狂犬病病毒分子生物學(xué)基礎(chǔ)

狂犬?。≧abies）俗稱“瘋狗病”，是由狂犬病病毒引起的一種接觸性傳染病，呈世界性流行，死亡率幾乎為100%。每年造成超過55,000人死亡，其中99%在亞洲，印度具首位，中國第二位。臨床特征是前期神經(jīng)興奮，后期意識(shí)障礙，局部和全身麻痹而死。因采取疫苗接種及綜合防治措施，目前已有日、韓、馬來、澳等36個(gè)國家消滅了狂犬病。本文檔共46頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分病原狂犬病病毒：Rabiesvirus,RV。有兩種主要抗原：一種是外膜上的糖蛋白抗原，為主要抗原，決定病毒的嗜神經(jīng)性、致病性和產(chǎn)生中和抗體；內(nèi)層的核蛋白抗原，可使體內(nèi)產(chǎn)生補(bǔ)體結(jié)合抗體和沉淀素，無保護(hù)作用。從患者或患病動(dòng)物體內(nèi)分離的毒株成為自然毒株或街毒株（streetvirus），毒力強(qiáng)；經(jīng)過腦組織多次傳代后，成為固定毒株（fixedvirus），毒力弱，可以用于疫苗制備。本文檔共46頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分病原學(xué)病毒主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、唾液腺和唾液內(nèi)。在唾液腺、海馬角、大腦皮層細(xì)胞漿內(nèi)形成嗜酸性包涵體，稱為Negribodies(NB)，是病毒復(fù)制和裝配的場所。病毒可以在大鼠、小鼠、家兔和雞胚等腦組織內(nèi)增殖、致弱，也可以通過馴化，適應(yīng)于非腦組織細(xì)胞。本文檔共46頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分狂犬病疫苗疫苗：所有用減毒或者殺死的病原生物（包括細(xì)菌、病毒、立克次氏體等）或其抗原性物質(zhì)所制成，用于預(yù)防接種的生物制品。目的：預(yù)防、控制疾?。ㄈ缈袢。┑陌l(fā)生、流行。1881年法國巴斯德最早應(yīng)用連續(xù)傳代減弱病毒毒力，成功制造出狂犬病疫苗。目前接種狂犬病疫苗是預(yù)防狂犬病唯一有效的手段。由于狂犬病幾乎100%的致死性，人用狂犬病疫苗必須是滅活苗。本文檔共46頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分狂犬病疫苗的歷史經(jīng)歷五代疫苗神經(jīng)組織疫苗禽胚培養(yǎng)疫苗細(xì)胞培養(yǎng)疫苗亞單位及精致疫苗基因工程疫苗本文檔共46頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分人用狂犬病疫苗生產(chǎn)流程細(xì)胞制備及培養(yǎng)接種毒株培育收獲病毒上清病毒純化病毒滅活原液檢定分裝及凍干本文檔共46頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分RV的滅活病毒對(duì)H2O2、KMNO4、新潔爾液、來蘇兒、肥皂水、70%酒精、碘酒以及β-丙內(nèi)酯敏感。目前通用β-丙內(nèi)酯來滅活疫苗收獲液中的活毒，用量為1:4000，方法：4℃過夜，37℃水浴2h水解殘留的β-丙內(nèi)酯。本文檔共46頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分里程碑：分子生物學(xué)的誕生1962NobelprizeinPhysiologyorMedicine本文檔共46頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分中心法則蛋白質(zhì)本文檔共46頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分原核生物和真核生物在基因表達(dá)上的區(qū)別本文檔共46頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分什么是病毒？生物病毒是一類個(gè)體微小，結(jié)構(gòu)簡單，只含單一核酸（DNA或RNA），必須在活細(xì)胞內(nèi)寄生并以復(fù)制方式增殖的非細(xì)胞型微生物。特點(diǎn)：不具細(xì)胞結(jié)構(gòu)，具有遺傳、復(fù)制等生命特征，既無能能量代謝系統(tǒng)也無蛋白質(zhì)和核酸合成系統(tǒng)……本文檔共46頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分病毒的形態(tài)⑴球狀病毒；⑵桿狀病毒；⑶磚形病毒；⑷冠狀病毒；⑸絲狀病毒；⑹鏈狀病毒；⑺有包膜的球狀病毒；⑻具有球狀頭部的病毒；⑼封于包含體內(nèi)的昆蟲病毒等。病毒粒的對(duì)稱體制：病毒粒的對(duì)稱體制只有兩種，即⑴螺旋對(duì)稱（代表煙草花葉病毒）⑵二十面體對(duì)稱（等軸對(duì)稱，代表腺病毒）。一些結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的病毒，實(shí)質(zhì)上是上述兩種對(duì)稱相結(jié)合的結(jié)果，故稱作復(fù)合對(duì)稱（代表T偶數(shù)噬菌體）。本文檔共46頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分本文檔共46頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分桿狀病毒HIV本文檔共46頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分絲狀病毒腺病毒本文檔共46頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分病毒的分類從遺傳物質(zhì)分類：DNA病毒、RNA病毒、蛋白質(zhì)病毒（如：朊病毒）。從病毒結(jié)構(gòu)分類：真病毒（Euvirus，簡稱病毒）和亞病毒（Subvirus，包括類病毒、擬病毒、朊病毒）。從寄主類型分類：噬菌體（細(xì)菌病毒）、植物病毒（如煙草花葉病毒）、動(dòng)物病毒（如禽流感病毒、天花病毒、HⅣ等）。從性質(zhì)來分：溫和病毒（HⅣ）、烈性病毒（狂犬病病毒）。本文檔共46頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分病毒的分類國際病毒分類委員會(huì)（InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses：ICTV）本文檔共46頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分本文檔共46頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分彈狀病毒科病毒結(jié)構(gòu)示意圖本文檔共46頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分彈狀病毒科成員彈狀病毒科水泡性病毒屬狂犬病病毒屬?短暫熱病毒屬?細(xì)胞核彈狀病毒屬?非毒粒彈狀病毒屬?細(xì)胞質(zhì)彈狀病毒屬?58種植物病毒未歸類植物病毒VSVRV本文檔共46頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分狂犬病病毒：Rabiesvirus,RV75

nm(60～85nm)180

nm

(60～400nm)本文檔共46頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分RV基因組構(gòu)成大小：約12kbp。單股負(fù)鏈RNA(-ssRNA)?；蚺挪迹?’to5’）：核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、糖蛋白（G）和大蛋白（即依賴RNA的RNA聚合酶，L）。其中N基因最保守，常用于進(jìn)化分析；G基因編碼的G蛋白是病毒唯一暴露在外表面的蛋白，是病毒的主要抗原，同時(shí)也是引起宿主免疫應(yīng)答的主要組分。本文檔共46頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分-ssRNAvs+ssRNA定義：一般來說根據(jù)RNA能否直接起mRNA作用而分成單股正鏈RNA病毒(正股RNA病毒)與單股負(fù)鏈RNA病毒(負(fù)股RNA病毒)兩種。RV屬于單股負(fù)鏈RNA病毒，即-ssRNA病毒。本文檔共46頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分RV感染周期(CitedfromDietzscholdetal.,2005)本文檔共46頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分逆軸突運(yùn)輸機(jī)制(CitedfromDietzscholdetal.,2005)本文檔共46頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分小結(jié)狂犬病病毒RV是彈狀病毒科(Rhabdoviridae

)狂犬病病毒屬(Lyssavirus

)的模式病毒種。RV呈子彈狀，長約為180

nm

(60-400nm)，直徑約為75

nm(60-85nm)。具有囊膜包被，基因組為12kbp大小的單股負(fù)鏈RNA(-ssRNA)。高度嗜神經(jīng)性，且逆軸突傳播。含有5個(gè)結(jié)構(gòu)基因，從3’到5’依次為N、P、M、G和L。病毒粒子大?。?×105—8×105kDa，沉降系數(shù)為600S。本文檔共46頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分根據(jù)N基因5’端500bp堿基的同源性分析，可以將狂犬病病毒屬分為7種基因型（Genotype，GT）：狂犬病病毒屬的分類GT病毒名稱縮寫I狂犬病病毒RVIILagos蝙蝠株LagVIIIMokola病毒MokVIVDuvenhage病毒DuvVV歐洲蝙蝠病毒-1EBL-1VI歐洲蝙蝠病毒-2EBL-2VII澳大利亞蝙蝠病毒ABL……….本文檔共46頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分兩個(gè)遺傳譜系疫苗的交叉保護(hù)作用僅存在與同一個(gè)遺傳譜系內(nèi)的病毒中！本文檔共46頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分病毒感染的一般步驟吸附進(jìn)入脫殼病毒基因轉(zhuǎn)錄和復(fù)制子代病毒裝配釋放本文檔共46頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分RV感染的一般步驟本文檔共46頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分RV的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄本文檔共46頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分RV基因轉(zhuǎn)錄vs復(fù)制兩種狀態(tài)的RNA聚合酶：RNA轉(zhuǎn)錄酶和RNA復(fù)制酶。RNA轉(zhuǎn)錄酶：L、P、EF-1αβγ、Hsp60、GT（鳥苷轉(zhuǎn)移酶），從N基因處直接開始轉(zhuǎn)錄。RNA復(fù)制酶：L、P、可溶性的N蛋白（N-P復(fù)合物形式存在，為復(fù)制必須），從基因組的第一個(gè)bp處開始合成leaderRNA和復(fù)制基因組。本文檔共46頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分RV基因的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄重要的順式作用元件：啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。RV基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式：stop-startmodel。本文檔共46頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分RV基因組僅有一個(gè)啟動(dòng)子，5個(gè)基因有相同的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)：UUGU和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)：A/UCUUUUUUU。通用模式：-間隔區(qū)UUGU---ORF---A/UCUUUUUUU間隔區(qū)。RV轉(zhuǎn)錄元件本文檔共46頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分Stop-startmodel一個(gè)基因轉(zhuǎn)錄的終止是下一個(gè)基因轉(zhuǎn)錄起始必須的。RNA聚合酶在終止上一個(gè)基因轉(zhuǎn)錄時(shí)，大約有30%的RNA聚合酶不能起始下游基因的轉(zhuǎn)錄，造成轉(zhuǎn)錄依次遞減30%。研究發(fā)現(xiàn)，-ssRNA基因表達(dá)的調(diào)控主要是通過基因與3’端啟動(dòng)子的位置來控制的。本文檔共46頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分RV基因組的復(fù)制3’leader和5’trailer互補(bǔ)鏈均含有復(fù)制起始信號(hào)，但5’的trailer互補(bǔ)鏈的復(fù)制信號(hào)強(qiáng)度大于3’leader，造成-ssRNA：+ssRNA=50:1，因此包裝成熟的病毒粒子含有-ssRNA與含有+ssRNA的比例也約為50:1本文檔共46頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分VSV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制模型本文檔共46頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分病毒粒子的裝配研究發(fā)現(xiàn)，RV的基因組兩端不存在特定的包裝信號(hào)，-ssRNA或+ssRNA包裝入病毒粒子完全由兩種RNA在細(xì)胞內(nèi)的豐度決定(Finkeretal.,1997)。然而，對(duì)VSV的研究發(fā)現(xiàn)，VSV基因組-ssRNA

5’端的trailer區(qū)含有包裝信號(hào)，使-ssRNA被選擇性包裝入核衣殼(WhelanandWertz,1999)。本文檔共46頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分G蛋白簡介狂犬病病毒G蛋白參與病毒的組織趨向性和致病性，是主要的保護(hù)性抗原，負(fù)責(zé)誘導(dǎo)病毒中和抗體的產(chǎn)生。

整個(gè)G蛋白分為四個(gè)結(jié)構(gòu)域：信號(hào)肽(signalpeptite,SP)膜外區(qū)(ectodomain,ECTO)，跨膜區(qū)(transmembraneregion,TM)和膜內(nèi)區(qū)(endodomain,ENDO)，成熟的G蛋白包括后面三個(gè)結(jié)構(gòu)域。G全長:522-533aa成熟G蛋白:503-514aaSP:19aa,TM:22aa,ECTO:439aa,ENDO:42-53aa本文檔共46頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分RVG蛋白主要抗原位點(diǎn)膜34-42198-200II膜外區(qū)：1-439aaI231IV264III330-357a342-343244-281G5跨膜區(qū)：440-460aa膜內(nèi)區(qū)：462-505aa本文檔共46頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分反向遺傳學(xué)技術(shù)經(jīng)典遺傳學(xué)技術(shù)GregorJohannMendel1822-18841：1表型（phenotype）基因型（genotype）本文檔共46頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分反向遺傳學(xué)技術(shù)表型（phenotype）基因型（genotype）基因重組技術(shù)本文檔共46頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期二\17點(diǎn)20分-ss