蛋白提取純化實(shí)驗(yàn)方案

OchratoxinA〔OTA〕制備AC20H18ClNO6，403.8，是無(wú)色結(jié)晶化合物，學(xué)名為：7-羥基-5-氯-3,4,二氫-8-羥基-3-甲基異香豆素-7β-苯丙氨酸(L-phenylalanine-N-[5-chloro-3，4-dihydro-8-hydroxy-3-methyl-1-oxo-1H2-benzopyran-7-yl]carbonyl-(R)-isocoumarin〕。OTApKa4.4，pKa7.1；OTA333nm，易溶于極性有機(jī)溶劑，例如：甲醇、乙醇、苯、乙腈、乙酸OTα。試驗(yàn)儀器通風(fēng)廚，pH儀，高效液相色譜；〔0.45uM〕，大鑰匙，1ml，5ml試驗(yàn)材料及藥品赭曲霉菌種，PDA培育基，玉米渣；〔200-300〕，CMC〔羧甲基纖維素鈉〕，甲苯，乙酸乙酯，甲酸，乙腈〔色譜醇〕，乙酸試驗(yàn)步驟一、OTA的培育：1.3.44121L〕，冷卻后倒平板，凝固后劃線接菌3.4412，封口膜封口，28℃培育箱倒置培育。2.3.441260g250ml〔同時(shí)滅菌的有水，大鑰匙，1ml〔18%〕，28℃、200rpm光培育，16-21〔21d〕進(jìn)展毒素提取。二、OTA20ml0.1mol/LH3PO4200ml再將使用過(guò)的三角瓶等取出。用紗布漏斗過(guò)濾下午靜置的溶液，收集濾液；再向玉米濾渣參加20ml依據(jù)濾液：3%NaHCO3=1：1，兩者混合均勻后倒入分液漏斗中，靜置分層，收集上層NaHCO3層；下層氯仿NaHCO3再洗一遍，靜置回收氯仿層至瓶里，收集NaHCO3。NaHCO3pH2~3。兩者混合均勻后倒入分液漏斗中，靜置分層，收CHCl3水洗回收的氯仿，洗兩遍。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)：開電熱〔60℃〕，真空泵，冷凝水，圓底燒瓶中加1/3氯仿，開電機(jī)降至兩者液面平?！舱婵諌簭?qiáng)在6~7，當(dāng)壓強(qiáng)增大時(shí)說(shuō)明已蒸氯仿。蒸干圓底燒瓶呈黃色。薄層層析：玻璃板洗凈晾干，硅膠粉1g：1ml0.8%CMC在研缽中沿同一方向攪拌混勻，至無(wú)氣泡，倒在玻璃板上鋪勻，晾干〔2-35-7天〕。95℃1.5甲醇洗瓶，點(diǎn)樣〔距膠板縱向一端邊緣2~3cm，留意點(diǎn)成一排直線，可用1ml注射器，槍加樣時(shí)不要遇到硅膠板外表，樣品枯燥后可再加一層，總量不超過(guò)2ml〕。開放劑：甲苯：乙酸乙酯：甲酸=6：3：1 乙酸乙酯150ml：甲酸50ml〕，在通風(fēng)櫥里倒約300ml開放劑在桶里，保鮮膜封口，靜置飽和15min。0.5~1cm〔30〕取出，在通風(fēng)櫥里吹干。斗過(guò)濾〔此步較慢〕。旋轉(zhuǎn)蒸干：甲醇溫度大約設(shè)在72~74℃，壓強(qiáng)在7~8。，0.45ｕm〔去除雜質(zhì)以防止堵柱子〕，放在小瓶里，-20℃，錫紙避光。12.液相流淌相,乙腈：水：乙酸=100：100：14ml，30min氣泡。100：990ml+10ml10000：990ml+10ml100*毒素100000：900ml+10ml10000*毒素液相的標(biāo)準(zhǔn)曲線換一臺(tái)機(jī)器需用標(biāo)品重做標(biāo)準(zhǔn)曲線。附圖：菌種21dTLC20238116:22:5110wanbei,100000bei.55862.91mg/L*0.006L=335.1775mg20231238.719min；峰面積3198823.05峰高196923.50峰面積均值3116302.395 濃度5129.157mg/L 即12.7mmol/L。設(shè)備搖床藥品試劑氯仿磷酸甲苯甲酸CMC鹽酸甲醇乙腈乙酸玉米渣OTAuM，15ml，每個(gè)平皿約播50-1005(50000/100)*15ml*500uM*403.8=1.52g~3.04g平皿突變體檢測(cè)：約20個(gè)平皿，約0.2guM，250ml，1000，50uM*250ml*1