分子診斷技術的應用進展

關于分子診斷技術的應用進展第1頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三主要內容分子診斷概念的演變分子診斷技術的分類基于雜交基礎的分子診斷技術及其應用基于擴增基礎的分子診斷技術及其應用基于測序基礎的分子診斷技術及其應用分子診斷應用前景展望第2頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三

多聚酶鏈式反應（PCR：PolymeraseChainReaction)Polymerase:DNA聚合酶

第3頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三“鏈式反應”改變世界核裂變鏈式反應第4頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三分子診斷概念的變化分子診斷：應用分子生物學方法檢測患者體內遺傳物質的結構或表達水平的變化而做出診斷的技術，稱為分子診斷。分子診斷是預測診斷的主要方法，既可以進行個體遺傳病的診斷，也可以進行產前診斷。分子診斷的材料包括DNA、RNA和蛋白質?；蛟\斷：又稱DNA診斷或分子診斷，通過分子生物學和分子遺傳學的技術，直接檢測出分子結構水平和表達水平是否異常，從而對疾病做出判斷。分子生物學：從分子水平上研究生命現象物質基礎的學科。研究細胞成分的物理、化學的性質和變化以及這些性質和變化與生命現象的關系，如遺傳信息的傳遞，基因的結構、復制、轉錄、翻譯、表達調控和表達產物的生理功能，以及細胞信號的轉導等。第5頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三分子診斷技術的分類根據目的基因是否被放大分類

可分為雜交法和擴增法根據被測基因的核酸類型分類

Southern印跡用于檢測DNA；Northern印跡用于檢測RNA；斑點印跡或稱斑點雜交，既可檢測DNA也可檢測RNA。根據診斷目的或要求

分為定性診斷、定量診斷和半定量診斷，以及序列分析等根據分子之間的作用形式

雜交、擴增、測序第6頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三基于分子雜交為基礎的分子診斷技術發(fā)展及其應用

基于分子雜交為基礎的分子診斷技術發(fā)展及其應用

基于分子雜交的分子診斷技術及其應用兩條同源核酸分子（DNA或RNA）可以在堿基互補的原則下形成異質雙鏈是遺傳物質最重要的化學特征，這一過程亦被稱為分子雜交（molecularhybridization）。分子雜交是所有分子生物學技術的基礎，從最初的印跡雜交（southernBlot和northernBlot）到實時PCR（realtimePCR），從基因芯片再到高通量的DNA測序技術，都離不開堿基互補的分子雜交反應。而且在理論上可以特異性相互作用的兩個不同分子，例如核酸與核酸之間（A-G、G-C）、蛋白與蛋白之間（抗原和抗體）甚至核酸和蛋白之間（適體與多肽）的相互作用都可以視為分子雜交的不同表現模式。因此，廣義的分子雜交技術是指以核酸、蛋白、糖基以及細胞、代謝物等分子的相互作用所建立的分析方法。目前臨床應用的以分子雜交技術為基礎的診斷技術繁多，缺乏統(tǒng)一的分類方法，但是可以根據實驗方法的差異分為主要的兩種類型，一類是通過特異性的標記探針檢測檢測細胞內的核酸物質，而另一類是通過探針檢測從細胞內提取的核酸、蛋白等物質，前者以原位雜交及其衍生的技術為主，后者以生物芯片及其衍生的技術為主。第7頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三熒光原位雜交（FISH）原位雜交應用特異性的探針檢測細胞內的核酸需要標記分子顯示雜交信號，1960s年代的檢測技術是放射性核素標記，但是信號檢測程序復雜并且可能存在放射性物質的污染，而熒光物質標記可以通過顯微鏡直接觀察實驗結果，因此熒光標記的原位雜交技術（Fluorescentinsituhybridiztion，FISH）一經出現立刻取代了放射性標記的技術，成為應用最廣泛的分子雜交技術。FISH技術通過熒光標記探針，可以可視化的檢測人類細胞或組織中特定基因的數量及其定位，是分子雜交與細胞遺傳學技術的結合。IFSH技術的分析過程分為四個步驟，核酸變性、探針變性、雜交及信號檢測。因此，針對探針標記、染料開發(fā)和圖像分析的技術的更新是FISH分析技術發(fā)展的主要路徑。第8頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三熒光原位雜交衍生技術首先是熒光染料的應用，從最初的單色FITC應用，發(fā)展到使用多種熒光染料的多色FISH技術，既多元熒光原位雜交和光譜核型分析技術，使用五種染料（Rhodamine,Texas-red,Cy5,FITC,andCy5.5）標記的探針可以在一次試驗中定位多種不同的基因以及使用不同的顏色標記顯示24條不同的染色體。其次，在探針方面，染色體臂、著絲粒、端粒特異的探針被先后開發(fā)應用，而且應用微切割技術切割技術制備亞區(qū)域探針（microFISH），使FISH的基因定位和分辯率大大提高［6］。同時，探針標記對象和標記技術的發(fā)展不斷衍生出新的FISH技術，例如比較基因組雜交、引物原位標記技術、肽核酸探針原位雜交、物種交叉熒光原位雜交、纖維原位雜交等。在圖像與信號分析方面，應用高分辨率CCD攝像機和計算機自動圖像分析系統(tǒng)獲得廣泛應用，而SKY結合傅立葉頻譜技術，同時計量可見光和近紅外范圍內的所有點的發(fā)射頻譜而一次成像。第9頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三熒光原位雜交結果JournalofCellScience2003；116（14）第10頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三FISH的應用在產前診斷方面，FISH主要用于染色體數目異常的診斷，與常規(guī)核型分析的一致性可以達到99.5％，但結果報告時間只要24小時，大大低于核型分析的平均2周左右的報告時間，FISH在多數的發(fā)達國家已經批準為常規(guī)產前篩查輔助診斷技術。在血液腫瘤的診斷方面，FISH用于染色體異位的融合基因檢測、基因缺失檢測、微小殘留病灶監(jiān)測、骨髓移植監(jiān)測等。在感染性疾病檢測方面，FISH檢測痰液標本中銅綠假單飽菌、流感嗜血桿菌等常見菌的敏感性可以達到90％，特異性100％［9］。對于軍團菌、幽門螺旋桿菌和結核桿菌等較難培養(yǎng)鑒定的細菌，FISH在快速診斷上也顯示了很好的應用前景。在實體腫瘤的應用中，FISH可以檢測任何組織類型的染色質和基因的異常，廣泛應用于肺癌、乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌等實體腫瘤的腫瘤的輔助診斷，療效檢測、個體化治療和預后判斷。FISH用于藥物靶向性基因表達狀態(tài)的檢測。在乳腺癌治療藥物曲妥珠單抗(赫賽汀)治療有效性患者篩選中，FISH被認為是檢測HER2基因表達狀態(tài)的金標準。第11頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三生物芯片技術生物芯片（Biochip）是通過微加工技術和微電子技術將大量特定序列的寡合苷酸片段、抗原/抗體，甚至細胞或組織等生物大分子，按照矩陣方式高密度的固定或直接合成在玻璃、硅片、聚丙烯、磁性微球等固項支持物上，或者整合微流體技術以及微電級、為傳感器等制備的類似于電子行業(yè)的芯片樣產品的檢測技術。固化的探針分子與熒光標記的相應樣本進行雜交，通過熒光檢測系統(tǒng)掃描分析及計算機軟件分析，達到高通量分析生物信息的目的。生物芯片技術可以根據功能的不同分為微陣列芯片（Microarraychip）、微流控芯片（Microfluidics）和芯片實驗室（LAB-on-chip,LOC）。第12頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三生物芯片技術微陣列芯片：早期的微陣列芯片（Microarray）單指基因芯片（genechip，DNAchip），但隨著蛋白芯片（proteinchip）以及糖類芯片（glycanchip）的出現，Microarray逐漸被稱為微陣列芯片，強調將大量探針有序固化在固相支持物上的檢測方法，而根據探針種類的不同可以分為基因芯片、蛋白芯片及糖類芯片。生物芯片技術可以根據功能的不同分為微陣列芯片（Microarraychip）、微流控芯片（Microfluidics）和芯片實驗室（LAB-on-chip,LOC）。微流控芯片：是在幾平方厘米的單晶硅片、石英、玻璃或有機聚合物等材料上刻制微通道，實現樣本預處理、反應、分離和檢測的微型檢測平臺，可快速高效、高通量的完成基因、蛋白及各種小分子分析和鑒定芯片實驗室：是在微流控芯片基礎上發(fā)展了更為復雜的分析系統(tǒng)，將微機電技術于微流體技術相結合，將所需的反應均集中在一塊芯片上，建立微型分析系統(tǒng)（Micrototalanalyticalsystem，u-TAS）

第13頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三微陣列芯片分析流程第14頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三蛋白芯片技術第15頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三糖組芯片技術第16頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三微流控芯片技術第17頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三AFP-L3流控芯片第18頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三芯片技術的應用目前生物芯片可以應用的范圍包括：病原體的快速檢測、亞型分析及耐藥性檢測；腫瘤的分類、分期與篩查；遺傳性疾病的診斷于篩查；自身免疫性疾病的診斷等等。國外的生物芯片開發(fā)較早，許多成熟的生物芯片的檢測平臺已逐漸應用于臨床，例如美國Osmetch公司的e-SensorCFtest（檢測Cysticfibrosis）和Roche／Affymetrix的CYP450芯片（檢測藥物代謝相關基因CYP2D6和CYP2C19），Agendia公司的Mammaprint芯片（檢測乳腺癌相關基因），這三種芯片均已獲得美國FDA的批準應用于臨床實驗室

第19頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三sFDA注冊主要分子診斷產品（國內企業(yè)）第20頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三基于擴增基礎的分子診斷技術及其應用1983年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈式反應（Polymerasechainreaction，PCR），使體外擴增DNA成為可能，開啟了體外擴增和操作DNA或RAN技術的發(fā)展。在之后的20多年里，擴增DNA的技術成為分子診斷應用最廣的技術之一，發(fā)展變化了數十種核酸擴增檢測技術。目前缺乏統(tǒng)一的核酸擴增技術的分類，但根據DNA被擴增的過程中是變溫還是恒溫方式，可以將核酸擴增技術分為兩類，溫度循環(huán)式的擴增技術，以常規(guī)（conventionalPCR）和實時PCR（realtimePCR，RT-PCR）為主，等溫方式的擴增技術，以核酸序列擴增法（nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA）、轉錄介導的擴增（Transcription-mediatedamplification，TMA），環(huán)介導等溫擴增（Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）等技術為主。第21頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三溫度循環(huán)式的擴增技術常規(guī)PCR：在擴增反應結束后對產物進行電泳或雜交等方式的分析，因此與其他技術的結合衍生出多種分析方法，例如PCR結合限制性長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP）、PCR結合特異性寡合苷酸探針斑點雜交（PCR-ASO）、PCR結合變性梯度凝膠（PCR-DGGE）、PCR結合的單鏈構象多態(tài)性（PCR-SSCP）等分析技術。RT-PCR：病原體的多重PCR（MultiplexPCR），提高敏感性和特異性的巢式PCR（nestedPCR），研究基因表達的原位PCR（insituPCR），分析RNA的逆轉錄PCR（RT-PCR）以及錨定PCR、不對稱PCR、膜結合PCR等等。第22頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三不同方式的PCR技術名稱主要用途簡并引物擴增法擴增未知基因片斷巢式PCR提高pcr敏感性、特異性，分析突變多重PCR同時檢測多個突變或病原反向PCR擴增已知序列兩側的未知序列，致產物突變單一特異引物PCR擴增未知基因組DNA單側引物PCR通過已知序列擴增未知cDNA原位PCR研究基因表達錨定PCR分析具備不同末端的序列第23頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三加熱變性冷卻粘合擴增連接酶融合冷卻聚合酶+dNTP連接酶點突變的研究、微生物病原體的檢測及定向誘變、單堿基遺傳病多態(tài)性及單堿基遺傳病的產物診斷、微生物種型鑒定，癌基因的點突變研究連接酶鏈反應第24頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三等溫方式的擴增技術恒溫擴增技術主要包括，核酸序列擴增法（nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA）、轉錄介導的擴增（Transcription-mediatedamplification，TMA）、環(huán)介導等溫擴增（Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）、鏈置換擴增法（stranddisplacementamplification，SDA）、滾環(huán)擴增法（RollingCrileAmplification，RCA）、復制酶擴增QB等。第25頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三等溫方式的擴增技術NASAB：通過AMV逆轉錄酶、T7RNA聚合酶、RnaseH三種酶的協(xié)同作用為核酸擴增提供動力，逆轉錄酶將RNA轉錄成cDNA，生成的RNA-DNA，產物被RnaseH分解為單鏈DNA，引物2結合DNA，再在逆轉錄酶作用下合成雙鏈DNA，雙鏈DNA上引物攜帶的T7RNA聚合酶的啟動子序列將DNA轉錄成RNA，RNA又可以生成DNA，使反應循環(huán)發(fā)生；TMA：使用逆轉錄酶和T7RNA聚合酶，在反應中同時利用逆轉錄酶酶的逆轉錄活性和Rnase活性，反應動力的維系與NASBA類似：LAMP：技術是利用BstDNA聚合酶的鏈置換活性提供反應動力；SDA：是應用DNA聚合酶的5‘－3’核酸外切酶活性從雙鏈DNA上的缺口處開始合成新鏈，剝離舊鏈，當缺口重復產生時，切割－延伸－鏈置換的過程循環(huán)進行，目的片段被擴增；RCA：利用環(huán)狀DNA與強鏈置換活性的?29DNA聚合酶為DNA延伸提供動力第26頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三NSAB操作簡便不需特殊儀器不需溫度循環(huán)循環(huán)次數少忠實性高特異性好擴增效率高于標準PCR第27頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三TMA第28頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三以擴增為基礎的方法的臨床應用DNA或RNA的擴增技術，最直接的優(yōu)勢是在較短的時間內將目的基因的拷貝數大量擴增，具有很高的靈敏度，同時特異性的引物保證了較高的特異性。因此，在分子診斷技術中基于擴增的技術，特別是熒光定量PCR技術，在實驗診斷中應用最為廣泛。PCR技術可以準確的定量感染性疾病病原體，不論是真菌、細菌和病毒以及寄生蟲的感染都可以應用擴增技術加以檢測，同時同一種病原體可以買到多種擴增原理的商業(yè)化檢測試劑。目前在sFDA注冊的應用PCR方法的體外診斷試劑已達到190余種，成為病原體和基因表達與突變檢測的最主要的試劑。為提高PCR的檢測通量，新進發(fā)展的多重PCR技術以及多重連接探針擴增技術（Multiplexligation-dependentProbeamplification，MLPA）可以一次在同一樣本中同時檢測多種病原體，最大可同時擴增45個目的片段。同時，對PCR產物的高分辨率溶解曲線分析，為基因分型和突變掃描提供了新的手段?？梢灶A見PCR技術仍將主導臨床實驗室感染性病原體的檢測，細菌的耐藥基因檢測，腫瘤個體化治療的主要檢測工具。第29頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三基于測序基礎的分子診斷技術及其應用

人類基因組計劃的出現,使人們面臨了巨大的經費問題,因為傳統(tǒng)的Sanger測序法無論如何優(yōu)化,也無法大幅度降低測序費用;人類以及其它主要模式生物參考序列數據庫的建立使得短片段作圖成為可能,這極大地促進了短片段測序技術的發(fā)展;不斷涌現的新型分子生物學技術極大地促進了分子生物學的發(fā)展,隨之而來的越來越多的比如基因變異、RNA表達、蛋白與DNA相互作用以及染色體構象等等生物學現象需要人們用高通量DNA測序手段去解釋,這也極大地促進了新型測序技術的發(fā)展;其它學科、各項相關技術的發(fā)展,例如顯微鏡技術、表面化學技術、核苷生化技術、聚合酶工程技術、計算機技術、數據儲存及分析技術等,為DNA測序技術提供了極大的支持。測序技術發(fā)展的動力第30頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三新一代測序儀美國RocheAppliedScience公司的454基因組測序儀美國Illumina公司和英國Solexatechnology公司合作開發(fā)的Illumina測序儀美國AppliedBiosystems公司的SOLiD測序儀Dover/Harvard公司的Polonator測序儀美國Helicos公司的HeliScope單分子測序儀第31頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三新一代測序原理新的測序策略——循環(huán)芯片測序法(cyclic-arraysequencing)循環(huán)芯片測序法,簡言之就是對布滿DNA樣品的芯片重復進行基于DNA的聚合酶反應(模板變性、引物退火雜交及延伸)以及熒光序列讀取反應與傳統(tǒng)測序法相比,循環(huán)芯片測序法具有操作更簡易、費用更低廉的優(yōu)勢第32頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三第33頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三新一代測序儀的特點體外構建DNA文庫,隨后體外克隆擴增待測DNA片段,這就解決了傳統(tǒng)Sanger測序技術中好幾個限制平行測序規(guī)模的瓶頸問題,比如轉化大腸桿菌以及陽性克隆挑選等問題;基于芯片的測序方式能極大地提高平行測序的能力。由于每一個待測DNA片段克隆的直徑都不到1μm,因此可以在芯片上同時對上億個待測DNA片段進行測序。因為每一個待測DNA片段克隆都固定在芯片上的固定位置,因此可以一次對芯片上的所有片段進行測序,而只需要使用幾微升的酶等反應試劑,這就相當于每一個待測片段只使用了幾皮升(picoliter)或幾飛升(femtoliter)的反應試劑,從而極大降低了測序反應