微生物檢驗(yàn)操作規(guī)程

微生物檢驗(yàn)操作規(guī)程1.目的建立微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，保證檢驗(yàn)操作規(guī)化。2.圍適用于本公司相關(guān)的微生物檢驗(yàn)活動(dòng)的全過程。3.職責(zé)3.1微生物檢驗(yàn)員負(fù)責(zé)微生物檢驗(yàn)的全過程；3.2QC主管負(fù)責(zé)監(jiān)視檢查本規(guī)程的有效實(shí)施。4.操作規(guī)程4.1微生物檢驗(yàn)玻璃器皿吸管的洗滌4.1.1一般的玻璃器皿〔例如培養(yǎng)皿、試管、三角瓶等〕，可用毛刷及洗滌劑洗去灰塵、油垢，然后用自來水、蒸餾水充分沖洗，直至玻璃器皿壁均勻分布一層薄的水膜，即器壁既不掛水珠也無條紋，即洗滌到達(dá)標(biāo)準(zhǔn)。4.1.2玻璃器皿有污跡不能洗凈時(shí)，可浸泡于洗液中，待器皿中有機(jī)物氧化分解后，取出用自來水、蒸餾水沖洗干凈，備用。4.1.3新購的玻璃器皿先用2％鹽酸浸泡，再用用自來水、蒸餾水充分沖洗。4.2器皿的包扎4.2.1試管：塞上膠塞，然后用牛皮紙或報(bào)紙把試管頭包扎起來。做發(fā)酵試驗(yàn)時(shí)，將試管頭塞上專用的耐高溫PVC試管帽。4.2.2三角瓶、抽濾瓶：將三角瓶〔抽濾瓶〕口塞上膠塞，然后用牛皮紙把塞頭部包起來。4.2.3吸管：將耐高溫的移液槍頭裝盒，用用牛皮紙或報(bào)紙包裹。4.2.4平皿：10個(gè)為一組，用牛皮紙包裹。4.3消毒和滅菌：4.3.1化學(xué)滅菌：此法適用于微生物操作過程中不能加熱、紫外線的地方。如人手等?！?〕用75%的乙醇溶液或0.1%新潔爾滅擦拭或浸泡?！?〕一般用1～2%的甲醛液浸泡軟管和用具?！?〕一般成品漂白粉的有效成分是25～32%。使用時(shí)配成有效成份的2%溶液灑在地面或容器，〔對(duì)金屬有腐蝕作用〕放置10～15min后沖洗即可?！?〕氯滅菌劑的能力以有效氯表示，將氯水配制成50～100PPm的有效氯溶液，可用于浸泡，沖洗和外表殺菌。但氯對(duì)金屬有腐蝕作用。4.3.2物理滅菌：4.3.2.1干熱滅菌：適用于枯燥的玻璃器皿〔吸管、平皿等〕、金屬器具〔鑷子等〕、固體試液、液狀石蠟等。滅菌條件一般選用在160℃干熱空氣滅菌2h。〔1〕器具用牛皮紙或滅菌袋包〔裝〕扎，放入金屬容器?！?〕器具在枯燥箱加熱前放入，每個(gè)器具之間留有足夠的空隙，使熱空氣能暢通?！?〕關(guān)閉箱門接通電源，翻開通氣孔，使箱濕空氣能逸出，至箱溫度到達(dá)100℃時(shí)關(guān)閉?！?〕加熱至160℃，保持2小時(shí)?！?〕切斷電源，冷卻至60℃時(shí)，翻開箱門，取出滅菌器具，并翻開箱頂通氣口。注：滅菌時(shí)必須注意溫度不能超過180℃，以免使棉花、報(bào)紙烘焦；滅菌時(shí)不得翻開箱門；枯燥箱未冷卻時(shí)，不要取出里面器具，防止外溫差過大造成玻璃器具爆炸璃器具爆炸。4.3.2.2濕熱滅菌：適用于容器、培養(yǎng)基、無菌衣、膠塞以及其他遇高溫和潮濕不發(fā)生變化或損傷的物品。詳見"壓力蒸汽滅菌器操作規(guī)程"。〔1〕裝入培養(yǎng)基的瓶用膠塞蓋上，再用牛皮紙包扎?！?〕瓶中的培養(yǎng)液不要超過1L，否則滅菌不徹底?！?〕容器的上部應(yīng)留有足夠的空間〔一般不超過裝量的2/3〕，以便產(chǎn)生氣泡?！?〕器具用牛皮紙包裹?！?〕器具的組合和包裹應(yīng)允許滅菌蒸汽接觸所用物品?！?〕各類器具裝入滅菌器時(shí)，相互間要留有空隙以使蒸汽自由流動(dòng)。4.4無菌操作的準(zhǔn)備工作及考前須知4.4.1微生物室應(yīng)定期按"微生物實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)程"清潔。4.4.2微生物室使用前，應(yīng)先翻開紫外燈滅菌20～30min。4.4.3微生物室應(yīng)備有專用剪刀、鑷子、接種針，每次使用前后應(yīng)滅菌消毒。4.4.4微生物室應(yīng)備有75%酒精棉球；新潔爾滅消毒液浸紗布數(shù)塊，備用。4.4.5進(jìn)入微生物，換專用鞋，穿好干凈服，離室時(shí)脫去干凈服和專用鞋，干凈服和專用鞋只準(zhǔn)在微生物室使用，不準(zhǔn)穿到其它地方去，并定期洗換和消毒滅菌。4.4.6樣品檢驗(yàn)前應(yīng)在原始記錄本上記錄名稱、批號(hào)等容，并在所用平皿或試管上詳細(xì)記錄樣品序號(hào)、檢驗(yàn)日期等容。4.4.7無菌操作前，用75%的酒精棉球擦手。4.4.8操作要正確迅速，所用的器皿均應(yīng)是經(jīng)過嚴(yán)格滅菌的器皿。4.4.9檢驗(yàn)完畢，立即清理工作臺(tái)，棄去不需要物品，翻開紫外燈滅菌20～30min。4.5微生物檢驗(yàn)用培養(yǎng)基、溶液的配制、使用與儲(chǔ)存配制方法參見培養(yǎng)基說明書或檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下規(guī)定配制。4.5.1水：電導(dǎo)率在25℃時(shí)不超過25μs/cm，除非另有規(guī)定要求。4.5.2稱重和溶解：保存培養(yǎng)基的時(shí)間需視培養(yǎng)基中水份蒸發(fā)的程度及有無污染而定，已制備好的培養(yǎng)基要保存于冰箱中。在冰箱中存放的培養(yǎng)基在使用前要先置于室溫30min，使其與室溫一致再使用，因?yàn)闅怏w的溶解度可因溫度上升而降低，特別是乳糖膽鹽發(fā)酵管的倒管會(huì)因溫度上升而出現(xiàn)氣泡，這一點(diǎn)必須注意。4.5.3pH的測(cè)定和調(diào)整：用pH計(jì)測(cè)pH，必要時(shí)在滅菌前進(jìn)展調(diào)整，除特殊說明外，培養(yǎng)基滅菌后冷卻至25℃時(shí)，pH應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)pH±0.2圍。一般使用濃度約為40g/L〔約1mol/L〕的氫氧化鈉溶液或濃度約為36.5g/L〔約1mol/L〕的鹽酸溶液調(diào)整培養(yǎng)基的pH。4.5.4分裝：將配好的培養(yǎng)基分裝到適當(dāng)?shù)娜萜髦?，容器的體積應(yīng)比培養(yǎng)基體積最少大20%。4.5.6培養(yǎng)基的使用：經(jīng)過高壓的培養(yǎng)基應(yīng)盡量減少重新加熱時(shí)間，融化后防止過度加熱。融化后應(yīng)短暫置于室溫中〔如2min〕以防止玻璃瓶破碎。融化后的培養(yǎng)基放入47℃～50℃的恒溫水浴鍋中冷卻保溫，且應(yīng)盡快使用，放置時(shí)間一般不應(yīng)超過4h。未用完的培養(yǎng)基不能重新凝固留待下次使用。敏感的培養(yǎng)基尤應(yīng)注意，融化后保溫時(shí)間應(yīng)盡量縮短，如有特定要求可參考指定的標(biāo)準(zhǔn)。4.5.7平板的制備和儲(chǔ)存傾注融化的培養(yǎng)基到平皿中，使之在平皿中形成厚度至少為3mm〔直徑90mm的平皿，通常要參加18mL～20mL瓊脂培養(yǎng)基〕。將平皿蓋好皿蓋后放到水平平面使瓊脂冷卻凝固。如果平板需儲(chǔ)存，或者培養(yǎng)時(shí)間超過48h或培養(yǎng)溫度高于40℃，則需要傾注更多的培養(yǎng)基。凝固后的培養(yǎng)基應(yīng)立即使用或存放于暗處和〔或〕5℃±3℃冰箱的密封袋中，以防止培養(yǎng)基成分的改變。在平板底部或側(cè)邊做好標(biāo)記，標(biāo)記的容包括名稱、制備日期和〔或〕有效期。也可使用適宜的培養(yǎng)基編碼系統(tǒng)進(jìn)展標(biāo)記。將倒好的平板放在密封的袋子中冷藏保存可延長(zhǎng)儲(chǔ)存期限。為了防止冷凝水的產(chǎn)生，平板應(yīng)冷卻后再裝入袋中。儲(chǔ)存前不要對(duì)培養(yǎng)基外表進(jìn)展枯燥處理。對(duì)于采用外表接種形式培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基，應(yīng)先對(duì)瓊脂外表進(jìn)展枯燥：揭開平皿蓋，將平板倒扣于烘箱或培養(yǎng)箱中〔溫度設(shè)為25℃～50℃〕；或放在有對(duì)流的無菌凈化臺(tái)中，直到培養(yǎng)基外表的水滴消失為止。注意不要過度枯燥。商品化的平板瓊脂培養(yǎng)基應(yīng)按照廠商提供的說明使用。4.6檢驗(yàn)方法做樣前，將滅菌好的吸管、培養(yǎng)皿等放入操作臺(tái)上，操作臺(tái)、微生物室紫外線滅菌30min，然后關(guān)紫外線滅菌燈，開啟凈風(fēng)循環(huán)30min后開場(chǎng)做樣。詳見附錄各檢測(cè)方法附錄1菌落總數(shù)測(cè)定附錄2霉菌和酵母計(jì)數(shù)附錄3大腸菌群計(jì)數(shù)附錄4大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)附錄5沙門氏菌檢驗(yàn)附錄6金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)附錄1菌落總數(shù)的測(cè)定方法1.樣品的稀釋1.1固體和半固體樣品：稱取25g樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水中均質(zhì)1min～2min制成1:10的樣品勻液。1.2液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶〔瓶預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠〕中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。1.3用1mL微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于盛有9mL稀釋液的無菌試管中〔注意吸頭尖端不要觸及稀釋液面〕，換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。1.4按4.6.1.1.3操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無菌吸頭。1.5根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2個(gè)～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液〔液體樣品可包括原液〕，在進(jìn)展10倍遞增稀釋時(shí)，吸取1mL樣品勻液于無菌平皿，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。同時(shí)，分別吸取1mL空白稀釋液參加兩個(gè)無菌平皿作空白對(duì)照。1.6及時(shí)將15mL～20mL冷卻至46℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基〔可放置46℃±1℃恒溫水浴箱中保溫〕傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。2.培養(yǎng)2.1待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h。2.2如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基外表彌漫生長(zhǎng)的菌落時(shí)，可在凝固后的瓊脂外表覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基〔約4mL〕，凝固后翻轉(zhuǎn)平板，按4.6.1.2.1條件進(jìn)展培養(yǎng)。2.3菌落計(jì)數(shù)可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位〔CFU〕表示。2.3.1選取菌落數(shù)在30CFU～300CFU之間、無蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300CFU可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。2.3.2其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；假設(shè)片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2，代表一個(gè)平板菌落數(shù)。2.3.3當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界限的鏈狀生長(zhǎng)時(shí)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。3結(jié)果與報(bào)告3.1菌落總數(shù)的計(jì)算方法3.1.1假設(shè)只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)圍，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每g〔mL〕樣品中菌落總數(shù)結(jié)果。3.1.2假設(shè)有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)圍時(shí)，按下式計(jì)算：式中：N——樣品中菌落數(shù)；ΣC——平板〔含適宜圍菌落數(shù)的平板〕菌落數(shù)之和；n1——第一稀釋度〔低稀釋倍數(shù)〕平板個(gè)數(shù)；n2——第二稀釋度〔高稀釋倍數(shù)〕平板個(gè)數(shù)；d——稀釋因子〔第一稀釋度〕。3.1.3假設(shè)所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300CFU，則對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)展計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。3.1.4假設(shè)所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30CFU，則按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。3.1.5假設(shè)所有稀釋度〔包括液體樣品原液〕平板均無菌落生長(zhǎng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。3.1.6假設(shè)所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30CFU～300CFU之間，其中一局部小于30CFU或大于300CFU時(shí)，則以最接近30CFU或300CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。3.2菌落總數(shù)的報(bào)告3.2.1菌落數(shù)小于100CFU時(shí)，按“四舍五入〞原則修約，以整數(shù)報(bào)告。3.2.2菌落數(shù)大于或等于100CFU時(shí)，第3位數(shù)字采用“四舍五入〞原則修約后，取前2位數(shù)字后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入〞原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。3.2.3假設(shè)所有平板上為蔓延菌落而無法計(jì)數(shù)，則報(bào)告菌落蔓延。3.2.4假設(shè)空白對(duì)照上有菌落生長(zhǎng)，則此次檢測(cè)結(jié)果無效。3.2.5稱重取樣以CFU/g為單位報(bào)告，體積取樣以CFU/mL為單位報(bào)告。附錄2霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)1.樣品的稀釋1.1固體和半固體樣品：稱取25g樣品至盛有225mL滅菌蒸餾水的錐形瓶中，充分振搖，即1:10稀釋液。1.2液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品至盛有225mL無菌蒸餾水的錐形瓶〔可在瓶預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠〕中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。1.3取1mL1:10稀釋液注入含有9mL無菌水的試管中,另換一支1mL無菌吸管反復(fù)吹吸，此液為1:100稀釋液。1.4按1.3操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無菌吸管。1.5根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2個(gè)～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液〔液體樣品可包括原液〕，在進(jìn)展10倍遞增稀釋的同時(shí)，每個(gè)稀釋度分別吸取1mL樣品勻液于2個(gè)無菌平皿。同時(shí)分別取1mL樣品稀釋液參加2個(gè)無菌平皿作空白對(duì)照。1.6及時(shí)將15mL～20mL冷卻至46℃的馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂或孟加拉紅培養(yǎng)基〔可放置于46℃±1℃恒溫水浴箱中保溫〕傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。2.培養(yǎng)待瓊脂凝固后，將平板倒置，28℃±1℃培養(yǎng)5d，觀察并記錄。3.菌落計(jì)數(shù)肉眼觀察，必要時(shí)可用放大鏡，記錄各稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的霉菌和酵母數(shù)。以菌落形成單位〔CFU〕表示。選取菌落數(shù)在10CFU～150CFU的平板，根據(jù)菌落形態(tài)分別計(jì)數(shù)霉菌和酵母數(shù)。霉菌蔓延生長(zhǎng)覆蓋整個(gè)平板的可記錄為多不可計(jì)。菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。4.結(jié)果與報(bào)告4.1計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)計(jì)算。4.1.2假設(shè)所有平板上菌落數(shù)均大于150CFU，則對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)展計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。4.1.3假設(shè)所有平板上菌落數(shù)均小于10CFU，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。4.1.4假設(shè)所有稀釋度平板均無菌生長(zhǎng)，則以小于1乘最低稀釋倍數(shù)計(jì)算；如為原液，則以小于1計(jì)數(shù)。4.2報(bào)告4.2.1菌落數(shù)在100以時(shí)，按“四舍五入〞原則修約，采用兩位有效數(shù)字報(bào)告。4.2.2菌落數(shù)大于或等于100時(shí)，前3位數(shù)字采用“四舍五入〞原則修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)來表示結(jié)果；也可用10的指數(shù)形式來表示，此時(shí)也按“四舍五入〞原則修約，采用兩位有效數(shù)字。4.2.3稱重取樣以CFU/g為單位報(bào)告，體積取樣以CFU/mL為單位報(bào)告，報(bào)告或分別報(bào)告霉菌和/或酵母數(shù)。A菌落總數(shù)、霉菌及酵母數(shù)檢驗(yàn)流程圖附錄3大腸菌群計(jì)數(shù)第一法MPN計(jì)數(shù)1.樣品的稀釋1.1固體和半固體樣品：稱取25g樣品，放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水均質(zhì)1min～2min,或放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋制成1:10的樣品勻液。1.2液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶〔瓶預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠〕中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。1.3樣品勻液的pH值應(yīng)在6.5～7.5之間，必要時(shí)分別用1mol/LNaOH或1mol/LHCl調(diào)節(jié)。1.4用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中〔注意吸頭尖端不要觸及稀釋液面〕，換用1支1mL無菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。1.5根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15min。2.初發(fā)酵試驗(yàn)每個(gè)樣品，選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液〔液體樣品可以選擇原液〕，每個(gè)稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨〔LST〕肉湯，每管接種1mL〔如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯〕，36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，觀察倒管是否有氣泡產(chǎn)生，24h±2h產(chǎn)氣者進(jìn)展復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h，產(chǎn)氣者進(jìn)展復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。3.復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯〔BGLB〕管中，36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計(jì)為大腸菌群陽性管。4.大腸菌群最可能數(shù)〔MPN〕的報(bào)告按3確證的大腸菌群LST陽性管數(shù)，檢索MPN表〔見B，表1〕，報(bào)告每g〔mL〕樣品腸菌群的MPN值。第二法平板計(jì)數(shù)法1.樣品的稀釋按第一法中的1進(jìn)展。2.平板計(jì)數(shù)2.1選取2個(gè)～3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度,每個(gè)稀釋度接種2個(gè)無菌平皿，每皿1mL。同時(shí)取1mL生理鹽水參加無菌平皿作空白對(duì)照。2.2及時(shí)將15mL～20mL冷至46℃的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂〔VRBA〕約傾注于每個(gè)平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板，置于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。2.3平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在15CFU～150CFU之間的平板，分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5mm或更大。3.證實(shí)試驗(yàn)從VRBA平板上挑取10個(gè)不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管，36℃±1℃培養(yǎng)24h～48h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報(bào)告為大腸菌群陽性。4.大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽性的試管比例乘以2.3中計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每g〔mL〕樣品腸菌群數(shù)。例：10-4樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有100個(gè)典型和可疑菌落，挑取其中10個(gè)接種BGLB肉湯管，證實(shí)有6個(gè)陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：100×6/10×104/g〔mL〕=6.0×105CFU/g〔mL〕。B表1大腸菌群最可能數(shù)〔MPN〕檢索表陽性管數(shù)MPN95%置信區(qū)間陽性管數(shù)MPN95%置信區(qū)間0.100.010.001上限下限0.100.010.001上限下限000000111111112222220011230001122300011101010001201010012012＜3.03.03.06.16.29.43.67.2117.4111115169.21420152027-0.150.151.21.23.60.171.33.61.33.63.64.54.51.43.64.53.74.58.79.59.611181838181838203842424238424242429422222333333333333333222330001111222233330120101201230123012321283529362338644375120160931502102902404601100＞11004.58.78.78.78.74.68.71791737401837409042901804204294949494941101801802004204204204204301000100020004100—注1：本表采用3個(gè)稀釋度[0.1g(mL)、0.01g(mL)和0.001g(mL)]，每個(gè)稀釋接種3管。注2：表所列檢樣量如改用1g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)時(shí)，表數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低10倍；如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)、0.0001g(mL)時(shí)，則表數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增高10倍，其余類推。C大腸菌群計(jì)數(shù)檢驗(yàn)流程圖第一法MPN計(jì)數(shù)法第二法平板計(jì)數(shù)法附錄4大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)第一法MPN計(jì)數(shù)法1.樣品的稀釋1.1固體和半固體樣品：稱取25g樣品，放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水均質(zhì)1min～2min,制成1:10的樣品勻液。1.2液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶〔瓶預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠〕中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。1.3樣品勻液的pH值應(yīng)在6.5～7.5之間，必要時(shí)分別用1mol/LNaOH或1mol/LHCl調(diào)節(jié)。1.4用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中〔注意吸頭尖端不要觸及稀釋液面〕，換用1支1mL無菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。1.5根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15min。2.初發(fā)酵試驗(yàn)每個(gè)樣品，選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液〔液體樣品可以選擇原液〕，每個(gè)稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨〔LST〕肉湯，每管接種1mL〔如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯〕，36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，觀察倒管是否有氣泡產(chǎn)生，24h±2h產(chǎn)氣者進(jìn)展復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h，產(chǎn)氣者進(jìn)展復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。產(chǎn)氣者進(jìn)展復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。如所有LST肉湯管均未產(chǎn)氣，即可報(bào)告大腸埃希氏菌MPN結(jié)果。3.復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于已提前預(yù)溫至45℃的EC肉湯管中，放入帶蓋的44.5℃±0.2℃水浴箱。水浴的水面應(yīng)高于肉湯培養(yǎng)基液面，培養(yǎng)24h±2h，檢查小倒管是否有氣泡產(chǎn)生，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h。記錄在24h和48h產(chǎn)氣的EC肉湯管數(shù)。如所有EC肉湯管均未產(chǎn)氣，即可報(bào)告大腸埃希氏菌MPN結(jié)果；如有產(chǎn)氣者，則進(jìn)展EMB平板別離培養(yǎng)。4.伊紅美藍(lán)平板別離培養(yǎng)輕輕振搖各產(chǎn)氣管，用接種環(huán)取培養(yǎng)物分別劃線接種于EMB平板，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。觀察平板上有無具黑色中心有光澤或無光澤的典型菌落。5.營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面或平板培養(yǎng)從每個(gè)平板上挑5個(gè)典型菌落，如無典型菌落則挑取可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位，移種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面或平板上，36℃±1℃，培養(yǎng)18h～24h。取培養(yǎng)物進(jìn)展革蘭氏染色和生化試驗(yàn)。6.鑒定取培養(yǎng)物進(jìn)展靛基質(zhì)試驗(yàn)、MR〔甲基紅〕-VP試驗(yàn)和檸檬酸鹽利用試驗(yàn)〔詳見生化試劑盒使用〕。5.3大腸埃希氏菌MPN計(jì)數(shù)的報(bào)告大腸埃希氏菌為革蘭氏陰性無芽胞桿菌，發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，IMViC生化試驗(yàn)為＋＋――或－＋－－。只要有1個(gè)菌落鑒定為大腸埃希氏菌，其所代表的LST肉湯管即為大腸埃希氏菌陽性。依據(jù)LST肉湯陽性管數(shù)查MPN表〔見D，表2〕，報(bào)告每g〔mL〕樣品腸埃希氏菌MPN值。第二法平板計(jì)數(shù)法1.樣品稀釋按第一法中的1進(jìn)展2.平板計(jì)數(shù)2.1選取2個(gè)～3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液，每個(gè)稀釋度接種2個(gè)無菌平皿，每皿1mL。同時(shí)取1mL稀釋液參加無菌平皿做空白對(duì)照。2.2將10mL～15mL冷至45℃±0.5℃的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂〔VRBA〕傾注于每個(gè)平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣品勻液充分混勻。待瓊脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA-MUG覆蓋平板表層。凝固后翻轉(zhuǎn)平板，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。2.3平板菌落數(shù)的選擇選擇菌落數(shù)在10CFU～100CFU之間的平板，暗室中360nm～366nm波長(zhǎng)紫外燈照射下，計(jì)數(shù)平板上發(fā)淺藍(lán)色熒光的菌落。檢驗(yàn)時(shí)用MUG陽性菌株〔如大腸埃希氏菌ATCC25922〕和產(chǎn)氣腸桿菌〔如ATCC13048〕做陽性和陰性對(duì)照。3.大腸埃希氏菌平板計(jì)數(shù)的報(bào)告兩個(gè)平板上發(fā)熒光菌落數(shù)的平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，報(bào)告每g〔mL〕樣品腸埃希氏菌數(shù)，以CFU/g(mL)表示。假設(shè)所有稀釋度〔包括液體樣品原液〕平板均無菌落生長(zhǎng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告。D表2大腸埃希氏菌最可能數(shù)〔MPN〕檢索表陽性管數(shù)MPN95%置信區(qū)間陽性管數(shù)MPN95%置信區(qū)間0.100.010.001上限下限0.100.010.001上限下限000000111111112222220011230001122300011101010001201010012012＜3.03.03.06.16.29.43.67.2117.4111115169.21420152027-0.150.151.21.23.60.171.33.61.33.63.64.54.51.43.64.53.74.58.79.59.611181838181838203842424238424242429422222333333333333333222330001111222233330120101201230123012321283529362338644375120160931502102902404601100＞11004.58.78.78.78.74.68.71791737401837409042901804204294949494941101801802004204204204204301000100020004100—注1：本表采用3個(gè)稀釋度[0.1g(mL)、0.01g(mL)和0.001g(mL)]，每個(gè)稀釋接種3管。注2：表所列檢樣量如改用1g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)時(shí)，表數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低10倍；如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)、0.0001g(mL)時(shí)，則表數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增高10倍，其余類推。E大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)檢驗(yàn)流程圖第一法MPN計(jì)數(shù)第二法平板計(jì)數(shù)法附錄5沙門氏菌檢驗(yàn)1.前增菌稱取25g〔mL〕樣品放入盛有225mLBPW的容器中，均質(zhì)1min～2min。假設(shè)樣品為液態(tài)，振蕩混勻。如需測(cè)定pH值，用1mol/mL無菌NaOH或HCl調(diào)pH至6.8±0.2。無菌操作將樣品轉(zhuǎn)至500mL錐形瓶中，于36℃±1℃培養(yǎng)8h～18h。如為冷凍產(chǎn)品，應(yīng)在45℃以下不超過15min，或2℃～5℃不超過18h解凍。2.增菌輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)過的樣品混合物，移取1mL，轉(zhuǎn)種于10mLTTB，于42℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。同時(shí)，另取1mL，轉(zhuǎn)種于10mLSC，于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。3.別離分別用接種環(huán)取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個(gè)BS瓊脂平板和一個(gè)*LD瓊脂平板。于36℃±1℃分別培養(yǎng)18h～24h〔*LD瓊脂平板〕或40h～48h〔BS瓊脂平板〕，觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落,各個(gè)平板上的菌落特征見表3：表3沙門氏菌屬在不同選擇性瓊脂平板上的菌落形態(tài)選擇性瓊脂平板沙門氏菌BS瓊脂菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變。*LD瓊脂菌落呈粉紅色，帶或不帶黑色中心，有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中心，或呈現(xiàn)全部黑色的菌落；有些菌株為黃色菌落，帶或不帶黑色中心。沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基按照顯色培養(yǎng)基的說明進(jìn)展判定。4.生化試驗(yàn)4.1自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個(gè)以上典型或可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂，先在斜面劃線，再于底層穿刺；接種針不要滅菌，直接營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，必要時(shí)可延長(zhǎng)至48h。4.2用接種針挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板純培養(yǎng)物，分別接種賴氨酸和賴氨酸對(duì)照管，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基，沙門氏菌屬的反響結(jié)果見表4。表4沙門氏菌屬在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫酸酶試驗(yàn)培養(yǎng)基的反響結(jié)果三糖鐵瓊脂賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基初步判斷斜面底層產(chǎn)氣硫化氫KA＋〔－〕＋〔－〕＋可疑沙門氏菌屬KA＋〔－〕＋〔－〕－可疑沙門氏菌屬AA＋〔－〕＋〔－〕＋可疑沙門氏菌屬AA＋/－＋/－－非沙門氏菌KK＋/－＋/－＋/－非沙門氏菌注：K〔產(chǎn)堿，紅色〕；A〔產(chǎn)酸，黃色〕；產(chǎn)氣〔斷層〕；產(chǎn)硫化氫〔變黑〕＋〔陽性，〕；－〔陰性〕；＋〔－〕：多數(shù)陽性，少數(shù)陰性；＋/－：陽性或陰性。4.3當(dāng)三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)的初步判斷為可疑沙門氏菌屬時(shí)，用接種環(huán)挑取〔較大菌落取一半菌落，小菌落取一個(gè)〕營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板純培養(yǎng)物，接種到3mL無菌水中，振搖制成約0.5麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙?，用無菌吸管接種于沙門氏菌干制生化鑒定盒〔路橋〕的9個(gè)圓孔中，每孔0.2mL菌懸液，蓋上盒蓋，于36℃±1℃培養(yǎng)。各生化反響的培養(yǎng)及結(jié)果見表5、表6。注：將已挑菌落的平板儲(chǔ)存于2℃～5℃或室溫至少保存24h，以備必要時(shí)復(fù)查。表5生化試劑盒〔路橋〕結(jié)果判定表試驗(yàn)工程結(jié)果判定沙門氏菌生化現(xiàn)象培養(yǎng)時(shí)間說明備注陰性結(jié)果陽性結(jié)果氨基酸對(duì)照————黃色18h～24h接種后需滴加2-3滴滅菌液體石蠟覆蓋培養(yǎng)及外表出現(xiàn)黃色即為陰性賴氨酸脫羧酶對(duì)照管黃色對(duì)照管黃色陽性或陰性試驗(yàn)管黃色試驗(yàn)管紫色氰化鉀對(duì)照————生長(zhǎng)24h～48h生長(zhǎng)為混濁氰化鉀對(duì)照管生長(zhǎng)對(duì)照管生長(zhǎng)不生長(zhǎng)試驗(yàn)管不生長(zhǎng)試驗(yàn)管生長(zhǎng)靛基質(zhì)黃色玫瑰紅色大多數(shù)陰性18h～24h培養(yǎng)后滴加2-3滴靛基質(zhì)試劑，即刻觀察。-------尿素黃色或橙色玫瑰紅色或紅色18h～24h——-------甘露醇藍(lán)色或綠色黃色陽性18h～24h——-------山梨醇大多數(shù)陽性O(shè)NPG不變色黃色陽性或陰性1h～3h和24h——-------表6沙門氏菌屬生化反響初步鑒別表反響序號(hào)硫化氫〔H2S〕靛基質(zhì)pH7.2尿素氰化鉀〔K〕賴氨酸脫羧酶A1＋－－－＋A2＋＋－－＋A3－－－－＋/－注：＋陽性；－陰性；＋/－陽性或陰性。4.3.1反響序號(hào)A1：典型反響判定為沙門氏菌屬。如尿素、K和賴氨酸脫羧酶3項(xiàng)中有1項(xiàng)異常，按表7可判定為沙門氏菌。如有2項(xiàng)異常為非沙門氏菌。表7沙門氏菌屬生化反響初步鑒別表pH7.2尿素氰化鉀〔K〕賴氨酸脫羧酶判定結(jié)果－－－甲型副傷寒沙門氏菌〔要求血清學(xué)鑒定結(jié)果〕－＋＋沙門氏菌Ⅳ或Ⅴ〔要求符合本群生化特性〕＋－＋沙門氏菌個(gè)別變體〔要求血清學(xué)鑒定結(jié)果〕注：＋表示陽性；－表示陰性。4.3.2反響序號(hào)A2：補(bǔ)做甘露醇和山梨醇試驗(yàn)，沙門氏菌靛基質(zhì)陽性變體兩項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果均為陽性，但需要結(jié)合血清學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)展判定。4.3.3反響序號(hào)A3：補(bǔ)做ONPG。ONPG陰性為沙門氏菌。大局部沙門氏菌為賴氨酸脫羧酶陽性，甲型副傷寒沙門氏菌為賴氨酸脫羧酶陰性。4.5血清學(xué)鑒定4.5.1抗原的準(zhǔn)備一般采用1.2％～1.5％瓊脂培養(yǎng)物作為玻片凝集試驗(yàn)用的抗原。O血清不凝集時(shí)，將菌株接種在瓊脂量較高的〔如2％～3％〕培養(yǎng)基上再檢查；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反響時(shí)，可挑取菌苔于1mL生理鹽水中做成濃菌液，于酒精燈火焰上煮沸后再檢查。H抗原發(fā)育不良時(shí)，將菌株接種在0.55％～0.65％半固體瓊脂平板的中央，俟菌落蔓延生長(zhǎng)時(shí)，在其邊緣局部取菌檢查；或?qū)⒕晖ㄟ^裝有0.3％～0.4％半固體瓊脂的小玻管1次～2次，自遠(yuǎn)端取菌培養(yǎng)后再檢查。4.5.2多價(jià)菌體抗原〔O〕鑒定在玻片上劃出2個(gè)約1cm×2cm的區(qū)域，挑取1環(huán)待測(cè)菌，各放1/2環(huán)于玻片上的每一區(qū)域上部，在其中一個(gè)區(qū)域下部加1滴多價(jià)菌體〔O〕抗血清，在另一區(qū)域下部參加1滴生理鹽水，作為對(duì)照。再用無菌的接種環(huán)或針分別將兩個(gè)區(qū)域的菌落研成乳狀液。將玻片傾斜搖動(dòng)混合1min，并對(duì)著黑暗背景進(jìn)展觀察，任何程度的凝集現(xiàn)象皆為陽性反響。1.6結(jié)果與報(bào)告綜合以上生化試驗(yàn)和血清學(xué)鑒定的結(jié)果，報(bào)告25g〔mL〕樣品中檢出或未檢出沙門氏菌。附錄6金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)第一法金黃色葡萄球菌定性檢驗(yàn)1操作步驟1.1樣品的處理稱取25g樣品至盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯容器中，均質(zhì)1min～2min。假設(shè)樣品為液態(tài)，吸取25mL樣品至盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯的無菌錐形瓶(瓶可預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中，振蕩混勻。1.2增菌和別離培養(yǎng)1.2.1將上述樣品勻液于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。金黃色葡萄球菌在7.5%氯化鈉肉湯中呈混濁生長(zhǎng)。1.2.2將上述培養(yǎng)物，分別劃線接種到Baird-Parker平板和血平板，血平板36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。Baird-Parker平板36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h或45h～48h。1.2.3金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直徑為2mm～3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落有似奶油至樹膠樣的硬度，偶然會(huì)遇到非脂肪溶解的類似菌落；但無混濁帶及透明圈。長(zhǎng)期保存的冷凍或枯燥食品中所別離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并枯燥。在血平板上，形成菌落較大，圓形、光滑凸起、濕潤(rùn)、金黃色〔有時(shí)為白色〕，菌落周圍可見完全透明溶血圈。挑取上述菌落進(jìn)展革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗(yàn)。1.3鑒定1.3.1染色鏡檢：金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，排列呈葡萄球狀，無芽胞，無莢膜，直徑約為0.5μm～1μm。1.3.2血漿凝固酶試驗(yàn)：挑取、Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1個(gè)或以上，分別接種到5mLBHI和營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。取新鮮配置兔血漿0.5mL，放入小試管中，再參加BHI培養(yǎng)物0.2mL～0.3mL，振蕩搖勻，置36℃±1℃溫箱或水浴箱，每半小時(shí)觀察一次，觀察6h，如呈現(xiàn)凝固〔即將試管傾斜或倒置時(shí)，呈現(xiàn)凝塊〕或凝固體積大于原體積的一半，被判定為陽性結(jié)果。同時(shí)以血漿凝固酶試驗(yàn)陽性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對(duì)照。也可用商品化的試劑，按說明書操作，進(jìn)展血漿凝固酶試驗(yàn)。結(jié)果如可疑，挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落到5mLBHI，36℃±1℃培養(yǎng)18h～48h，重復(fù)試驗(yàn)。1.5結(jié)果與報(bào)告1.5.1結(jié)果判定：符合1.2.3、1.3，可判定為金黃色葡萄球菌。1.5.2結(jié)果報(bào)告：在25g〔mL〕樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。第二法金黃色葡萄球菌Baird-Parker平板計(jì)數(shù)2操作步驟2.1樣品的稀釋2.1.1固體和半固體樣品：稱取25g樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的容器，均質(zhì)1min～2min，制成1:10的樣品勻液。2.1.2液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶〔瓶預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠〕中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。2.1.3用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注