動物細胞培養(yǎng)和核移植

關(guān)于動物細胞培養(yǎng)和核移植第1頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三離體植物器官、組織或細胞愈傷組織胚狀體植物體脫（去）分化再分化（芽、根）植物細胞工程常用的技術(shù)手段有哪些？植物組織培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基：

固體有機物（蔗糖）植物激素第2頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三植物體細胞雜交植物細胞A

植物細胞B

去細胞壁原生質(zhì)體融合雜種細胞愈傷組織雜種植株植物組織培養(yǎng)植物細胞融合1、植物體細胞雜交的結(jié)果是產(chǎn)生了？2、這個過程中涉及的原理是？雜種植株細胞膜的流動性、植物細胞的全能性第3頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三多莉克隆猴第4頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三動物細胞工程常用的技術(shù)手段動物細胞培養(yǎng)動物細胞融合單克隆抗體胚胎移植核移植第5頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三

動物細胞培養(yǎng)就是從動物機體內(nèi)取出相關(guān)的組織，將它分散成單個細胞，然后，放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細胞生長和增殖。1、概念：一、動物細胞培養(yǎng)第6頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)過程示意圖關(guān)鍵詞:接觸抑制細胞貼壁原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)2、過程第7頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三

幼齡動物取動物器官和組織剪碎組織胰蛋白酶處理細胞培養(yǎng)單個細胞第8頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三動物細胞生長特性：細胞貼壁懸液中分散的細胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細胞貼壁。要求：培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿的內(nèi)表面光滑、無毒、易于貼附。細胞的接觸抑制當(dāng)貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞就會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細胞的接觸抑制。第9頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三原代培養(yǎng)(primaryculture)傳代培養(yǎng)

(subculture)動物組織消化后的初次培養(yǎng)。貼滿瓶壁的細胞需要重新用胰蛋白酶等處理，然后分瓶繼續(xù)培養(yǎng)，讓細胞繼續(xù)增殖，這樣的培養(yǎng)過程稱為傳代培養(yǎng)。第10頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三

接觸抑制

(contactinhibition)細胞在貼壁生長過程中，隨著細胞分裂，數(shù)量不斷增加，最后形成一個單層，此時細胞間相互接觸，細胞分裂和生長停止，數(shù)量不再增加。第11頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三NormalcellCancercell第12頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三動物胚胎或幼齡動物的組織、器官細胞懸浮液（單個細胞）胰蛋白酶動物組織細胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細胞網(wǎng)絡(luò)起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。（分解彈性纖維）10代細胞原代培養(yǎng)50代細胞傳代培養(yǎng)細胞株無限傳代細胞系遺傳物質(zhì)未改變遺傳物質(zhì)改變接觸抑制剪碎多數(shù)組織細胞固定在表面生長和分裂。第13頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三

細胞株：原代細胞一般傳至10代左右細胞生長停滯，大部分細胞衰老死亡，少數(shù)細胞存活到40~50代，這種傳代細胞為細胞株。

細胞系：細胞株傳代至50代后又出現(xiàn)細胞生長停滯狀態(tài)，只有部分細胞由于遺傳物質(zhì)的改變，使其在培養(yǎng)條件下可以無限制傳代，這種傳代細胞為細胞系。細胞株和細胞系的區(qū)別：

細胞系的遺傳物質(zhì)改變，具有癌細胞的特點，失去接觸抑制，容易傳代培養(yǎng)。第14頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三3.動物細胞培養(yǎng)的條件:1、無菌、無毒的環(huán)境

（添加一定量的抗生素，定期更換培養(yǎng)液）2、營養(yǎng)（葡萄糖、氨基酸、促生長因子、無機鹽、微量元素、維生素、血清、血漿等。合成培養(yǎng)基）3、溫度和pH

(36.5+0.5度,PH=7.2-7.4)4、氣體環(huán)境：

O2和CO2（95%空氣和5%CO2）

第15頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三獲得細胞或細胞分泌蛋白細胞的全能性細胞株、細胞系植物體培養(yǎng)結(jié)果快速繁殖、培育無病毒植株等培養(yǎng)目的葡萄糖、動物血清蔗糖、植物激素培養(yǎng)基特有成分液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基性質(zhì)細胞增殖原理動物細胞培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)比較項目4、植物組織培養(yǎng)和動物細胞培養(yǎng)的比較第16頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三思考：1、動物細胞培養(yǎng)液的主要成分是什么？較植物組織培養(yǎng)基有何獨特之處？2、動物細胞培養(yǎng)能否像綠色植物組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)成新個體？需要脫分化嗎？主要成分：葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清等。獨特之處有：1、液體培養(yǎng)基2、成分中有動物血清等不能，動物細胞培養(yǎng)只能使細胞數(shù)目增多，不能發(fā)育成新的動物個體不需要。采用定向誘導(dǎo)動物的干細胞。第17頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三5、動物細胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用（1）生產(chǎn)蛋白生物制品：病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體等。（3）用于檢測有毒物質(zhì)（2）獲得大量自身的皮膚細胞，用于植皮。（4）用于生理、病理、藥理等方面的研究，為治療和預(yù)防疾病提供理論依據(jù)第18頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三探究1、植物組織培養(yǎng)過程要將組織分散成單個細胞嗎？２、動物細胞培養(yǎng)過程將組織分散成單個細胞嗎？３、為何動物細胞培養(yǎng)過程將組織分散成單個細胞的呢？４、如何將動物組織分散成單個的細胞呢？５、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可說明細胞間的物質(zhì)是什么成份？沒有是成塊的組織細胞靠在一起,彼此限制了細胞的生長和增殖，不利培養(yǎng)，分散了做成細胞懸浮液利于培養(yǎng)先用剪刀剪碎,后用蛋白酶處理胰蛋白酶水解蛋白質(zhì)細胞間的成份是蛋白質(zhì)第19頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三６、細胞膜的主要成份是什么？７、胰蛋白酶能將細胞消化掉嗎？８、既然胰蛋白酶能將細胞消化掉，那將動物組織分散成單個細胞要注意什么問題呢？９、能夠用胃蛋白酶代替胰蛋白酶嗎？為什么？１０、動物細胞培養(yǎng)取材時，一般是取胚胎組織或幼齡動物的組織或器官，請解釋原因？蛋白質(zhì)和磷脂能注意時間的控制不能，因為動物細胞培養(yǎng)適宜的PH為7.2—7.4，此環(huán)境下胃蛋白酶（2.0）沒有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性較高。胚胎組織或幼齡動物的組織或器官分裂、增殖旺盛探究第20頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三11、動物細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)表面為何要光滑、無毒？12、培養(yǎng)瓶中的細胞培養(yǎng)到什么時候就不再分裂、增殖？13、如此時細胞數(shù)量并未達到人們的需求，應(yīng)該怎樣辦？易于培養(yǎng)細胞貼壁，進行生長增殖當(dāng)貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞分裂就會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象叫接觸抑制將貼滿細胞壁的細胞用胰蛋白酶處理，然后分瓶繼續(xù)培養(yǎng)，讓細胞繼續(xù)增殖。這樣的過程叫做傳代培養(yǎng)探究第21頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三14、如何理解原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)？15、傳代培養(yǎng)的細胞都能一直傳代下去嗎？16、有些為何能一直傳下去嗎？17、動物細胞培養(yǎng)就是為了得到這些細胞嗎？18、人類一般保存的是哪類細胞呢？為什么？上述過程中，在第一培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)就是原代培養(yǎng)，之后轉(zhuǎn)移到其它培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)就是傳代培養(yǎng)不都能發(fā)生突變，朝著癌細胞方向發(fā)展不是保存10代以內(nèi)的細胞，因為10－50代部分細胞的細胞核型可能發(fā)生變化，有少部分遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，發(fā)生突變向癌細胞方向發(fā)展。探究第22頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三將動物的一個細胞的細胞核移入一個已經(jīng)去掉細胞核的卵母細胞中，使其重組并發(fā)育成一個新的胚胎，這個新的胚胎最終發(fā)育成動物個體。用核移植的方法得到的動物稱為克隆動物。1.動物細胞核移植的概念：二、核移植技術(shù)第23頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三2.分類：胚胎細胞核移植：體細胞核移植：細胞分化程度低，恢復(fù)全能性容易

細胞分化程度高，恢復(fù)全能性困難第24頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三供體細胞培養(yǎng)（MⅡ卵母細胞）減數(shù)第二次分裂中期去核的卵母細胞供體細胞注入去核卵母細胞受體細胞激活，完成減數(shù)分裂、發(fā)育胚胎移植3.過程第25頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三卵細胞Ａ母綿羊Ｂ母綿羊乳腺細胞細胞質(zhì)細胞核細胞核移植早期胚胎卵裂C母綿羊子宮胚胎移植多莉羊分娩妊娠多莉羊的培育過程融合后的卵細胞第26頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三4.體細胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景1、在畜牧業(yè)中可以加速家畜遺傳改良的進程2、保護瀕危物種3、生產(chǎn)醫(yī)用蛋白質(zhì)及組織器官的移植的供體第27頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三5.體細胞核移植技術(shù)存在的問題1、克隆動物基因組重新編程的機制尚不清楚。2、克隆技術(shù)效率低，畸形率高、死亡率高、易出現(xiàn)早衰等問題。3、生產(chǎn)克隆動物費用昂貴。第28頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三三、動物細胞融合1、概念：動物細胞融合也稱細胞雜交，是指兩個或多個動物細胞結(jié)合形成一個細胞的過程。融合后形成的具有兩個或多個細胞遺傳信息的單核細胞稱為雜交細胞。第29頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三誘導(dǎo)方式物理法化學(xué)法生物法：滅活的病毒仙臺病毒紫外線喪失感染性（不感染細胞）保留融合活性（誘導(dǎo)細胞融合）2、誘導(dǎo)的過程：原理動物細胞融合相當(dāng)于植物體細胞雜交的原生質(zhì)體融合過程

細胞膜的流動性第30頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三細胞A細胞B雜種細胞物理法、化學(xué)法滅活的病毒仙臺病毒皰疹病毒新城雞瘟病毒過程3、用途：制備單克隆抗體第31頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三滅活的病毒顆粒黏附于細胞表面細胞膜被病毒顆粒穿通細胞膜連接細胞融合，形成雜種細胞（細胞膜具有一定的流動性）第32頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三主要用于制備單克隆抗體獲得雜種植株用途物理、化學(xué)方法滅活的病毒物理（離心、振蕩、電刺激）化學(xué)（聚乙二醇）誘導(dǎo)方法使細胞分散后誘導(dǎo)細胞融合去除細胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合細胞融合的方法細胞膜的流動性細胞膜的流動性、植物細胞全能性原理動物細胞融合植物體細胞雜交比較項目植物、動物細胞融合的比較第33頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三四、單克隆抗體單:單個細胞克隆:無性繁殖抗體:化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強第34頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三原始的方法獲得抗體，特異性差，純度低。想獲得單一抗體，必須用單個B淋巴細胞進行無性繁殖，通過克隆形成細胞群。問題：體外培養(yǎng)的條件下，一個B淋巴細胞是不可能無限增值的，如何使單個淋巴細胞增殖呢？第35頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三抗體

抗原刺激效應(yīng)B細胞篩選單一效應(yīng)B細胞增殖，產(chǎn)生大量抗體缺點：特異性差、純度低；產(chǎn)量低、反應(yīng)不夠靈敏如何解決這一問題？動物體內(nèi)第36頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三設(shè)計方案：一個B淋巴細胞－－只分泌一種特異性抗體小鼠骨髓瘤細胞－－能無限增殖雜種細胞根據(jù)阿根廷科學(xué)家米爾