分子生物學(xué)課件ChDNAReplication,Repair

Ch3.DNAReplication,Repair本文檔共141頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分3.1.復(fù)制的特點(diǎn):

1.復(fù)制機(jī)制的多樣性;

方式多樣:線狀、環(huán)狀

D-環(huán)復(fù)制，θ型復(fù)制，滾環(huán)復(fù)制

2.復(fù)制的完整性；

3.DNA復(fù)制與細(xì)胞周期的協(xié)調(diào)性（一致）

4.DNA復(fù)制的真實(shí)性

DNA復(fù)制錯誤率10-9—10-10（生物進(jìn)化、多

樣性的來源）

本文檔共141頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分The

mammaliancellcycleG1SG2MG0DNAsynthesisandhistonesynthesis

Growthandpreparationforcelldivision

RapidgrowthandpreparationforDNAsynthesisQuiescentcellsphasephasephasephaseMitosis本文檔共141頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分

3.2.DNA復(fù)制反應(yīng)的共同特點(diǎn)

1.半保留復(fù)制；

以母鏈為模板，合成新的互補(bǔ)鏈

2.

半不連續(xù)復(fù)制；

3.

有特定的復(fù)制起點(diǎn)；

復(fù)制子（復(fù)制單元）

4.

需要引物；（3’-OH）

5.

復(fù)制真實(shí)性；

6.

復(fù)制叉的雙向移動，DNA合成的單向延伸5’→3’；

8.

復(fù)制受控制

本文檔共141頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分DNAreplicationissemi-conservativeParentalDNAstrandsDaughterDNAstrandsEachoftheparentalstrandsservesasatemplateforadaughterstrand本文檔共141頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分

DNA的半不連續(xù)復(fù)制

由于DNA的兩條鏈為反向平行，以復(fù)制叉移動的方向?yàn)榛鶞?zhǔn)，一條鏈為3’→5’，其新合成的DNA鏈沿5’→3’連續(xù)進(jìn)行——前導(dǎo)鏈

另一條鏈為5’→3’，新生的DNA鏈先合成短的岡崎片段，不連續(xù)合成——滯后鏈，再由DNA連接酶連接成完整的DNA鏈。

這種前導(dǎo)鏈的連續(xù)復(fù)制和滯后鏈的不連續(xù)復(fù)制稱為半不連續(xù)復(fù)制。本文檔共141頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分DiscontinuoussynthesisofDNA3’5’5’3’3’5’BecauseDNAisalwayssynthesizedina5’to3’direction,synthesisofoneofthestrands...5’ 3’ ...hastobediscontinuous.Thisisthelaggingstrand.5’3’3’5’5’3’本文檔共141頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分RNAprimer5’3’3’5’3’5’directionofleadingstrandsynthesisdirectionoflaggingstrandsynthesisreplicationfork本文檔共141頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分5’3’5’3’Movementofthereplicationfork本文檔共141頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分MovementofthereplicationforkRNAprimerOkazakifragmentRNAprimer5’本文檔共141頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分從復(fù)制起點(diǎn)到終點(diǎn)的DNA單位——復(fù)制子（復(fù)制單元）本文檔共141頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分originsofDNAreplication(every~150kb)replicationbubbledaughterchromosomesfusionofbubblesbidirectionalreplicationOriginsofDNAreplicationonmammalianchromosomes5’3’3’5’5’3’3’5’3’5’5’3’本文檔共141頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分3.3.原核生物DNA的復(fù)制

1.參與DNA復(fù)制的酶和蛋白因子

螺旋酶（Helicase）

促使DNA在復(fù)制叉處打開雙鏈，與單鏈DNA結(jié)合，與ATP結(jié)合，分解成ADP+Pi，產(chǎn)生能量沿DNA鏈向前運(yùn)動，促使DNA雙鏈解開。

本文檔共141頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分本文檔共141頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSBP）

與單鏈DNA結(jié)合，防止解開的單鏈重新配對形成雙鏈或被核酸酶降解;

使單鏈DNA呈伸展?fàn)顟B(tài)，無彎曲和結(jié)節(jié)，利于作為模板；

SSBP可重復(fù)使用。

——形成穩(wěn)定的單鏈構(gòu)象

本文檔共141頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分本文檔共141頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分

拓?fù)洚悩?gòu)酶Topoisomerase——導(dǎo)入負(fù)超螺旋

引物酶Primase

催化引物RNA分子的合成

DNA聚合酶DNAPolymerase

特點(diǎn)：1.以dNTP為前體催化合成DNA；

2.需要模板和引物；

3.催化dNTP加到DNA鏈的3’-OH端；

4.催化合成方向5’→3’。本文檔共141頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分本文檔共141頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分

PropertiesofDNApolymerases

DNApolymerasesofE.coli_

polI polII polIII(core)Polymerization:5’to3’ yes yes yesProofreadingexonuclease:3’to5’ yes yes yesRepairexonuclease:5’to3’ yes no noDNApolymeraseIIIisthemainreplicatingenzymeDNApolymeraseIhasaroleinreplicationtofillgapsandexciseprimersonthelaggingstrand,anditisalsoarepairenzymeallDNApolymerasesrequireaprimer

withafree3’OH

groupallDNApolymerasescatalyzechaingrowthina

5’to3’direction

someDNApolymeraseshavea3’to5’proofreadingactivity本文檔共141頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分DNApolymerasesIII本文檔共141頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分

DNA連接酶

將雙鏈DNA上的切口連接起來；

主要用于岡崎片段的連接，DNA修復(fù)、重組，兩個復(fù)制單元間片段的連接。

連接雙鏈DNA的要求：

切口

3’-OH

5’-磷酸基團(tuán)

需要能量本文檔共141頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分newlysynthesizedDNA(Okazakifragment)5’3’5’3’DNAligasesealsthegapbycatalyzingtheformationofa3’,5’-phosphodiesterbondinanATP-dependentreaction本文檔共141頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分

2.大腸桿菌DNA的復(fù)制過程

起始——延伸——終止

本文檔共141頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分DNA螺旋酶解開雙鏈，拓?fù)洚悩?gòu)酶形成負(fù)超螺旋SSBP結(jié)合單鏈DNA復(fù)制因子組裝成引發(fā)前體RNA引物合成在DNApolIII作用下延伸引物酶引發(fā)體起始階段：本文檔共141頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分dnaA蛋白+重復(fù)序列（9bp）→dnaB和dnaC+重復(fù)序列（13bp）結(jié)合→其它蛋白因子結(jié)合——裝配成全酶（引發(fā)前體）+引物酶→引發(fā)體Primosome本文檔共141頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分InitiationofDNAsynthesisattheE.coliorigin(ori)5’3’3’5’originDNAsequencebindingofdnaAproteinsAAAdnaAproteinscoalesceDNAmeltinginducedbythednaAproteinsAAAAAAAAAAAABCdnaBanddnaCproteinsbindtothesingle-strandedDNAdnaBfurtherunwindsthehelix本文檔共141頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分AAAAAABCdnaBfurtherunwindsthehelixanddisplacesdnaAproteinsGdnaG(primase)binds...AAAAAABCG...andsynthesizesanRNAprimerRNAprimer本文檔共141頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分BCG5’3’templatestrandRNAprimer(~5nucleotides)PrimasomednaB(helicase)dnaCdnaG(primase)OH3’5’本文檔共141頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分3’5’3’RNAprimernewlysynthesizedDNA5’5’DNApolymerase本文檔共141頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分

鏈的延伸

?螺旋酶解開雙鏈；

?拓?fù)洚悩?gòu)酶改變雙螺旋數(shù)，使復(fù)制叉前進(jìn)；

?SSBP結(jié)合，保持雙鏈狀態(tài)；

?

DNA聚合酶Ⅲ合成前導(dǎo)鏈和滯后鏈，前

導(dǎo)鏈引發(fā)1次，滯后鏈引發(fā)幾次；

?

DNA聚合酶Ⅰ切除RNA引物，補(bǔ)齊空缺

的堿基；

?DNA連接酶連接岡崎片段。本文檔共141頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分本文檔共141頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分5’3’3’5’ProteinsatthereplicationforkinE.coliRepprotein(helicase)Single-strandbindingprotein(SSB)BCGPrimasomepolIpolIIIpolIIIDNAligaseDNAgyrase-thisisatopoisomeraseII,whichbreaksandresealstheDNAtointroducenegativesupercoilsaheadofthefork本文檔共141頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分3’RNAprimer5’DNApolymeraseIIIinitiatesattheprimerandelongatesDNAuptothenextRNAprimer5’5’3’5’newlysynthesizedDNA(100-1000bases)(Okazakifragment)5’3’DNApolymeraseIinititatesattheendoftheOkazakifragmentandfurtherelongatestheDNAchainwhilesimultaneouslyremovingtheRNAprimerwithits5’to3’exonucleaseactivitypolIIIpolI本文檔共141頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分newlysynthesizedDNA(Okazakifragment)5’3’5’3’DNAligasesealsthegapbycatalyzingtheformationofa3’,5’-phosphodiesterbondinanATP-dependentreaction本文檔共141頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分終止

環(huán)狀DNA：合成完即終止；

線狀DNA：末端合成問題。

本文檔共141頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分ComponentsofthereplicationapparatusdnaA bindstooriginDNAsequencePrimasomednaB helicase(unwindsDNAatorigin)dnaC bindsdnaBdnaG primase(synthesizesRNAprimer)DNAgyrase introducesnegativesupercoilsahead ofthereplicationforkRepprotein helicase(unwindsDNAatfork)SSB bindstosingle-strandedDNADNApolIII primaryreplicatingpolymeraseDNApolI removesprimerandfillsgapDNAligase sealsgapbyforming3’,5’-phosphodiesterbond本文檔共141頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分復(fù)制體：

在DNA復(fù)制過程中，在復(fù)制叉附近，形成以兩套DNA聚合酶Ⅲ全酶分子、引發(fā)體和螺旋酶構(gòu)成的類似核糖體大小的復(fù)合體稱為DNA復(fù)制體。本文檔共141頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分本文檔共141頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分回環(huán)模型：

在DNA復(fù)制叉處由兩套DNA聚合酶在同

一時(shí)間分別復(fù)制前導(dǎo)鏈和滯后鏈，如果滯后

鏈模板環(huán)繞DNA聚合酶Ⅲ全酶，并通過DNA

聚合酶Ⅲ，再回折與未解鏈的雙鏈DNA在同

一方向，則滯后鏈的合成與前導(dǎo)鏈的合成在

同一方向上進(jìn)行。本文檔共141頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分Replisomemodel本文檔共141頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分本文檔共141頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分ReplisomeincovalenceelongationSSB本文檔共141頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分3.DNA復(fù)制方式：

θ型復(fù)制：本文檔共141頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分滾環(huán)復(fù)制本文檔共141頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分許多病毒、細(xì)菌因子的復(fù)制方式本文檔共141頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分D-環(huán)復(fù)制：

線粒體、葉綠體環(huán)狀DNA復(fù)制方式之一；

特點(diǎn)：1.以輕鏈為模板先復(fù)制其互補(bǔ)鏈；

2.以輕鏈為模板的子鏈繼續(xù)合成，以

重鏈為模板開始合成；

3.復(fù)制完成。

兩條鏈的合成不是同步的本文檔共141頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分D—環(huán)復(fù)制本文檔共141頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分4.線狀DNA的復(fù)制

線狀DNA復(fù)制的一個重要問題是末端RNA引物消除后如何補(bǔ)齊？

①形成環(huán)狀DNA進(jìn)行復(fù)制λ-phage

②形成聚合體T7DNA

③末端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)痘病毒本文檔共141頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分線狀DNA的不完全復(fù)制本文檔共141頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分本文檔共141頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分帶發(fā)夾環(huán)的線性病毒DNA的復(fù)制本文檔共141頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分

④不需要RNA引物的復(fù)制腺病毒

蛋白質(zhì)分子介入，進(jìn)行末端的引發(fā)。

腺病毒中發(fā)現(xiàn)80Kd的末端結(jié)合蛋白（Tp），由絲氨酸殘基（Ser）的-OH基團(tuán)通過磷酸二酯鍵與胞苷酸（C）的5’-共價(jià)連接。Tp內(nèi)的胞苷酸與線狀DNA的3’端配對，成為病毒DNA復(fù)制起始的引物，在酶作用下合成新鏈。

其它枯草桿菌噬菌體φ29中也發(fā)現(xiàn)了27Kd的末端蛋白。本文檔共141頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分本文檔共141頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分ReplicationoflinearAdnovirus-2DNA

35937bp

pTP

C

G

IR103-162

IR;including50bpreplicationorigin

richAT&1thC/Ghighconversation

pTP;pre-Terminalprotein80kd→

TP55kdSSB;S.S.DNAbindingprotein72kdAd2DNApolymerase;

140kd

本文檔共141頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分復(fù)制起始復(fù)合體引發(fā)復(fù)制（不需引物）

避免5’-endshortentpTp-Ser-dCMP

CG●過程SSB+ATPDNA末端解鏈

TPpTP-Ser+

dCTP

pTP-Ser-dCMP

3‘OH本文檔共141頁；當(dāng)前第55頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分IRIRCGGCGCCGpTP-Ser-dCMPReplacedS.SDNAHairpinPanhandlepTP-Ser-dCMPG3’G3’G3’TP本文檔共141頁；當(dāng)前第56頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分

5.單鏈DNA的復(fù)制

單鏈環(huán)狀DNA的復(fù)制φ174、G4、M13

復(fù)制三階段：

?將單鏈DNA→雙鏈DNA（復(fù)制型DNA）；

?復(fù)制足夠多的雙鏈DNA（滾環(huán)復(fù)制）；

?以負(fù)鏈為模板，合成正鏈，并包裝成病毒顆

粒。本文檔共141頁；當(dāng)前第57頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分本文檔共141頁；當(dāng)前第58頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分A蛋白參與的滾環(huán)復(fù)制本文檔共141頁；當(dāng)前第59頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分單鏈線狀DNA的復(fù)制——細(xì)小病毒本文檔共141頁；當(dāng)前第60頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分本文檔共141頁；當(dāng)前第61頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分上節(jié)回顧：1.DNA復(fù)制的特點(diǎn):

2.原核生物DNA的復(fù)制過程類型(雙鏈環(huán)狀,單鏈環(huán)狀線狀單鏈DNA)本文檔共141頁；當(dāng)前第62頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分

6.DNA復(fù)制的真實(shí)性

DNA復(fù)制錯配率10-9~10-10，大腸桿菌染色體中有4.5×106bp，每1000個細(xì)胞經(jīng)過一次分裂才會插入一個不正確的堿基。

本文檔共141頁；當(dāng)前第63頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分維持DNA復(fù)制準(zhǔn)確性的因素：

內(nèi)因：

①按堿基配對原則，10-4~10-5

②DNA聚合酶的作用10-4~10-5

?對堿基的識別作用；

選擇正確的堿基參入到引物末端

?對底物的識別作用；

先識別引物最后一個堿基是否正確，后識

別參入的dNTP是否正確

?校正閱讀

3’→5’外切酶的作用

③RNA引物最終被切除，提高了復(fù)制的準(zhǔn)確性

本文檔共141頁；當(dāng)前第64頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分3’→5’外切酶的校正閱讀本文檔共141頁；當(dāng)前第65頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分

外因：

?四種dNTP要平衡；

?Mn+2和Mg+2的比例、濃度（酶活）

本文檔共141頁；當(dāng)前第66頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分

3.4.真核生物DNA的復(fù)制

?與原核生物相似

半保留、半不連續(xù)復(fù)制

復(fù)制過程：引發(fā)—延伸—終止三個階段

需要酶和蛋白因子

?不同點(diǎn)

復(fù)制特性上

復(fù)制酶

復(fù)制過程本文檔共141頁；當(dāng)前第67頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分

3.4.1.真核生物的復(fù)制特點(diǎn)：

1.原核生物是單復(fù)制子，真核生物是多復(fù)制子（每條染色體上有多個復(fù)制起點(diǎn)）；

2.DNA全部復(fù)制完畢才進(jìn)行第二輪復(fù)制，原核生物在第一輪復(fù)制未完成就進(jìn)行第二輪復(fù)制。本文檔共141頁；當(dāng)前第68頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分?

?

本文檔共141頁；當(dāng)前第69頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分3.4.2.參與DNA復(fù)制的酶：

DNA聚合酶

真核生物DNA聚合酶有五種，DNA聚合酶α，β，γ，δ，ε，其中與核DNA復(fù)制有關(guān)的酶是DNA聚合酶α和δ。其他因子可能與DNA的修復(fù)，重組等過程有關(guān)。

本文檔共141頁；當(dāng)前第70頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分

DNA聚合酶α

是DNA復(fù)制的主要酶，由4個亞基組成，分子量分別是160~185kd、70kd、60kd和50kd，除具有5’→3’的聚合酶活性外，還有引物酶活性，是一個雙功能酶，但無3’→5’外切活性。

功能前導(dǎo)鏈的起始（具有DNA復(fù)制的起始能力，具有引物酶結(jié)合，起動引物合成）滯后鏈的復(fù)制（經(jīng)常引發(fā)RNA合成，聚合活性小，只能合成短片段）本文檔共141頁；當(dāng)前第71頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分

?？康鞍住?/p>

DNA聚合酶α中的一條70kd的多肽，把DNA聚合酶亞基和引物酶亞基連接起來的蛋白。

本文檔共141頁；當(dāng)前第72頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分DNA聚合酶δ

由2個亞基組成，125kd和25kd，既具有3’→5’外切酶活性，又有5’→3’的聚合酶活性，是前導(dǎo)鏈合成的主要酶類。

δ酶需要一個37kd的輔助蛋白促進(jìn)δ酶與模板/引物相互作用?！狿CNA分裂細(xì)胞核抗原，它是控制細(xì)胞分裂的“細(xì)胞周期調(diào)控蛋白”的一種，研究發(fā)現(xiàn)，PCNA表達(dá)水平高，DNA聚合酶活性高，細(xì)胞分裂、復(fù)制旺盛。本文檔共141頁；當(dāng)前第73頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分DNA聚合酶ε

具有象δ一樣的3’→5’外切酶活性，但不依賴于PCNA，在許多細(xì)胞中均分離得到，是DNA聚合酶中的一種酶類。

輔因子：①PCNA

②復(fù)制因子C（RF-C）

具有ATP活性，是δ酶的輔助因子

③復(fù)制因子A（RF-A）

單鏈結(jié)合蛋白

④DNA解旋酶本文檔共141頁；當(dāng)前第74頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分

PropertiesofDNApolymerases

DNApolymerasesofhumans

abgdeLocation nucl nucl mito nuclnuclReplication yes no yes yes(no)Repair no yes no no yes3Functions5’to3’polymerase yes yes yes yesyes3’to5’exonuclease no no yes yesyes5’to3’exonuclease1 no no no nonoPrimase yes no no nonoAssociateswithPCNA2 no no no yesnoProcessivity low highStrandsynthesis lagging

repairbothleading

repair1activitypresentinassociatedproteins2ProliferatingCellNuclearAntigen3involvedintranscription-linkedDNArepair本文檔共141頁；當(dāng)前第75頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分真核生物DNA復(fù)制所需酶類前導(dǎo)鏈的復(fù)制：polα起始，δ+PCNA合成延伸滯后鏈的復(fù)制：polα起始，合成岡崎片段本文檔共141頁；當(dāng)前第76頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分本文檔共141頁；當(dāng)前第77頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分5’3’3’5’ProteinsatthereplicationforkinhumanshelicaseSSBpolaDNAligasetopoisomerasesIandIIPCNAprimaseactivityassociatedwithpolapoldleadingstrandlaggingstrand5’to3’exoassociatedwiththecomplexpole本文檔共141頁；當(dāng)前第78頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分本文檔共141頁；當(dāng)前第79頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分3.4.3.復(fù)制過程：

以SV40DNA的復(fù)制為例說明

SV40—猿猴空泡病毒，一種動物病毒，具有環(huán)狀雙鏈DNA與四種組蛋白組成的染色質(zhì)?；蚪M有5243bp，除了T抗原外，SV40DNA的復(fù)制全部依賴于宿主細(xì)胞的復(fù)制系統(tǒng)，因此，了解該病毒的DNA復(fù)制機(jī)制對研究真核生物DNA復(fù)制有重要的意義。

本文檔共141頁；當(dāng)前第80頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分本文檔共141頁；當(dāng)前第81頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分復(fù)制起點(diǎn)：5208-29的64bp的序列—40%-50%

5192-30的82bp的序列—100%

T抗原結(jié)合區(qū)：I、Ⅱ、III

三個功能區(qū)：前期區(qū)、中心區(qū)和后期區(qū)，

T抗原蛋白是SV40復(fù)制必不可缺的，其作用是結(jié)合起始區(qū)的三個結(jié)合位點(diǎn)，具有ATP酶和解旋酶活性。本文檔共141頁；當(dāng)前第82頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分復(fù)制過程：T抗原識別，使AT富含區(qū)解鏈，形成復(fù)制叉T抗原隨復(fù)制叉向左移動至T抗原結(jié)合位點(diǎn)Ⅱ的回文結(jié)構(gòu)DNApola引物合成，向左合成的前導(dǎo)鏈延伸合成至Ⅰ區(qū)時(shí)，引發(fā)體復(fù)合物與模板結(jié)合，合成引物，向右合成的前導(dǎo)鏈延伸前導(dǎo)鏈合成一段后，DNApola脫落，

pold延伸，DNApola引發(fā)合成滯后鏈本文檔共141頁；當(dāng)前第83頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分

特點(diǎn)：

1.T抗原的依賴性；

2.從復(fù)制起始位點(diǎn)開始的兩個方向復(fù)制并不是同時(shí)開始的。

本文檔共141頁；當(dāng)前第84頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分

終止：——由端粒酶合成末端

端粒（Telomere）：真核細(xì)胞內(nèi)染色體末端的蛋白質(zhì)-DNA結(jié)構(gòu)，其功能是完成染色體末端的復(fù)制，防止染色體免遭融合、重組和降解。

端粒酶(Telomerase)

一種核糖核蛋白（RNP），由RNA和蛋白質(zhì)兩種成分組成，催化端粒DNA的合成，能夠在缺少DNA模板的情況下延伸端粒寡核苷酸片段。

端粒酶中的RNA長約159bp，其中含有“CAACCCCAA”序列，能附著于DNA末端并與末端互補(bǔ)配對，起到模板的作用，蛋白質(zhì)起到反轉(zhuǎn)錄酶的作用，合成末端。本文檔共141頁；當(dāng)前第85頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分端粒端粒本文檔共141頁；當(dāng)前第86頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分本文檔共141頁；當(dāng)前第87頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分本文檔共141頁；當(dāng)前第88頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分端粒酶一旦出問題，往往會導(dǎo)致疾病的發(fā)生：

端粒及端粒酶與衰老有關(guān)

越來越多的證據(jù)表明端粒長度控制著衰老進(jìn)程，端?？s短是觸發(fā)衰老的分子鐘。

端粒酶活化與腫瘤

在正常的人體細(xì)胞中，端粒程序性地縮短限制了轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長能力，這很可能是腫瘤形成的一個抑制機(jī)制。

本文檔共141頁；當(dāng)前第89頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分人體發(fā)育完成，端粒酶被抑制，細(xì)胞分裂次數(shù)與端粒長短呈正比細(xì)胞分裂端粒閾值端粒長短端粒酶活

Harley(1989)端粒的重復(fù)片段為探針檢測胎兒細(xì)胞株嬰兒細(xì)胞株青年細(xì)胞株老年細(xì)胞株年齡小大端粒長度長短早衰性侏儒癥的端粒明顯較正常人短“多莉”的衰老＞研究端粒（記時(shí)器）丟失的速率/年，預(yù)測人類的壽命XXXYwhy?PCD機(jī)制、癌細(xì)胞的無限繁殖(癌細(xì)胞中的端粒酶被激活)本文檔共141頁；當(dāng)前第90頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分

與復(fù)制有關(guān)的一些問題：

1.DNA復(fù)制通常從非轉(zhuǎn)錄區(qū)開始，向兩側(cè)進(jìn)行，在轉(zhuǎn)錄不旺盛的細(xì)胞中，由于非轉(zhuǎn)錄區(qū)相對較多，DNA復(fù)制快，而在轉(zhuǎn)錄旺盛的細(xì)胞中，非轉(zhuǎn)錄區(qū)少，復(fù)制起點(diǎn)少，復(fù)制慢。

2.核小體的組裝

有人認(rèn)為，細(xì)胞內(nèi)有一類蛋白質(zhì)能夠?qū)⒔M蛋白轉(zhuǎn)移到DNA上，進(jìn)而組裝成核小體。

例如核漿素：轉(zhuǎn)移H2A、H2B

N1：H3、H4本文檔共141頁；當(dāng)前第91頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分DNA復(fù)制速率及拷貝數(shù)的調(diào)控(?!)

本文檔共141頁；當(dāng)前第92頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分a)影響因素

多種專一性的蛋白質(zhì)因子濃度除引物以外的其他RNA分子（anti-RNA）營養(yǎng)條件（aastarved的抑制)（原核生物）細(xì)胞復(fù)制周期速率的影響（真核生物）…b)嚴(yán)格的自我調(diào)控機(jī)制

e.g.plasmid（parasite）

independentreplicationstringenttype(1-2copies)relaxedtype(10-100copies)incompatibility(具有相同的復(fù)制機(jī)制，酶，repressor..)compatibility(具有不同的復(fù)制機(jī)制F,ColEI…)

自然選擇進(jìn)化適應(yīng)過度復(fù)制何以寄生本文檔共141頁；當(dāng)前第93頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分30℃E.Coli+episomeF因子復(fù)制受控于E.coliO42℃FE.coli復(fù)制受控于F因子30℃F因子復(fù)制獨(dú)立于E.coliOE.Coli

(ts)

episome(F)本文檔共141頁；當(dāng)前第94頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分Repressormodel

AntisenseRNAmodel

RNA-2positivecontrol

0-5550

RNA-2

RnaseHOH

RNA-2DNA/RNA

primerforDNAreplication

復(fù)制的調(diào)控e.g.ColEIplasmidNegativecontrol本文檔共141頁；當(dāng)前第95頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分RNA-1110bp

RNaseH不能識別D.S.RNA-1/RNA-2,不能形成primer的3’-OH-555

-4450RNA-2RNA-1RNA-2

110bpD.S.RNA本文檔共141頁；當(dāng)前第96頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分RNA-10

WhenRNA-2200-360Nt

Rom

geneexpression

RNA-1/RNA-2D.S.repression

RNA-1

/RNA-2

不能形成primer的

3’-OH促進(jìn)

限制

63aaROP(Romprotein)

RNA-2

只能轉(zhuǎn)錄到100-220base,不能到達(dá)“0”原點(diǎn)

能形成primer

的3’-OH0本文檔共141頁；當(dāng)前第97頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分CheckpointsinEukaryoticcell本文檔共141頁；當(dāng)前第98頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分3.5.RNA的復(fù)制

遺傳信息——DNA

有一些RNA病毒以RNA作為遺傳信息的載體

RNA病毒：

正鏈RNA病毒

負(fù)鏈RNA病毒

逆轉(zhuǎn)錄病毒本文檔共141頁；當(dāng)前第99頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分正鏈RNA“+”：RNA分子本身即有編碼功能，

進(jìn)入宿主細(xì)胞后便可翻譯成蛋白。

負(fù)鏈RNA“-”：只有它們的互補(bǔ)鏈才有編碼功能。

逆轉(zhuǎn)錄RNA：

整合到宿主基因組中轉(zhuǎn)錄、翻譯ProteinVirus逆轉(zhuǎn)錄本文檔共141頁；當(dāng)前第100頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分RNA的復(fù)制過程：

1.復(fù)制酶是RNA復(fù)制所必需的；

宿主細(xì)胞內(nèi)的RNA不能作為模板合成新的RNA分子

病毒RNA的復(fù)制需要一種全新的酶——RNA復(fù)制酶

2.RNA復(fù)制酶

（+）RNA：感染宿主后，利用宿主的翻譯系統(tǒng)合成復(fù)制酶；

（-）RNA：復(fù)制酶來自病毒；本文檔共141頁；當(dāng)前第101頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分以（+）或（-）鏈為模板，合成（-）鏈或（+）RNA以新合成的鏈為模板，合成病毒RNA以（+）鏈翻譯成蛋白包裝成病毒顆粒復(fù)制過程：輔因子（宿主細(xì)胞蛋白）Tu、Ts因子：協(xié)助復(fù)制酶識別病毒3’端的CCA-OH，引發(fā)RNA復(fù)制開始；S1因子：以（+）鏈為模板合成（-）鏈時(shí)需要，作用：協(xié)助復(fù)制酶識別RNA上特異位點(diǎn)。本文檔共141頁；當(dāng)前第102頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分本文檔共141頁；當(dāng)前第103頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分RNA復(fù)制的特點(diǎn)和調(diào)節(jié)

1.新生的RNA鏈與模板之間不形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，只在復(fù)制生長點(diǎn)的末端形成一段RNA-RNA的雙鏈區(qū)；

2.新生成的子鏈又可作模板生成更多的子鏈，（“+”鏈較多—復(fù)制酶更容易與負(fù)鏈結(jié)合）

3.調(diào)節(jié)

復(fù)制酶不但可和RNA-3’端結(jié)合,合成互補(bǔ)RNA分子，還可以和RNA分子內(nèi)部的兩個位點(diǎn)結(jié)合：

外殼蛋白基因的結(jié)合位點(diǎn)

復(fù)制酶基因內(nèi)的結(jié)合位點(diǎn)本文檔共141頁；當(dāng)前第104頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分3.6.逆轉(zhuǎn)錄病毒遺傳信息的傳遞

1.逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA的結(jié)構(gòu)

二倍體結(jié)構(gòu)

基因組含三個結(jié)構(gòu)基因：

gag基因（病毒核心蛋白基因）

pol基因（反轉(zhuǎn)錄酶基因）

env基因（病毒外膜糖基因）本文檔共141頁；當(dāng)前第105頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分本文檔共141頁；當(dāng)前第106頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分本文檔共141頁；當(dāng)前第107頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分本文檔共141頁；當(dāng)前第108頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分本文檔共141頁；當(dāng)前第109頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分TypesandratesofmutationType Mechanism Frequency________Genome chromosome 10-2percelldivisionmutation missegregation (e.g.,aneuploidy)Chromosomechromosome 6X10-4percelldivisionmutation rearrangement (e.g.,translocation)Gene basepairmutation 10-10perbasepairpermutation (e.g.,pointmutation, celldivisionor orsmalldeletionor 10-5-10-6perlocusper insertion generation

本文檔共141頁；當(dāng)前第110頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分Mutationrates*ofselectedgenesGeneNewmutationsper106gametesAchondroplasia(軟骨發(fā)育不全) 6 to40Aniridia(無虹膜) 2.5 to5Duchennemusculardystrophy(杜氏肌肉營養(yǎng)障礙）43 to105HemophiliaA（血友?。? 32 to57HemophiliaB （血友病） 2 to3Neurofibromatosis-1 44 to100Polycystickidneydisease（多囊性腎?。?60 to120Retinoblastoma 5 to12*mutationrates(mutations/locus/generation)canvary from10-4to10-7dependingongenesizeandwhether thereare“hotspots”formutation(thefrequencyatmost lociis10-5to10-6).本文檔共141頁；當(dāng)前第111頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分Polymorphismsexistinthegenomethenumberofexistingpolymorphismsis~1per500bpthereare~5.8milliondifferencesperhaploidgenomepolymorphismswerecausedbymutationsNewgermlinemutationseachspermcontains~100newmutationsanormalejaculate（一次射出的精液）has~100millionsperm100X100million=10billionnewmutations~1in10spermcarriesanewdeleteriousmutationatarateofproductionof~8X107spermperday, amalewillproduceaspermwithanewmutation intheDuchennemusculardystrophy

gene approximatelyevery10seconds.本文檔共141頁；當(dāng)前第112頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分TypesofbasepairmutationsCATTCACCTGTACCAGTAAGTGGACATGGTCATGCACCTGTACCAGTACGTGGACATGGTCATCCACCTGTACCAGTAGGTGGACATGGTtransition(T-AtoC-G)transversion(T-AtoG-C)CATCACCTGTACCAGTAGTGGACATGGTdeletionCATGTCACCTGTACCAGTACAGTGGACATGGTinsertionbasepairsubstitutionstransition:pyrimidinetopyrimidinetransversion:pyrimidinetopurinenormalsequencedeletionsandinsertionscaninvolveoneormorebasepairs本文檔共141頁；當(dāng)前第113頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分3.8.DNA損傷及修復(fù)

自發(fā)性DNA損傷：

錯配mismatch/mispairing

互變異構(gòu)現(xiàn)象tautomerism

堿基“環(huán)出（loopingout）”

環(huán)境因素：

化學(xué)誘變—烷化劑、亞硝酸

物理因素—紫外線、電離輻射本文檔共141頁；當(dāng)前第114頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分DNA損傷的化學(xué)及物理因素本文檔共141頁；當(dāng)前第115頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分互變異構(gòu)引起的突變：TautomericformsoftheDNAbasesAdenineCytosineAMINO（氨基）IMINO（亞氨基）本文檔共141頁；當(dāng)前第116頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分GuanineThymineKETO（酮式）ENOL（烯醇式）TautomericformsoftheDNAbases本文檔共141頁；當(dāng)前第117頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分MutationcausedbytautomerofcytosineCytosineCytosineGuanineAdeninecytosinemispairswithadenineresultinginatransitionmutationNormaltautomericformRareiminotautomericform本文檔共141頁；當(dāng)前第118頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分MutationisperpetuatedbyreplicationreplicationofC-GshouldgivedaughterstrandseachwithC-GtautomerformationC

duringreplicationwillresultinmispairingandinsertionofanimproperAinoneofthedaughterstrandsACwhichcouldresultinaC-GtoT-Atransitionmutationinthenextroundofreplication,orifimproperlyrepairedCGCGandCGCGCAandCGTA本文檔共141頁；當(dāng)前第119頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分堿基環(huán)出本文檔共141頁；當(dāng)前第120頁；編輯于星期三\2點(diǎn)8分Chemicalmutagens化學(xué)誘變Deaminationbynitrousacid亞硝酸的氧化脫氨本文檔共141頁；當(dāng)前第121頁；編