捐n甜so瓦me胳c低as肌es鼓.毒Ov劉al逮bu戲mi匪n假(O撥VA吉)寺is多a忌no令th樂er懇u恐se洞fu障l昆ca雪rr其ie新r建pr棗ot錯(cuò)ei陪n.瘦I脾t艙is塑a摘g蕩oo催d廈ch揚(yáng)oi升ce低a促s獵a磚se事co摔nd權(quán)c思ar凡ri淡er志p惱ro速te荒in此w柳he欣n樓ve軋ri債fy胃in城g告wh裹et巨he玉r盯an吹ti眠bo州di勿es拔a高re何s匹pe陷ci購fi痕c泰fo爐r狡th煤e植pe匠pt圓id艘e鼠al碑on吊e貿(mào)an疼d熄no穴t緒th君e宏ca危rr甩ie陣r.辟R拔ab唐bi的t賞Se錘ru善m待Al星bu坦mi沒n薯(R衛(wèi)SA喝)決ma迫y斯be湊u限se不d芬wh懂en結(jié)t腥he贊a雕nt饅ib吊od劃y廊re輪sp箱on板se驚t圖o格th躲e陵ca餃rr駱ie留r農(nóng)pr搞ot降ei毛n卸mu倚st碌b帳e濫ke切pt唐t頁o駛a撞mi狂ni慎mu炸m.風(fēng)R雞ab拾bi歪t(yī)s梳i苗mm漁un幸iz要ed槳w冤it駝h畝RS鋒A例co絡(luò)nj柱ug爭at盯e厚ar該e廳le汽ss僑l缺ik渡el巧y令to沒r喊ai肺se岡a叉nt行ib咽od鼠ie圾s白to垂t外he愈c柱ar將ri塞er助,禁as盜t冬he康R屆SA勞i茄s勁re蜻co檢gn潔iz盡ed匪a娃s示"s參el衰f.棚"鏡If恰t誓he社R門SA障c訓(xùn)on擦ju職ga胖te退w肺er對e勇in嘩je熊ct仿ed源i竿nt豬o布an攪ot鍬he撞r青ho次st股,顫th必e朝pr跳ot益ei飲n哲wo右ul肺d污no木t衰be顧r面ec倆og寸ni估ze我d勵(lì)as照s釀el字f.難萌It辮i獨(dú)s爸im左po釣rt順an愛t換to谷r欺ec凱og資ni喊ze嘉t付ha夕t憂th衡e撓im寫mu捷ne輛s傍ys秧te促m勁re銷ac尾ts材t征o遭th肚e摩pe皮pt劫id卵e-呆pr懇ot摘ei賊n華ca論rr和ie秩r胃as秘a役w激ho適le用a盟nd瑞t斜ha羊t鑄th抄er棚e爹wi淋ll應(yīng)b汁e雄a超po癥rt昏io竄n利of刊r醬es惡po寫ns偽e善di向re憂ct骨ed榜a喚ga步in呈st根t碧he仙c三on子ju雞ga出te護(hù)d慶pe動(dòng)pt搖id肯e灣as獸w揪el荒l繼as汽t折he第l塘in填ke騰r桂an甩d腰th優(yōu)e渡ca法rr激ie林r資pr膨ot恥ei夫n歇1吳.拼Wh賺en錢s柔cr奴ee榴ni棚ng血b戲y斗EL穗IS干A檢it戰(zhàn)i吧s呆ad搶vi御sa鉛bl棵e茄to挖u賽se慕a談p枝ep叢ti謹(jǐn)de王c險(xiǎn)on愈ju貓ga援te吸p吃re恒pa歪re旗d桑us歪in能g模a憲di曾ff龍er須en粒t北ca來rr窄ie潔r背pr寇ot料ei狐n.轎T磚hi甘s種is雄n征ot咸n申ec渠es簡sa書ry劍i珍f襖pe怎rf障or慚mi沈ng呢E練LI盒SA化a炊ss繳ay伙s地wh眨er圖e閃th訴e欺pl敞at況es格a萍re尤c物oa教te膛d禽di讓re唐ct株ly求w引it調(diào)h感un退co峰nj琴ug就at里ed襖p鍛ep鏡ti泛de牲.舍Mu旗lt血ip計(jì)le狹A誰nt量ig榆en對ic囑P壯ep論ti想de竿s遮(M榮AP折s)芳Th師e卻MA刑P獨(dú)sy專st蘆em鞏r季ep麗re杯se誦nt蘭s貸a遍un捧iq寨ue準(zhǔn)a翻pp置ro疏ac它h絕to糞a拉nt低i-蹄pe全pt倉id無e帆an畫ti猜bo宅dy鋸g銜en佳er宣at霞io貢n泳11茅.宅Th歉e處sy擊st鉗em水i累s競ba故se裹d葉on榨a夠s遼ma賴ll桌i寬mm順un來og效en查ic繞al旨ly駝i秧ne唱rt測b陡ra拆nc京he匪d布ly遇si撿ne抓c姑or妹e藏on婚to扯w鍋hi敘ch桂m擁ul握ti賣pe源p宜ep卵ti營de端s姨ar懷e弄sy璃nt淚he凱si叛ze勻d制in吩p獎(jiǎng)ar吸al午le告l.擺T作he翁r煉es邪ul完t頓af勾te炸r隔sy牧nt毅he濃si鎮(zhèn)s朗is北a椒t功hr省ee組-d番im貌en心si纖on淡al頑m做ol晉ec程ul淋e,涂w暖hi晝ch蓄h痕as巾a默h好ig棗h血mo制la依r搶ra身ti皮o先of饅p縣ep狼ti亦de警a傘nt夫ig哥en孕t逗o希co唉re猜m罵ol藥ec箭ul姓e婆an尼d嘩th扣er戰(zhàn)ef買or社e告do葬es否n香ot習(xí)r熔eq亮ui勢re銳t昨he倉u旨se竊o連f怎a替ca味rr劇ie其r熔pr陸ot克ei衡n莫to涌i肺nd奉uc鹿e哥an嗽a胸nt凝ib房od爭y襯re炭sp端on質(zhì)se但.拾Ea送ch趕c滑or啄e勸mo加le轉(zhuǎn)cu獸le咬m戚ay炎c驚on挪ta候in嘗f屑o(jì)u你r旨id督en床ti命c(diǎn)a僅l廉pe部pt闖id永es沙.腹In澡t蹄he砌or嬸y,居M葛AP怠h揉as粱a連n窯ad逆va朗nt梢ag敬e咱wh珠en筐c仗om常pa正re育d柱to放i列ts捷m抖on史om奇er族ic播c筋ou資nt丸er毒pa你rt決a額tt耕ac津he拘d恒to厲a偏c埋ar山ri黎er喚p芒ro還te所in臣i鍛n僚th慎at誕t麗he閱l猜ys霞in責(zé)e錫co驢re贈(zèng)o稿f拌a濟(jì)MA