奶粉中蛋白質(zhì)含量實(shí)驗方法

1【摘要】

目的嘗試建立一種快速準(zhǔn)確地測定奶粉中蛋白質(zhì)含量的方法。方法使用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)后，運(yùn)用BCA〔二喹啉甲酸〕法，在570nm波長處，分別測定標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)應(yīng)用液與樣品稀釋液的吸光度值，基于測定液中蛋白質(zhì)含量與其吸光度值呈正比關(guān)系，計算出樣品中蛋白質(zhì)的含量。結(jié)果待測溶液中蛋白質(zhì)濃度在0～250μg/ml范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線呈線性關(guān)系，其回歸方程為：2，相關(guān)系數(shù)r=0.998，平均回收率為100.2%。結(jié)論結(jié)合三氯乙酸沉淀的BCA法適用于奶粉中蛋白質(zhì)的快速檢驗和摻偽檢驗。【關(guān)鍵詞】

奶粉；蛋白質(zhì)；BCA法；三氯乙酸；三聚氰胺Arapidandsimplemethodofproteindeterminationinpowderedmilk

ZhangZhiqiao,ShenGuodong,WangGang

FirstMiddleSchoolofHefei,AnhuiProvincialHospitalAffiliatedtoAnhuiMedicalUniversity,Hefei230001

［Abstract］Objective

Toexplorearapidandsimplemethodofproteindeterminationinpowderedmilkwithoutothernitrogen-containingcompounddisturbanceinKjeldahldetermination.Methods

Conjugatedwithproteinprecipitationwithtrichloroaceticacid,BCA(bicinchoninicacid)methodwasused.Accordingtothepositiverelationshipofproteincontentwiththe570nmabsorbance,proteincontentwascalculatedinpowderedmilk.Results

Proteincontentinmilksolutionshowedagoodlinearrelationshipatthedetectionrangesof0-250μg/ml,withregressionequation:Y=301.12X-73.42andrelatedcoefficient:0.998,andtheaveragerecoveryratewas100.2%.Conclusion

BCAmethodconjugatedwithtrichloroaceticacidisadaptabletotherapidandsensitivedeterminationofproteininpowderedmilk.

［Keywords］Powderedmilk;Protein;BCAmethod;Trichloroaceticacid;Melamine

蛋白質(zhì)是人類最重要的營養(yǎng)物質(zhì)之一。因此，蛋白質(zhì)含量一直是食品檢測中的重要指標(biāo)。目前蛋白質(zhì)定量方法較多,如凱氏定氮法、紫外分光光度法和Lowry法等。雖然凱氏定氮法目前是測定蛋白質(zhì)含量的國家標(biāo)準(zhǔn)方法，但其操作繁瑣費(fèi)時，且蛋白質(zhì)含量是通過測定氮的含量推算得來的，容易被其他含氮物質(zhì)干擾〔如2021年9月“問題奶粉〞的出現(xiàn)源于有人利用凱氏定氮法的缺陷，向牛奶中添加三聚氰胺造成蛋白質(zhì)含量虛高〕；Lowry法和紫外分光光度法存在顯色所需時間長，靈敏度低，穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)［1］。為彌補(bǔ)這些缺乏，本實(shí)驗利用BCA〔二喹啉甲酸〕法結(jié)合三氯乙酸沉淀法建立一種快速簡便的測定奶粉中蛋白質(zhì)含量的方法。

1

材料與方法燃辱逼1.吩1

庸柄儀器修與試荒劑飯如知1.恭1.教1

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原導(dǎo)實(shí)驗棵方法歲塞躲1.仗2.假1

屢只方法并原誦理蝴

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春噴不同溉濃框度辭BS辰A突工作骨液的聰配方互〔略鼠〕齊款克1.萌2茅.3劇

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摘要：牛奶營養(yǎng)成分很高，富含蛋白質(zhì)和微量元素鈣、鐵、鋅等，是人們生活中的主要要營養(yǎng)食品之一。因此，分析牛奶中的營養(yǎng)成分含量是很有必要的工作。本實(shí)驗在普通實(shí)驗室條件，采用簡單科學(xué)快捷的方法分析某品牌牛奶中局部成分含量。

關(guān)鍵字：牛奶

蛋白質(zhì)鈣鐵鋅

1、實(shí)驗?zāi)康?/p>

用分光光度法測某牛奶中蛋白質(zhì)、鈣、鐵、鋅的含量。

2、實(shí)驗原理

牛乳中的主要的蛋白質(zhì)是酪蛋白，含量約為35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白質(zhì)的混合物，等電點(diǎn)為4.7。利用等電點(diǎn)時溶解度最低的原理，將牛乳的pH調(diào)至4.7時，酪蛋白就沉淀出來。用乙醇洗滌沉淀物，除去脂類雜質(zhì)后便可得到純酪蛋白。

雙縮脲(NH2CONHCONH2)在堿性溶液中與硫酸銅反響生成紫紅色化合物，稱為雙縮脲反響，蛋白質(zhì)分子中含有許多肽鍵在堿性溶液中也能與Cu2+反響產(chǎn)生紫紅色化合物。在一定范圍內(nèi)，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。因此，可以利用比色法測定蛋白質(zhì)濃度。雙縮脲法是測定蛋白質(zhì)濃度的常用方法之一。操作簡便、迅速、受蛋白質(zhì)種類性質(zhì)的影響較小，但靈敏度較差，而且特異性不高。除-CONH-有此反響外，-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基團(tuán)也有此反響。

鈣與身體健康息息相關(guān)，鈣除成骨以支撐身體外，還參與人體的代謝活動，它是細(xì)胞的主要陽離子，還是人體最活潑的元素之一，缺鈣可導(dǎo)致兒童佝僂病，青少年發(fā)育緩慢，孕婦高血壓，老年人的骨質(zhì)疏松癥。缺鈣還可引起神經(jīng)病，糖尿病，外傷流血不止等多種過敏性疾病。補(bǔ)鈣越來越被人們所重視。牛奶中含有易被人體吸收得鈣，有些牛奶產(chǎn)品中還特地加鈣而成為鈣奶。對于液體牛奶中鈣的含量，可采用EDTA法進(jìn)行直接測定。考慮到牛奶中含有Fe3+、Al3+等干擾離子，可以參加少量三乙醇胺以消除它們的，調(diào)節(jié)pH≈12～13，以鉻藍(lán)黑R作指示劑，指示劑與鈣生成紅色的絡(luò)合物，當(dāng)用EDTA滴定至計量點(diǎn)時，游離出指示劑，溶液呈現(xiàn)藍(lán)色。

當(dāng)一束光通過一個吸光物質(zhì)〔通常為溶液〕時，溶質(zhì)吸收了光能，光的強(qiáng)度減弱。吸光度就是用來衡量光被吸收程度的一個物理量。

吸光度用A表示。

A＝abc，其中a為吸光系數(shù)，單位L/(g·cm),b為液層厚度〔通常為比色皿的厚度〕，單位cm，c為溶液濃度，單位g/L

影響吸光度的因數(shù)是b和c。a是與溶質(zhì)有關(guān)的一個常量。此外，溫度通過影響c，而影響A。

符號A，表示物質(zhì)對光的吸收程度。

鄰二氮菲也叫鄰菲啰啉，是測定微量Fe2+的高靈敏度顯色劑在pH2～9的條件下，F(xiàn)e2+與鄰二氮菲生成穩(wěn)定的橙紅色絡(luò)合物，在510nm波長處有最大吸收。

測定時，控制溶液的酸度在pH＝5左右較為適宜。酸度高時，反響進(jìn)行較慢；酸度太低，那么Fe2+離子水解，影響顯色。當(dāng)鐵濃度在5.0mg／mL以內(nèi)時，吸光度與Fe2+濃度呈直線關(guān)系。Bi3+、Cd3+、Hg9+、Ag+、Zn2+等離子在pH＝2~9時與鄰二氮菲生成沉淀。Co2+，Ni2+，Cu2+等離子可與鄰二氮菲形成有色配合物，故應(yīng)注意它們的干擾。

鋅是人體中必需的微量元素之一，鋅缺乏會阻礙生長發(fā)育，過量又會導(dǎo)致胃癌等疾病。人類從牛奶等飲食中可以獲得一定量的鋅。在pH4.0～5.5的水溶液中，鋅離子與雙硫腙〔C13H12N4S〕生成紅色螯合物，摩爾吸光系數(shù)535=9.3×104L?mol-1?cm-1用四氯化碳萃取后比色定量。在選定的pH條件下，用足夠量的硫代硫酸鈉可掩蔽水中存在的少量鉛、銅、鎘、鈷、鉍、鎳、金、鈀、銀、亞錫等干擾金屬離子。

3、實(shí)驗步驟

3.1、試劑的配制

3.11、pH4.7醋酸-醋酸鈉緩沖液的配制:

先配A液與B液。A液：0.2mol/L醋酸鈉溶液。B液：0.2mol/L醋酸溶液。

取醋酸鈉固體6.5461g加水溶解并稀釋至100ml，取冰醋酸5mL加水稀釋至100ml，混合即得pH4.7的醋酸——醋酸鈉緩沖液200mL。

3.12、乙醇—乙醚混合液的配制：取25ml95％乙醇與25ml無水乙醚混合

3.13、雙縮脲試劑：稱取CuS04·5H2O0.3g，酒石酸鉀0.9g和碘化鉀0.5g，分別溶解后混勻，加6mol·L-1NaOH10mL，最后加水至100mL，貯于棕色瓶中，避光，可長期保存。

3.14、蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液(10mg·mL-1)，用小燒杯稱取枯燥的牛血清蛋白100.0mg，以少量生理鹽水溶解后倒入l0mL容量瓶中，淋洗小燒杯數(shù)次，一并倒入容量瓶中，最后加生理鹽水至刻度線。待測蛋白樣本：將牛奶樣品用生理鹽水準(zhǔn)確配制成一定濃度的溶液后再測定；將制得的酪蛋白用生理鹽水準(zhǔn)確配制成一定濃度的溶液后再測定。〔如假設(shè)不能溶解，滴加幾滴6mol/LNaOH溶液、分別用l0mL容量瓶定容〕

3.15、鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液(40.0μg·mL-1)：:準(zhǔn)確稱取0.0345g硫酸鐵銨〔NH4Fe(SO4)2·12H2O〕于燒杯參加6mL6mol·L-1HCl和少量水，溶解后用純水定容至10mL。此溶液1.00mL含有40.0μg鐵。

3.16、鹽酸羥胺溶液(100g·L-1)：:稱取10g鹽酸羥胺(NH2OH·HCl)，溶于水，并稀釋至100m〔新鮮配制，兩周內(nèi)有效〕

3.17、鄰二氮菲溶液(2g·L-1):：稱取0.20g鄰二氮菲(C12H8N2·H2O)，溶解于加有2滴濃鹽酸的純水，并稀釋至100mL〔新鮮配制，兩周內(nèi)有效〕

3.18、醋酸鈉溶液〔1.0mol·L-1〕：:稱取8.2030g醋酸鈉，用純水溶解后稀釋至100mL。

3.19、鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液〔1.00μg·mL-1〕：準(zhǔn)確稱取0.0100g基準(zhǔn)鋅于100mL燒杯中，參加6mol·L-1HCl0.5mL，立即蓋上外表皿，待鋅完全溶解后，以少量水沖洗外表皿及燒杯壁，將溶液轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，定容，即為鋅標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液。準(zhǔn)確移取1mL鋅標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，稀釋定容至100.0mL，即得1.00μg·mL-1鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3.20、0.1％雙硫酸腙四氯化碳貯備溶液：稱取0.10g雙硫腙〔C18H12N4S〕，在枯燥的燒杯中用四氯化碳溶解后稀釋至100mL，倒入棕色瓶中。此溶液置冰箱內(nèi)保存，可穩(wěn)定數(shù)周。

3.21、雙硫腙四氯化碳溶液：臨用前，吸取適量雙硫腙四氯化碳貯備溶液，用四氯化碳稀釋約30倍，至吸光度為0.4〔波長535nm，1cm比色皿〕。

3.22、25％硫代硫酸鈉溶液：稱取64.60g硫代硫酸鈉〔Na2S203·5H20)，溶于100mL純水中。

3.23、1＋1氨水溶液:10ml氨水加10ml水稀釋

3.2、牛奶中酪蛋白的提取

3.21、酪蛋白的粗提

50mL鮮牛奶加熱至40℃。在攪拌下慢慢參加預(yù)熱至40℃、pH4.7的醋酸緩沖液50mL.用精密pH試紙或酸度計調(diào)pH至4.7。

將上述懸浮液冷卻至室溫。離心15分鐘〔3000r·min-1〕。棄去清液，得酪蛋白粗制品。

3.22、酪蛋白的純化

用水洗滌沉淀3次，離心10分鐘〔3000r·min-1〕，棄去上清液。在沉淀中參加30mL乙醇，攪拌片刻，將全部懸濁液轉(zhuǎn)移至布氏漏斗中抽濾。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。將沉淀攤開在外表皿上，風(fēng)干；得酪蛋白純品。

3.3、酪蛋白含量的測定

3.31、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與樣品的測定

取試管8支，按下表操作。

各管混勻、放置37℃水浴中保溫20min。540nm比色，以空白管調(diào)零點(diǎn)，讀取各管吸光度值。

3.32、計算

在電腦上以吸光度值為縱坐標(biāo)，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出待測樣本的蛋白質(zhì)濃度(g／L)，并求出牛奶中蛋白質(zhì)濃度。由此濃度計算出100mL鮮牛奶中酪蛋白的真實(shí)含量。

3.4鈣含量的測定

3.41、鈣制劑鈣含量的測定

準(zhǔn)確移取25ml的鮮牛奶和鈣奶，分別轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。

準(zhǔn)確移取上述試液20.00mL，參加三乙醇胺溶液5mL，5mol·L-1NaOH4mL，參加水20mL，搖勻，加鉻藍(lán)黑R8~10滴，用0.01mol·L-1EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，接近終點(diǎn)時再補(bǔ)加2～3滴鉻藍(lán)黑，當(dāng)溶液由紅色變?yōu)樗{(lán)色即為終點(diǎn)，根據(jù)消耗EDTA的體積，計算出鮮奶和鈣奶中鈣的含量〔g/100mL〕，并與包裝上注明的含量作比擬。

3.42、考前須知

量取鮮奶和鈣奶的量視鈣含量多少而確定，以消耗0.01mol·L-1EDTA體積為20~30mL。牛奶、由于鈣奶均為乳白色，終點(diǎn)顏色變化不太明顯，接近終點(diǎn)時再補(bǔ)加2～3滴指示劑。

3.5鐵含量的測定

3.51、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取25mL比色管6支，按下表順序配制鐵標(biāo)準(zhǔn)系列并記錄測量的數(shù)據(jù)〔注意：參加鹽酸錢干后需搖勻放置2min捉，再僑進(jìn)行顆下一鐵步操堆作〕瞞，加樹完試喚劑后瞎搖勻壽，放劍置徐37疏℃鄰水浴扁中保氧溫炸15繭mi辮n丟，以持空白顛液為坑參比全，在奸51棋0n那m疤下測哈定各豪溶液例的吸昨光度很值。

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