生物樣品前處理詳解

生物樣品前處理詳解演示文稿本文檔共27頁；當前第1頁；編輯于星期二\3點24分優(yōu)選生物樣品前處理本文檔共27頁；當前第2頁；編輯于星期二\3點24分第一節(jié)樣品分離的預提取第二節(jié)細胞的破碎與分離第一章緒論3第二章生物樣品前處理本文檔共27頁；當前第3頁；編輯于星期二\3點24分第一節(jié)樣品分離的預提?。ㄇ疤幚恚┣疤幚淼哪康模簩δ繕私M分進行初步富集，對干擾成分進行去除；

2.1.1概述預處理材料的種類和特點

動物細胞反應液植物細胞反應液微生物細胞反應液植物組織提取液動物組織提取液“發(fā)酵液”“產(chǎn)物”，胞內(nèi)or胞外？組織4第二章生物樣品前處理本文檔共27頁；當前第4頁；編輯于星期二\3點24分2.1.2植物組織提取物的制備植物組織材料來源部位不同，前處理方法不同。葉片、根、莖——清洗去泥沙、灰塵等雜質(zhì)（-4°C——-30°C低溫保存?zhèn)溆茫?；種子（大豆、蓮子）、中藥提取的原材料等——泡漲，粉碎。5第二章生物樣品前處理本文檔共27頁；當前第5頁；編輯于星期二\3點24分一些酶必須從富含酚、多酚的綠葉、水果和其它組織中提取，大量的分類化合物給提取帶來困難。在完整的細胞組織中，酶和酚類物質(zhì)處于彼此隔離的狀態(tài)，細胞組織被破壞后，彼此接觸，很容易發(fā)生酶促反應，反應產(chǎn)物苯醌和單寧類還會繼續(xù)和酶蛋白質(zhì)反應，破壞目的酶的活性。所以要在預處理階段去除酚類化合物。2.1.2.1植物組織中酶的提取6第二章生物樣品前處理本文檔共27頁；當前第6頁；編輯于星期二\3點24分例子：植物組織中二磷酸核酮糖碳酸酶的提取1.步驟：100g新鮮葉片→切成小片（打孔器、切片）→置入提取液中（穩(wěn)定酶活性）→PVPP預浸泡（不溶性聚乙烯聚吡咯烷酮，可溶性PVP聚乙烯吡咯烷酮，）→間歇高速攪拌（充分接觸混勻）→紗布過濾→濾液加入PVPP重復輕攪（重復一次）→離心去除PVPP→酶粗提液。7第二章生物樣品前處理本文檔共27頁；當前第7頁；編輯于星期二\3點24分2.條件討論低溫（4～5度），器皿、溶液預冷、操作要快；5～7倍于固形材料的提取液，攪拌不產(chǎn)生氣泡（氣泡不利于酶活穩(wěn)定）；PH6.5~7.0，中性，未知蛋白酶要遠離等電點；PVPP優(yōu)良，不溶性；PPO抑制劑，DTT、2-ME；蛋白酶抑制劑PMSF（苯甲磺酰氟）酒精溶解，劇毒。8第二章生物樣品前處理本文檔共27頁；當前第8頁；編輯于星期二\3點24分2.1.2.2多糖提取重要活性多糖步驟：原料→粉碎→醇醚回流脫脂→水提取→粗提液去蛋白策略：Sevag法，蛋白質(zhì)在氯仿等有機溶劑中變性TCA法，低濃度的TCA可沉淀蛋白質(zhì)，離心后即可除去蛋白質(zhì)。9第二章生物樣品前處理本文檔共27頁；當前第9頁；編輯于星期二\3點24分2.1.2.3細菌重組蛋白的提取重組蛋白：工程菌可表達大量的重組目的蛋白，40%總蛋白含量，但易形成包涵體（蛋白質(zhì)以不溶形式包涵在細胞質(zhì)中）。10第二章生物樣品前處理本文檔共27頁；當前第10頁；編輯于星期二\3點24分例：E.coli.中提取重組蛋白1.步驟：酶解菌體細胞：離心收集菌體→溶菌酶→去核酸（DNaseⅠ）→電泳檢測；清洗包涵體：去除雜蛋白，保證包涵體蛋白不被溶解；溶解包涵體：釋放目的蛋白；目的蛋白再折疊：恢復活性11第二章生物樣品前處理本文檔共27頁；當前第11頁；編輯于星期二\3點24分第二節(jié)細胞的破碎與分離微生物代謝產(chǎn)物：胞外產(chǎn)物（氨基酸、細菌堿性蛋白酶、糖化酶等）胞內(nèi)產(chǎn)物（大多數(shù)蛋白質(zhì)、類脂）微生物代謝產(chǎn)物大多數(shù)分泌到胞外，但有些目標產(chǎn)物存在細胞內(nèi)部。目前重組DNA技術(shù)，表達的產(chǎn)品（如胰島素、干擾素、白細胞介素等），都是胞內(nèi)產(chǎn)物。首先必須將細胞破碎，使產(chǎn)物得以釋放，才能進一步提取。2.2.1概述12第二章生物樣品前處理本文檔共27頁；當前第12頁；編輯于星期二\3點24分2.2.2常用破碎方法機械法：珠磨法、高壓勻漿法、超聲波破碎法、X-press法等；對物料的擠壓和剪切作用非機械法：酶溶法、化學滲透法、凍融法、干燥法等；13第二章生物樣品前處理本文檔共27頁；當前第13頁；編輯于星期二\3點24分2.2.2.1珠磨法原理：進入珠磨機的細胞懸浮液與極小的研磨劑（玻功小珠、石英砂、氧化鋁d<1mm）一起快速攪拌，細胞與研磨劑之間互相碰撞、剪切，使細胞破碎，釋放內(nèi)含物。玻璃珠（石英砂、氧化鋁等研磨劑）+細胞懸浮液→研磨→釋放胞內(nèi)物14第二章生物樣品前處理本文檔共27頁；當前第14頁；編輯于星期二\3點24分破碎過程產(chǎn)生熱能，要注意熱交換，溫度控制——夾套冷卻，實驗室預冷器皿；適用于絕大多數(shù)微生物細胞的破碎高破碎率，但難以實現(xiàn)固液分離，漿狀特點：15第二章生物樣品前處理本文檔共27頁；當前第15頁；編輯于星期二\3點24分高壓勻漿器；細胞懸浮液受高壓作用→快速從針形閥射出→經(jīng)歷剪切、碰撞、高壓至常壓變化后導致細胞壁和細胞膜的破壞→釋放胞內(nèi)物2.2.2.2高速勻漿法原理16第二章生物樣品前處理本文檔共27頁；當前第16頁；編輯于星期二\3點24分特點增大壓力和破碎次數(shù)，對于高濃度的細胞或難破碎的細胞常采用多次循環(huán)操作的方法30～60Mpa最佳易造成堵塞的團狀或絲狀真菌不適合較小的革蘭氏陽性菌（細胞壁厚20-80nm，肽聚糖成分多40-90%）不適合17第二章生物樣品前處理本文檔共27頁；當前第17頁；編輯于星期二\3點24分2.2.2.3超聲破碎法可聽波（次：地震、海嘯）20~20KHz（超）?？栈F(xiàn)象指超聲波在傳播過程中與組織中的氣核或微氣泡相互作用，使其突然爆破，產(chǎn)生巨大的瞬間壓力，從而改變組織結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象?？栈F(xiàn)象引起的沖擊波和剪切力使細胞破碎工作原理18第二章生物樣品前處理本文檔共27頁；當前第18頁；編輯于星期二\3點24分適應于實驗室規(guī)模的應用（操作簡單、液量損失少，可加冰或加冷水）工作頻率25～130KHz功率正比于破碎效果細胞濃度低有利于空化泡的形成及爆破，破碎效果好于粘稠液不同的微生物需采用不同的破碎參數(shù)（功率、破碎時間、間隔時間、循環(huán)次數(shù)），G->G+>酵母。易失活物質(zhì)不宜用（超聲波可促使產(chǎn)生一些化學自由，基因使敏感活性物質(zhì)失活），可加入保護劑N2、PMSF等特點：19第二章生物樣品前處理本文檔共27頁；當前第19頁；編輯于星期二\3點24分溶菌酶（細菌），β-3，3-葡聚糖酶，β-1，6-葡聚糖酶，蛋白酶，甘露糖酶，糖苷酶，肽鍵內(nèi)切酶，殼多糖酶，細胞壁溶解酶（復合酶），酵母。酶有專一性。特點：條件溫和，核酸泄出量少，選擇性釋放產(chǎn)物（可從細胞不同位置）價格高，限制了大規(guī)模應用通用性差，不同菌種需選擇不同的酶，最佳條件不易確定；產(chǎn)物抑制的存在：在溶酶系統(tǒng)中，甘露糖→蛋白酶，葡聚糖→葡聚糖酶2.2.2.4酶溶法外加酶20第二章生物樣品前處理本文檔共27頁；當前第20頁；編輯于星期二\3點24分將新鮮的生物材料存放于一定的pH和適當?shù)臏囟认?，細胞結(jié)構(gòu)在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下發(fā)生溶解，使細胞內(nèi)含物釋放出來。特點：對不穩(wěn)定的微生物，易引起所需蛋白質(zhì)變性。自溶后，細胞懸浮液粘度上升，過濾速率下降。自溶法21第二章生物樣品前處理本文檔共27頁；當前第21頁；編輯于星期二\3點24分2.2.2.5化學滲透法原理：使用某些可以改變細胞壁或膜的通透性（滲透性）的化學試劑，使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來，稱為化學滲透法。22第二章生物樣品前處理本文檔共27頁；當前第22頁；編輯于星期二\3點24分表面活性物質(zhì)：促使細胞某些組分溶解，其增溶作用有助于細胞破碎EDTA螯合劑：與結(jié)構(gòu)中ca2+或Mg2+螯合，使其原有結(jié)構(gòu)破壞而破裂有機溶劑：甲苯、苯、二甲苯、氯仿、高級醇等，能被細胞壁中的類脂吸收，使胞壁膜溶脹，導致細胞破碎；變性劑：與水中氫鍵作用，減弱水的極性，使疏水性化合物溶于水23第二章生物樣品前處理本文檔共27頁；當前第23頁；編輯于星期二\3點24分特點選擇性釋放產(chǎn)物?？墒挂恍┹^小分子量的溶質(zhì)，如多肽和小分子的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)。細胞外形保持完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進一步提取。通用性差，某種試劑只能作用于某種特定類型細胞；時間長、效率低，胞內(nèi)物一般釋放率不超過80%；有些化學試劑有毒，在其后產(chǎn)物提取精時，需分離除去。24第二章生物樣品前處理本文檔共27頁；當前第24頁；編輯于星期二\3點24分將細胞放在低溫下突然冷凍而在室溫下緩慢融化，反復多次而達到破壁作用。由于冷凍，一方面使細胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，使細胞內(nèi)外溶液濃度變化，引起細胞膨脹而破裂。適用于細胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復多次，此外，在凍融過程中可能引起某些蛋白質(zhì)變性。2.2.2.6反復凍結(jié)——融化法原理：25第二章生物樣品前處理本文檔共27頁；當前第25頁；編輯于星期二\3點24分使細胞結(jié)合水分喪失，從而改變細胞的滲透性。當采用丙酮、丁醇或緩沖液等對干燥細胞進行處理時，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽提出來。熱空氣干燥、真空干燥、冷凍干燥干燥法26第二章生物樣品前處理本文檔共27頁；當前第26頁；編輯于星期二\3點24