分子神經(jīng)生物學(xué)作業(yè)

分子神經(jīng)生物學(xué)研究方法的名稱，原理和應(yīng)用此方法所達(dá)到的目的21世紀(jì)是生物學(xué)世紀(jì)，生命科學(xué)已成為科學(xué)的前沿，而分子生物學(xué)技術(shù)又是生命科學(xué)中公認(rèn)的一門帶頭學(xué)科。現(xiàn)在，分子生物學(xué)理論和技術(shù)已在生命科學(xué)、醫(yī)藥學(xué)和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，大大推進(jìn)了學(xué)科的發(fā)展。為了進(jìn)一步促進(jìn)分子生物學(xué)技術(shù)在神經(jīng)科學(xué)研究中的應(yīng)用，我們要學(xué)會用研究分子神經(jīng)生物學(xué)的理念和方法。一1.RNA分析技術(shù)

2．熒光定量PCR技術(shù)與應(yīng)用

3．外源基因在原核、真核系統(tǒng)中的表達(dá)

4．蛋白質(zhì)分析技術(shù)

5．基因芯片技術(shù)與應(yīng)用

6．細(xì)胞凋亡的檢測與分析

7．激光共聚焦顯微鏡的原理和應(yīng)用

8．基因診斷與治療

9．干細(xì)胞誘導(dǎo)與分化1.RNA分析技術(shù)關(guān)于基因功能研.是一種有效(快捷和成本相對低廉的方法大鼠成纖維細(xì)胞和小鼠細(xì)胞!分別抑制了哺乳動物的"!個不同類型基因!均獲得成功!并重新界定了部分必需基因和非必需基因#現(xiàn)在人們把該技術(shù)與基因芯片等高通量基因篩選技術(shù)相結(jié)合，在基因組水平上篩選成百甚至上千基因!在基因組學(xué)功能研究中發(fā)揮著越來越大的作用!其應(yīng)用前景不亞于QF9技術(shù)例如!人們選取果蠅基因組中的基因分別作為模板!用包含UO啟動子的序列作為通用引物!通過QF9進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄形成對胚胎進(jìn)行微注射并進(jìn)行抗體和免疫組織化學(xué)分析!從而在基因組中篩選出果蠅心源性基因。不但應(yīng)用研究了 哺乳動物細(xì)胞中某些關(guān)鍵基因的作用!還探索了在基因組水平上的篩選方法他們從人類基因文庫中選出靶基因。每個基因設(shè)計兩個靶序列，應(yīng)用表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞,隨后觀測VEGF在該干細(xì)胞中的表達(dá)變化,為進(jìn)一步研究VEGF修飾的NSCs治療缺血性腦損傷奠定基礎(chǔ)4．蛋白質(zhì)分析技術(shù)

：基因芯片技術(shù)和蛋白質(zhì)組技術(shù)是最近發(fā)展起來的高通量技術(shù),二者的出現(xiàn)使同時分析神經(jīng)系統(tǒng)的大量基因的表達(dá)和基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)及其相互作用網(wǎng)絡(luò)成為可能。它們在神經(jīng)科學(xué)中的應(yīng)用為了解腦功能提供了前所未有的機(jī)會。一個典型的基因芯片實驗包括:芯片的準(zhǔn)備或購買、靶DNA和探針的準(zhǔn)備或標(biāo)記、標(biāo)記探針與靶DNA的雜交、芯片掃描和影象信息的數(shù)據(jù)分析。蛋白質(zhì)組技術(shù)較為復(fù)雜,包括蛋白質(zhì)分離、鑒定和信息分析三方面的內(nèi)容。其中,分離技術(shù)多種多樣。若分離技術(shù)以二維電泳為基礎(chǔ),則該實驗通常由以下步驟組成:蛋白質(zhì)樣品的準(zhǔn)備、電泳分離、染膠、分離蛋白點的切除、蛋白質(zhì)的酶解(常用胰蛋白酶)、質(zhì)譜分析(鑒定)和數(shù)據(jù)的信息處理。本文綜述這兩項技術(shù)的內(nèi)容和實驗步驟,然后著重敘述它們在神經(jīng)科學(xué)中的應(yīng)用,討論其優(yōu)缺點和面臨的挑戰(zhàn),展望其發(fā)展前景5．基因芯片技術(shù)與應(yīng)用

基因芯片技術(shù),是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針,有規(guī)律地排列固定于玻片或者尼龍膜等支持物上,然后與待測的標(biāo)記樣品的基因進(jìn)行雜交,再通過激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進(jìn)行掃描,并配以計算機(jī)系統(tǒng)對每一探針上的熒光信號作出檢測和比較,從而迅速得出所要信息的一種分子生物學(xué)技術(shù)。上世紀(jì)90年代初,Bains等將短的片段固定到DNA支持物上,借助雜交方式進(jìn)行序列的測定。Pease等(1994)創(chuàng)造了光導(dǎo)原位合成高密、微化的寡核苷酸陣列的制作技術(shù),為DNA芯片技術(shù)的產(chǎn)生奠定了分子技術(shù)基礎(chǔ)。后來出現(xiàn)的探針固相原位合成技術(shù)與照相平板印刷技術(shù)結(jié)合,使合成并固定高密度的數(shù)以萬計的探針分子成為可能;并借助激光共聚焦顯微掃描技術(shù)對雜交信號進(jìn)行實時、靈敏、準(zhǔn)確的檢測和分析,促使基因芯片技術(shù)由實驗室走向工業(yè)化6．細(xì)胞凋亡的檢測與分析

細(xì)胞凋亡是一個主動的由基因決定的自動結(jié)束生命的過程,對于多細(xì)胞生物個體發(fā)育的正常進(jìn)行,自穩(wěn)平衡的保持以及抵御外界各種因素的干擾都起著非常關(guān)鍵的作用。細(xì)胞凋亡具有鮮明的形態(tài)學(xué)和生化特征,如細(xì)胞萎縮、染色質(zhì)固縮、凋亡小體形成、細(xì)胞表面形成泡狀或芽狀突起。細(xì)胞凋亡最主要的生化特征是DNA發(fā)生核小體間的斷裂,產(chǎn)生含有不同數(shù)量核小體單位的片段,在進(jìn)行凝膠電泳時,產(chǎn)生特征性的梯形條帶(DNAladder)。其大小為160～220bp的整數(shù)倍[1]。與上述形態(tài)學(xué)及生化特征相對應(yīng),細(xì)胞凋亡常用的檢測方法有細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察法[2]、瓊脂糖凝膠電泳法[1]、DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法[3]、彗星電泳法和流式細(xì)胞分析法[4,5]。高效毛細(xì)管電泳(CE或HPCE)相對傳統(tǒng)瓊脂糖凝膠電泳具有高效、高速、樣品用量少、易實現(xiàn)儀器自動化等優(yōu)點,已常規(guī)地應(yīng)用于核酸、蛋白質(zhì)、藥物、糖類以及各種其它小分子、離子等的分析7．激光共聚焦顯微鏡的原理和應(yīng)用

1定量熒光測定：對活細(xì)胞進(jìn)行定量測定，具有很好的重復(fù)性，分析神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的某些物理及生物化學(xué)特性；監(jiān)測抗原表達(dá)，細(xì)胞結(jié)合和殺傷等特征。在多發(fā)性硬化病人大腦活檢標(biāo)本上觀察病變組織的微血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性地表達(dá)。

2細(xì)胞內(nèi)離子的測定：使用多種熒光探針，對神經(jīng)細(xì)胞的Ca2+、PH及其它各種細(xì)胞內(nèi)離子進(jìn)行定量和動態(tài)分析。

.3神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察：激光掃描共聚焦顯微鏡使用模擬熒光處理，可將系列光學(xué)切片的數(shù)據(jù)合成三維圖像，并可從任意角度觀察。如Joshi等觀察了細(xì)胞突觸的骨架的三維圖像。三維重建圖像可使神經(jīng)細(xì)胞及細(xì)胞器的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)更加生動逼真。8．基因診斷與治療1995年以前,脊髓性肌萎縮癥(spinalmuseularat娜by,sMA)的診斷主要依靠病史、臨床表現(xiàn)、肌電圖及肌肉活檢組織化學(xué)染色等。但SMA的臨床變異性大,肌電圖在兒童患者不易配合檢查,肌肉活檢為有創(chuàng)性檢查,令家長難以接受,且需冰凍切片組化染色的條件,更難以在臨床上廣泛開展,即使可以推行,肌電圖和肌肉活檢亦均缺乏特異性,因此本病極易誤診。1995年,玩fevre〔’]等克隆到sMA的基因,并發(fā)現(xiàn)98.7%(226/229)的患者存在運(yùn)動神經(jīng)元存活基因l(survivalmotorneuron以邵nex,sMNI)缺失或中斷,這使得檢測SMNI基因缺失進(jìn)行本病的基因診斷成為可能。發(fā)展至今,基因診斷已成為SMA的主要確診方法,在國內(nèi)外廣泛推行,用于基因診斷的號外顯子缺失,則僅見120娜和招坤兩個條帶,由技術(shù)和方法也在不斷改進(jìn)與提高9．干細(xì)胞誘導(dǎo)與分化在脊髓受損、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化和脊骨肌萎縮等多種情況下，人體內(nèi)會出現(xiàn)運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞缺失現(xiàn)象。該研究展示了利用多能干細(xì)胞分化的運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞和其祖細(xì)胞取代疾