第8章第1節(jié)基因診斷(3,LMJ)

一、基因診斷的概念和特點二、基因診斷的主要技術(shù)方法三、常見的基因異常及其檢測四、疾病的基因診斷(自習(xí))五、基因診斷在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用第一節(jié)基因診斷(gene

diagnosis)2023/6/271本文檔共53頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期三\8點48分

基因診斷通常是指利用分子生物學(xué)的方法技術(shù)，直接檢測體內(nèi)DNA的結(jié)構(gòu)變異或RNA的水平變化，從而對疾病作出診斷的方法。一、基因診斷的概念和特點（一）概念

適用于遺傳性疾病、感染性疾病、腫瘤等多種疾病的診斷，以及個體識別和親子鑒定等法病學(xué)領(lǐng)域。2023/6/272本文檔共53頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期三\8點48分（二）特點--以已知基因作為檢測對象（l）特異性強：直接檢測導(dǎo)致疾病發(fā)生的基因變化；（2）靈敏度高：所采用的分子雜交和聚合酶鏈反應(yīng)等技術(shù)都具有信號放大作用；（3）取樣便利：一般不受組織或時相的限制；（4）早期診斷：易在疾病尚無臨床表現(xiàn)時作出診斷；（5）應(yīng)用廣泛：可檢測自體基因和外源基因。一、基因診斷的概念和特點2023/6/273本文檔共53頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期三\8點48分(一)核酸分子雜交（NAhybridization）(二)聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）技術(shù)(三)單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）(四)DNA分子多態(tài)性（DNApolymorphism）分析(五)限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析(六)顯微切割（microdissection）技術(shù)4(七)DNA序列測定（DNAsequencing）二、基因診斷的主要技術(shù)方法2023/6/274本文檔共53頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期三\8點48分(一)核酸分子雜交4.DNA芯片(DNAchip)技術(shù)

Southern/DNA印跡、Northern/RNA印跡(第七/六章)和Western/蛋白質(zhì)印跡(第九/二章)其他雜交方法:1.斑點印跡(dotblotting)與狹縫雜交2.組織原位雜交(tissureinsituhybridization)3.等位基因特異性寡核苷酸雜交(allele-specificoligonucleotidehybridization,ASOH)二、基因診斷的主要技術(shù)方法2023/6/275本文檔共53頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期三\8點48分61.斑點印跡(dotblotting)雜交將核酸(DNA或RNA)樣品點在NC膜上，變性后與標(biāo)記探針結(jié)合，顯影或顯色，密度測量，與對照品比較確定所測核酸量的高低。方法：應(yīng)用：主要用于檢測細胞基因拷貝數(shù)的變化或者mRNA含量的變化。便于大規(guī)模檢測和篩選；容易出現(xiàn)假陽性。特點：2023/6/276本文檔共53頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期三\8點48分Slot-blot結(jié)果GS-670型光密度掃描儀(Bio-Rad)

本文檔共53頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期三\8點48分82.組織原位雜交(tissureinsituhybridization)組織或細胞(新鮮組織切片、細胞涂片或石蠟切片)樣品做適當(dāng)處理(如固定劑固定、蛋白酶消化)，使其通透性增大，標(biāo)記探針進入細胞內(nèi)與核酸雜交。方法：應(yīng)用：被檢測基因或mRNA在細胞內(nèi)的檢測及定位。特點：不需提取被檢核酸，可確定被檢核酸細胞內(nèi)定位。1986創(chuàng)建的熒光原位雜交(FISH)用于特定基因的定位及其缺失、擴增或重排的檢測。2023/6/278本文檔共53頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期三\8點48分2023/6/279本文檔共53頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期三\8點48分原癌基因ERBB-2(Her-2)，基因擴增熒光原位雜交檢測2023/6/2710本文檔共53頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期三\8點48分熒光原位雜交2023/6/2711本文檔共53頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期三\8點48分3.等位基因特異性寡核苷酸雜交(ASOH)根據(jù)已知基因突變位點的堿基序列，設(shè)計和制備與野生型或突變型基因序列片段互補的兩種探針，分別與被檢DNA進行雜交，確定基因突變存在與否，分辨純/雜合子。方法：應(yīng)用：基因結(jié)構(gòu)變異所致疾病的診斷。特點：雜交條件要求嚴格，以避免出現(xiàn)假陽性或假陰性。2023/6/2712本文檔共53頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期三\8點48分N：正?；?；H：雜合子基因；M：突變基因ASO1ASO2NHMASOH示意圖2023/6/2713本文檔共53頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期三\8點48分4.DNA芯片(DNAchip)技術(shù)DNA點陣(DNAarray)——把多種已知序列的DNA片段排列在固體支持物上，同時對樣品中的多種核酸進行檢測和分析。方法：應(yīng)用：單核苷酸多態(tài)性(SNP)、基因表達譜和遺傳性疾病的分析；病原微生物的大規(guī)模檢測。DNA微陣列(DNAmicroarray)——通過計算機控制點樣和圖像掃描的高密度集成探針的雜交技術(shù)。2023/6/2714本文檔共53頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期三\8點48分(二)PCR技術(shù)(第七/七章)1.PCR技術(shù)的原理以DNA分子為模板，加入與擬擴增DNA片段兩端分別互補的一對寡核苷酸鏈作為引物，在DNA聚合酶的催化下，按照半保留復(fù)制的形式分別合成兩股新的DNA互補鏈，可使兩引物間的DNA片段拷貝數(shù)增加一倍。

多次重復(fù)這一過程，可使這段DNA拷貝數(shù)隨復(fù)制次數(shù)以指數(shù)形式擴增。二、基因診斷的主要技術(shù)方法2023/6/2715本文檔共53頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期三\8點48分2.基因診斷中常用的PCR及其衍生技術(shù)(1)DNA的微量分析

總RNA(或mRNA)ss-cDNAds-cDNAPCR擴增PCR法靈敏度高，對模板DNA純度要求不高，且樣品用量極微(如一滴血、一根頭發(fā)等)。(2)RT-PCR(reversetranscriptional-PCR)2023/6/2716本文檔共53頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期三\8點48分17(3)巢式-PCR(nestedPCR)用2對引物(外引物、內(nèi)引物)擴增，大大提高了擴增的特異性(4)不對稱PCR(asymmetricPCR)2個引物濃度不等，一般采用50:1或100:1的摩爾比，主要獲取單鏈DNA作構(gòu)象分析或用作探針。2023/6/2717本文檔共53頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期三\8點48分18(5)多重PCR(multiplexPCR)在同反應(yīng)體系中加入多對引物，同時擴增同一DNA樣品中的多個不同序列區(qū)域，且每對引物所擴增的產(chǎn)物長度都不同，可根據(jù)電泳結(jié)果判斷是否存在某些基因片段的缺失或長度改變。(6)等位基因特異性PCR(AS-PCR)

針對等位基因的序列差異區(qū)域設(shè)計引物，使引物的3’端與等位基因序列的差異堿基對應(yīng)，僅能與突變型或野生型互補。2023/6/2718本文檔共53頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期三\8點48分(7)原位PCR(insituPCR,IS-PCR)技術(shù)

1)細胞和組織經(jīng)固定劑固定、蛋白酶消化，使細胞獲得適度的通透性，既利于PCR反應(yīng)試劑到達靶位，又可防止擴增產(chǎn)物從細胞內(nèi)漏出；

2)把載玻片的靶DNA進行常規(guī)PCR(病毒RNA的擴增用RT-PCR);

3)最后通過間接法(原位雜交)或直接法(PRC過程中加入標(biāo)記)檢測擴增產(chǎn)物。2023/6/2719本文檔共53頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期三\8點48分（8）實時熒光定量PCR

PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而使熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號；每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。2023/6/2720本文檔共53頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期三\8點48分21(三)單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析利用單個或多個堿基不同、但序列長度相等的雙鏈核酸分子，經(jīng)變性成單鏈后可具有不同的構(gòu)象而在中性PAGE電泳中的遷移率不同；(singlestrandcomformationpolymorphism,SSCP)與正常的電泳圖型對照，出現(xiàn)新條帶即可判定存在堿基變異。二、基因診斷的主要技術(shù)方法2023/6/2721本文檔共53頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期三\8點48分與PCR聯(lián)用稱為PCR-SSCP；廣泛用于大批樣品基因突變的檢測(初篩)。2023/6/2722本文檔共53頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期三\8點48分231.限制性片段長度多態(tài)性的檢測3.單核苷酸多態(tài)性2.數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性的檢測(四)DNA分子多態(tài)性(DNApolymorphism)分析(singlenucleotidepolymorphism,SNP)(variablenumberoftandemrepeats,VNTR)(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)二、基因診斷的主要技術(shù)方法2023/6/2723本文檔共53頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期三\8點48分24VNTR的重復(fù)序列出現(xiàn)次數(shù)在6次100次之間；小衛(wèi)星DNA(minisatelliteDNA):重復(fù)單元長度為6~70bp；微衛(wèi)星DNA(microsatelliteDNA):重復(fù)單元長度為1~6bp。短串聯(lián)重復(fù)DNA(shorttandemrepeatDNA,STRDNA):重復(fù)單元長度為2~6bp。根據(jù)重復(fù)單元長度可分為：2023/6/2724本文檔共53頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期三\8點48分25不同個體間重復(fù)單元[如(CA)n/(TG)n]的拷貝數(shù)(即出現(xiàn)的頻率)不同，因而產(chǎn)生多態(tài)性，稱為VNTR多態(tài)性。VNTR多態(tài)性：限制酶識別位點限制酶識別位點2023/6/2725本文檔共53頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期三\8點48分26(五)限制酶譜分析當(dāng)某種限制酶的切點改變時(由點突變、單個堿基的插入或缺失引起)，用該種限制酶切割后得到的DNA片段的大小和數(shù)目都隨之發(fā)生變化，通過電泳分析即可作出判斷。PCR-RFLP設(shè)計適當(dāng)?shù)臄U增引物，使擴增片段包括某一個或數(shù)個限制性內(nèi)切酶識別序列，在PCR擴增后用該限制酶切割PCR產(chǎn)物，根據(jù)電泳后酶切片段長度變化，即可作出診斷。二、基因診斷的主要技術(shù)方法2023/6/2726本文檔共53頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期三\8點48分ABCDEFG－＋DEFBGCA-GAATTC--CTTAAG-EFBG－＋C+DAEcoRⅠ限制性內(nèi)切酶位點的變化2023/6/2727本文檔共53頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期三\8點48分28(六)顯微切割(microdissection)技術(shù)是應(yīng)用激光捕獲顯微鏡，在高倍鏡下選擇幾個甚至一個細胞進行分析；可用于石蠟包埋組織進行回顧性診斷。2.染色體的顯微切割。1.組織細胞的顯微切割是切割分裂中期的染色體的目的區(qū)域，如某些斷裂或易位、倒位位點的染色體片段，再進行后續(xù)分析。二、基因診斷的主要技術(shù)方法2023/6/2728本文檔共53頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期三\8點48分

瑞士MIICellCut全自動激光顯微切割（熒光）系統(tǒng)

可通過紫外激光切割需要分離的組織，然后通過有黏性的Eppendorff管蓋進行收集，這樣就可以將特定類型的細胞從組織切片上分離下來。2023/6/2729本文檔共53頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期三\8點48分可以準確、快速、無損傷地分離出純凈的特定細胞或組織，保持細胞內(nèi)生物分子的完整性，以便用于后續(xù)的DNA、RNA和蛋白質(zhì)分析。配有近紅外激光(波長810nm)；紫外激光(波長349nm)；紅色、綠色、藍色三種熒光濾光片。美國Arcturus公司的Veritas激光捕獲顯微分離儀2023/6/2730本文檔共53頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期三\8點48分PICS

Altra

II流式細胞儀(分析分選)2023/6/2731本文檔共53頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期三\8點48分32(七)DNA序列測定該法是基因診斷所有的技術(shù)方法中最準確最可靠的—種。缺點：費時、費力、費用高。二、基因診斷的主要技術(shù)方法2023/6/2732本文檔共53頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期三\8點48分33(一)點突變的檢測三、常見的基因異常及其檢測(二)大片段核苷酸丟失或插入的檢測(三)基因重排的檢測(四)基因擴增的檢測(五)DNA多態(tài)性的檢測(六)基因表達異常的檢測(七)病原體基因的檢測2023/6/2733本文檔共53頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期三\8點48分34(一)點突變的檢測

狹義的點突變指堿基替代，分為單點突變和多點突變；廣義的點突變還包括少數(shù)核苷酸的缺失或插入。1.已知點突變的檢測突變位點已被闡明的遺傳病，可采用PCR等位基因特異性寡核苷酸雜交(PCR/AS0H)檢測。三、常見的基因異常及其檢測2023/6/2734本文檔共53頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期三\8點48分PCR/AS0H

檢測:(1)根據(jù)突變點上下游的序列設(shè)計合成引物，PCR擴增出突變區(qū)的DNA片段。(2)將PCR產(chǎn)物用斑點或狹縫點樣器點在尼龍膜上，以紫外線照射固定。(3)針對上述每種突變位點，分別合成2個寡核苷酸探針；其中一個具有正常的堿基序列，另一個則具有突變的堿基序列。(4)分別預(yù)雜交、雜交、洗膜、放射自顯影或顯色。(5)分析正常探針及突變探針分別雜交得到的顯影或顯色圖譜，即可作出基因診斷2023/6/2735本文檔共53頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期三\8點48分N：正?；?；H：雜合子基因；M：突變基因ASO1ASO2NHM(PCR/AS0H檢測示意圖)2023/6/2736本文檔共53頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期三\8點48分2.未知點突變的檢測初篩：PCR-SSCP分析法確認：DNAsequencing。2023/6/2737本文檔共53頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期三\8點48分PCR-SSCP:廣泛用于大批樣品基因突變的檢測(初篩)。2023/6/2738本文檔共53頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期三\8點48分3.少數(shù)核苷酸缺失或插入的檢測可供選擇的方法：PCR-RFLP分析、AS-PCR、PCR-SSCP及DNA測序等2023/6/2739本文檔共53頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期三\8點48分鐮形細胞貧血原因：β-珠蛋白鏈第6位密碼子GAG→GTG，造成Glu→Val所致。方法：設(shè)計一對引物PCR擴增可得294bp，OxaNI

消化，電泳。294191103bpAA：正常人BB：純合子病人CC：雜合子病人結(jié)果：2023/6/2740本文檔共53頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期三\8點48分(二)大片段核苷酸丟失或插入的檢測1.中等長度(0.5-1.5kb)的DNA片段缺失或插入，可用一對引物的普通PCR檢測。2.若基因較大度(大于1.5kb)，且多個位點存在插入或缺失、位點間距離較遠，宜采用多重PCR法檢測。5’3’3’5’（多重PCR的引物設(shè)計示意圖）三、常見的基因異常及其檢測2023/6/2741本文檔共53頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期三\8點48分DMD基因定位于人類X染色體短臂Xp21.2上。位于該區(qū)的dystrophin(肌營養(yǎng)不良蛋白)基因的突變或部分缺失，是導(dǎo)致DMD的原發(fā)病因。

dystrophin基因中有9個易發(fā)生缺失的熱點區(qū)片段,它們分別位于外顯子4、8、12、17、19、44、45、48和51。杜氏肌營養(yǎng)不良癥(Duchennemusculardystrophy,

DMD)2023/6/2742本文檔共53頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期三\8點48分多重PCR法檢測中的基因突變同時用2對引物雙重擴增dystrophin基因外顯子17和48區(qū)域內(nèi)的2個片段，可檢測出75％左右的基因缺失型患者；

若同時用9對引物多重擴增，則可以檢測到90％左右的基因缺失型患者。2023/6/2743本文檔共53頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期三\8點48分(三)基因重排的檢測基因從一條染色體的正常位置轉(zhuǎn)移到其他染色體的某個位置稱基因易位或重排。1.熒光原位雜交技術(shù)(FISH)。2.PCR擴增可用不同顏色的熒光標(biāo)記DNA探針，可在染色體上定位基因或DNA片段及它們彼此間的排序。

前提條件是已知重排基因和位點的序列。三、常見的基因異常及其檢測2023/6/2744本文檔共53頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期三\8點48分熒光原位雜交（雙色FISH）2023/6/2745本文檔共53頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期三\8點48分(四)基因擴增的檢測基因擴增指基因拷貝數(shù)增加的現(xiàn)象,可增加幾十到上千倍?？捎么郎y基因的DNA片段或cDNA片段為探針，基因組DNA采用適當(dāng)?shù)南拗泼该盖泻笞鱏outhern印跡雜交分析。三、常見的基因異常及其檢測2023/6/2746本文檔共53頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期三\8點48分

(五)DNA多態(tài)性的檢測

1.限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)2.數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)多性多態(tài)性位點周圍DNA序列已知時，可用PCR/RFLP分析。針對串聯(lián)重復(fù)序列兩側(cè)的DNA序列設(shè)計引物，PCR擴增后電泳。三、常見的基因異常及其檢測2023/6/2747本文檔共53頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期三\8點48分1.mRNA的相對定量分析

(1)斑點雜交或狹線雜交放射或非放射標(biāo)記的cDNA探針與待測RNA雜交，經(jīng)顯影或顯色，與正常對照比較即可定量待測RNA。(2)RT-PCR法

對電泳凝膠中的擴增產(chǎn)物cDNA行光密度掃描，計算模板mRNA的量；若dNTPs帶放射性標(biāo)記，作放射活性測定，并由此推算mRNA的含量。(六)基因表達異常的檢測三、常見的基因異常及其檢測2023/6/2748本文檔共53頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期三\8點48分2.mRNA的絕對定量分析

(1)采用一系列已知不同濃度的與待測mRNA序列相同但長度不同的內(nèi)對照mRNA，在同一體系中一同進行RT-PCR(加32p-dCTP)，擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，分別測定兩者放射性強度，繪制標(biāo)準曲線即可查出特異mRNA的量。(2)用熒光定量PCR法對擴增產(chǎn)物定量。3.mRNA的長度分析(2)先分析RT-PCR產(chǎn)物電泳條帶長度，后測序確認。(