分子生物學導論分子生物學研究方法3

（優(yōu)選）分子生物學導論分子生物學研究方法本文檔共66頁；當前第1頁；編輯于星期三\1點58分1第七節(jié) 核酸序列分析技術一、Sanger雙脫氧鏈終止法二、Maxam-GilbertDNA化學降解法三、DNA序列測定的自動化四、DNA雜交測序法五、基因芯片測序六、最新測序技術本文檔共66頁；當前第2頁；編輯于星期三\1點58分2本文檔共66頁；當前第3頁；編輯于星期三\1點58分3原理：雙脫氧（2'，3'）-核苷酸可以象2'-脫氧核苷酸那樣直接摻入新合成的DNA鏈中，但因3’端不具OH基，DNA鏈合成至此中斷。由于雙脫氧核苷酸在每個DNA分子中摻入的位置不同，故可根據(jù)不同長度的DNA片段測定出核苷酸序列。不能和下一個核苷酸通過磷酸二酯鍵連接起來一、Sanger雙脫氧鏈終止法

本文檔共66頁；當前第4頁；編輯于星期三\1點58分4過程：制備ss-DNA→與引物退火→分為4個反應系統(tǒng)→每個系統(tǒng)中加入dNTP（其中dATP常帶同位素標記）和一種雙脫氧核苷酸→DNA聚合酶定序反應→反應產(chǎn)物變性后電泳→凝膠干燥→放射自顯影。

該法亦適合mRNA的序列分析。

GC富集區(qū)常出現(xiàn)“隱影”或“停止”現(xiàn)象，如在反應中加入dITP（脫氧三磷酸次黃嘌呤）或脫氧三磷酸-7-脫氧鳥苷可解決GC富集區(qū)的測序。本文檔共66頁；當前第5頁；編輯于星期三\1點58分5ATGCGGTACCAT5’3’測序模板5’5’5’5’5’5’5’5’5’

5’5’5’四套反應體系1--dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddATP

TATACGCCATACGCCATGGTATACTACGCTACGCCTACGTACGCCATGTACGCCATGGTTACGCCATTACGCCATGGT2--dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddCTP3--dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddGTP4--dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddTTP本文檔共66頁；當前第6頁；編輯于星期三\1點58分6雙脫氧法的特點需要單鏈模板、寡核苷酸引物和高質量的DNA聚合酶。缺點：（1）聚合反應會因二級結構而提前終止，常常測不到準確的DNA序列；（2）由于經(jīng)模板與引物結合后才能反應并測序，因此對于寡聚核苷酸DNA序列（例如對引物DNA的序列）不能測定；（3）該法直接分析的是合成的新鏈序列，而不是模板鏈，因此不能分析模板中甲基化部位；（4）需要適當?shù)囊锖湍芎铣蓡捂溎０宓妮d體。優(yōu)點：簡單、快速。本文檔共66頁；當前第7頁；編輯于星期三\1點58分7二、Maxam-GilbertDNA化學降解法基本步驟:(1)先將DNA的末端之一進行標記(通常為放射性同位素32P)；(2)在多組互相獨立的化學反應中分別進行特定堿基的化學修飾；(3)在修飾堿基位置化學法斷開DNA鏈；(4)聚丙烯酰胺凝膠電泳將DNA鏈按長短分開；(5)根據(jù)放射自顯影顯示區(qū)帶，直接讀出DNA的核苷酸序列。本文檔共66頁；當前第8頁；編輯于星期三\1點58分8化學測序法的優(yōu)點：（1）待測的DNA序列來自原有的DNA分子，因此可以分析DNA被修飾的堿基；（2）測序反應不受DNA二級結構的影響；（3）不需要將待測序的DNA亞克隆到其他載體上，不需要通過通用的引物；（4）可測定較短的DNA序列?；瘜W測序法的缺點：（1）待測DNA需要進行末端放射性標記、變性聚丙酰烯胺凝膠電泳分離分析，操作較復雜；（2）該方法測序范圍約為250bp，稍低于雙脫氧法；（3）本方法主要限制因素是變性聚丙酰烯胺凝膠電泳分離分析分辨能力比較低。

本文檔共66頁；當前第9頁；編輯于星期三\1點58分9三、DNA序列測定的自動化

1.DNA測序步驟與自動化1）模板制備：可自動化2）定序反應：可自動化3）凝膠電泳：自動化有一定困難，制膠、點樣、電泳、凝膠干燥、放射自顯影。4）核苷酸序列閱讀與計算機輸入：可自動化

DNA序列分析自動化包括兩個方面的內(nèi)容，一是指“分析反應”的自動化，另一方面則是指“讀片過程”的自動化。本文檔共66頁；當前第10頁；編輯于星期三\1點58分102.自動測序儀

Conney等人于1987年設計了不同熒光染料標記引物，然后做鏈終止測序，用激光掃描閱讀序列。紅色引物+T反應系統(tǒng)（引物+DNA+dNTP+ddTTP）黑色引物+G反應系統(tǒng)（引物+DNA+dNTP+ddGTP）

綠色引物+A反應系統(tǒng)（引物+DNA+dNTP+ddATP）

蘭色引物+C反應系統(tǒng)（引物+DNA+dNTP+ddCTP）本文檔共66頁；當前第11頁；編輯于星期三\1點58分11本文檔共66頁；當前第12頁；編輯于星期三\1點58分12本文檔共66頁；當前第13頁；編輯于星期三\1點58分13優(yōu)點:(1)四個反應系統(tǒng)可合并點樣，大大節(jié)省制膠和點樣時間；(2)可同時讀出多個樣品核苷酸序列，不需干燥凝膠和放射自顯影；(3)可連續(xù)電泳，可讀出較多的核苷酸序列。缺點：無法保留原始記錄,四個反應產(chǎn)物點在一條道上,相互間會發(fā)生干擾,導致讀序時分辨率下降。本文檔共66頁；當前第14頁；編輯于星期三\1點58分14四、DNA雜交測序法自從70年代末期DNA測序技術問世以來，人們已經(jīng)做了大量重要的改進，但從根本原理上創(chuàng)新的則只有雜交測序法（sequencingbyhybridization，SBH）一種。它利用一組已知序列的寡核苷酸短序列作探針，同某一特定的較長的靶DNA分子進行雜交，從而測定其核苷酸的序列。DNA雜交測序實質上包括兩個主要的步驟：

首先是將待測定的靶DNA分子同一組已知其核苷酸順序的寡核苷酸探針進行雜交，

然后與那些能夠同靶DNA形成完全的雙鏈雜合分子的寡核苷酸探針做比較分析，并據(jù)此推算出靶DNA的核苷酸序列。本文檔共66頁；當前第15頁；編輯于星期三\1點58分15如果將一種核苷酸順序為5'-AGCCTAGCTGAA-3'的12-mer的靶DNA，與一組完全隨機的8-mer寡核苷酸探針混合雜交，在總數(shù)為48=65536種的8-mer探針群體中，僅有5種會與靶DNA形成完全互補的雙鏈體分子。根據(jù)這5種發(fā)生了完全雜交作用的8-mer寡核苷酸探針之間的重疊序列的線性關系，便可推算出這段12-mer的靶DNA分子的核苷酸順序。當然，這只是一種理想化狀態(tài)，實際上此種雜交模式要復雜得多，因為那些沒有同靶DNA片段完全互補的寡核苷酸探針，也仍然會與之形成不穩(wěn)定的雙鏈分子。本文檔共66頁；當前第16頁；編輯于星期三\1點58分16上圖是兩條長度均為17-mer的靶DNA片段I和II的雜交測序結果，兩者僅在第8位堿基有不同，分別為C和T。靶DNA片段I可與1~8共8段彼此相互重疊的8-mer寡核苷酸形成完全的雙鏈分子，但不能與第9段8-mer寡核苷酸形成完全的雙鏈分子。根據(jù)相鄰的兩段8-mer寡核苷酸之間各自具有7個堿基的重疊情況，可以構建出互補的DNA序列。靶DNA片段II的雜交結果表明，橫跨其第8位堿基T的6段8-mer寡核苷酸的雙鏈體，由于含有內(nèi)部的堿基錯配，因此其雜交效率明顯下降；但與第1和第8兩段8-mer寡聚體形成的具有末端G-T錯配的雙鏈分子，其穩(wěn)定性下降并不顯著。與第9段8-mer寡核苷酸能雜交形成完全的雙鏈體分子，證實與片段I相比，它在第8位發(fā)生了由C堿基到T堿基的變化。本文檔共66頁；當前第17頁；編輯于星期三\1點58分17五、基因芯片測序本文檔共66頁；當前第18頁；編輯于星期三\1點58分18基因芯片測序流程本文檔共66頁；當前第19頁；編輯于星期三\1點58分19六、最新測序技術1.新一代測序技術（Nextgenerationsequencingtechnology）美國RocheAppliedScience公司的454基因組測序儀美國Illumina公司英國Solexatechnology公司合作開發(fā)的Illumina測序儀美國AppliedBiosystems公司的SOLiD測序儀Dover/Harvard公司的Polonator測序儀美國Helicos公司的HeliScope單分子測序儀

所有這些新型測序儀都使用了一種新的測序策略——循環(huán)芯片測序法（cyclic-arraysequencing），也可將其稱為“新一代測序技術或者第二代測序技術”。本文檔共66頁；當前第20頁；編輯于星期三\1點58分20焦磷酸測序邊合成邊測序

邊連接邊測序3730xlSanger雙脫氧核苷酸新一代測序技術的發(fā)展為基因組學研究帶來了更大的機遇本文檔共66頁；當前第21頁；編輯于星期三\1點58分21本文檔共66頁；當前第22頁；編輯于星期三\1點58分22幾種新一代測序儀的比較本文檔共66頁；當前第23頁；編輯于星期三\1點58分23新一代測序技術的應用本文檔共66頁；當前第24頁；編輯于星期三\1點58分242.第三代測序技術（Thirdgenerationsequencingtechnology）英國牛津納米孔公司——基于納米孔的單分子讀取技術。該技術在測序時DNA分子依靠核酸外切酶一次一個堿基地通過小孔，無需多次擴增和熒光標記。本文檔共66頁；當前第25頁；編輯于星期三\1點58分25第八節(jié) 轉基因技術一、植物基因轉化載體系統(tǒng)的構建二、受體材料的選擇三、植物遺傳轉化體系四、轉化體的篩選和鑒定本文檔共66頁；當前第26頁；編輯于星期三\1點58分26藍色妖姬，轉基因藍玫瑰？本文檔共66頁；當前第27頁；編輯于星期三\1點58分27本文檔共66頁；當前第28頁；編輯于星期三\1點58分28適宜外植體的選擇及再生體系的建立抗生素篩選壓的確定及農(nóng)桿菌菌株的選擇遺傳轉化操作載體介導的轉化方法DNA直接導入法種質系統(tǒng)法選擇培養(yǎng)轉基因植株鑒定獲得再生植株轉化質粒的構建轉基因植株的繁殖與應用利用報告基因Southern雜交Northern雜交Western雜交植物遺傳轉化流程本文檔共66頁；當前第29頁；編輯于星期三\1點58分291.一元載體系統(tǒng)一元載體系統(tǒng)是中間表達載體與改造后的受體Ti質粒通過同源重組所產(chǎn)生的一種復合型載體，通常又稱為共整合載體。一、植物基因轉化載體系統(tǒng)的構建本文檔共66頁；當前第30頁；編輯于星期三\1點58分302.雙元載體系統(tǒng)雙元載體系統(tǒng)是指兩個分別含有T-DNA和Vir區(qū)的相容性突變Ti質粒構成的雙質粒系統(tǒng)，由于其T-DNA和Vir區(qū)在兩個獨立的質粒上，通過反式激活T-DNA轉移，故又稱為反式載體。一元載體(順式載體)雙元載體(反式載體)本文檔共66頁；當前第31頁；編輯于星期三\1點58分31二、受體材料的選擇受體是指用于接受外源DNA的轉化材料。良好的植物基因轉化受體系統(tǒng)應滿足如下條件：1.高效穩(wěn)定的再生能力；2.受體材料要有較高的遺傳穩(wěn)定性；3.外植體來源方便，如胚和其它器官等；4.對篩選劑敏感；5.轉化率高。本文檔共66頁；當前第32頁；編輯于星期三\1點58分32常用的受體材料有以下幾大類型:1.愈傷組織再生系統(tǒng)外植體材料經(jīng)過脫分化培養(yǎng)誘導形成愈傷組織，轉化(帶有目的基因質粒的農(nóng)桿菌侵染)，分化培養(yǎng)獲得再生植株。優(yōu)點：外植體來源廣，繁殖快，易接受外源基因，轉化效率高。缺點：遺傳穩(wěn)定性差、嵌合體因此需要連續(xù)的再生系統(tǒng)本文檔共66頁；當前第33頁；編輯于星期三\1點58分332.直接分化再生系統(tǒng)

外植體材料細胞不經(jīng)過脫分化形成愈傷組織階段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。優(yōu)點：周期短、操作簡單，體細胞變異小，遺傳穩(wěn)定；缺點：材料局限，轉化率低。本文檔共66頁；當前第34頁；編輯于星期三\1點58分343.原生質體再生系統(tǒng)原生質體恢復細胞壁具有分化再生能力，是應用最早的再生受體系統(tǒng)之一。優(yōu)點：高效、廣泛地攝取外源DNA或遺傳物質，獲得基因型一致的克隆細胞，所獲轉基因植株嵌合體少，適用于多種轉化系統(tǒng)；缺點：不易制備、再生困難和變異程度高。本文檔共66頁；當前第35頁；編輯于星期三\1點58分354.胚狀體再生系統(tǒng)是指具有胚胎性質的個體。優(yōu)點：個體數(shù)目巨大、同質性好，接受外源基因能力強，嵌合體少，易于培養(yǎng)、再生。缺點：技術含量高，多數(shù)植物不易獲得胚狀體。本文檔共66頁；當前第36頁；編輯于星期三\1點58分365.生殖細胞受體系統(tǒng)以生殖細胞如花粉粒、卵細胞等受體細胞進行外源基因轉化的系統(tǒng)。一是利用組織培養(yǎng)技術進行小孢子和卵細胞的單倍體培養(yǎng)、轉化受體系統(tǒng)；二是直接利用花粉和卵細胞受精過程進行基因轉化，如花粉管導入法，花粉粒浸泡法，子房微針注射法等。本文檔共66頁；當前第37頁；編輯于星期三\1點58分37三、植物遺傳轉化體系（一）載體型遺傳轉化系統(tǒng)最常見的轉基因方法。將外源基因重組進入適合的載體系統(tǒng)，通過載體將攜帶的外源基因導入植物細胞，整合在核染色體組中并隨核染色體復制和表達。農(nóng)桿菌Ti質粒（tumor-inducingplasmid）或Ri質粒(root-indcing

plasmid)介導法是迄今為止植物基因工程中應用最多、機理最清楚、最理想的載體轉移方法。本文檔共66頁；當前第38頁；編輯于星期三\1點58分38農(nóng)桿菌共培養(yǎng)侵染誘導愈傷組織分化生芽生根葉盤轉化法(1)葉盤法

雙子葉植物較為常用、簡單有效的方法。本文檔共66頁；當前第39頁；編輯于星期三\1點58分39(2)真空滲入法將適宜轉化的健壯植株倒置浸于裝有攜帶外源目的基因的農(nóng)桿菌滲入培養(yǎng)基的容器中，經(jīng)真空處理，造傷，使農(nóng)桿菌通過傷口感染植株，在農(nóng)桿菌的介導下，發(fā)生遺傳轉化。該法簡便、快速、可靠，不需要組織培養(yǎng)。(3)愈傷組織共培養(yǎng)(4)原生質體共培養(yǎng)本文檔共66頁；當前第40頁；編輯于星期三\1點58分40（二）DNA直接轉化系統(tǒng)1.化學刺激法細胞融合劑：聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇（PVC）轉化順利，對細胞傷害??；避免嵌合體的生成；易于選擇；便于進行理論研究；受體廣泛。

優(yōu)點：本文檔共66頁；當前第41頁；編輯于星期三\1點58分41將外源DNA包裹在微小的鎢粉或金粉顆粒的表面，借助高壓動力射入受體細胞或組織，最后整合到植物基因組并得以表達。步驟簡單易行：適合于大多數(shù)細胞或組織，克服了受體材料的限制，不必制備原生質體，具有相當廣泛的應用范圍，已經(jīng)成為植物細胞轉化最有效方法之一。2.基因槍轟擊法（微彈轟擊技術micro-projectilebombardment)

本文檔共66頁；當前第42頁；編輯于星期三\1點58分423.高壓電穿孔法電擊法＋＋＋＋＋＋＋－－－－－－－利用高壓脈沖作用，在原生質體上形成可逆的瞬間通道，從而促進外源DNA的攝取。本文檔共66頁；當前第43頁；編輯于星期三\1點58分434.微注射法

細胞操作：利用瓊脂糖包埋、聚賴氨酸粘連和微吸管吸附等方式將受體細胞（原生質體或生殖細胞）固定，然后將供體DNA或RNA直接注射進入受體細胞。子房注射法或花粉管通道法：具有較大子房或胚囊的植株可在田間進行活體操作。操作簡便、成本低。本文檔共66頁；當前第44頁；編輯于星期三\1點58分44四、轉化體的篩選和鑒定1.轉化體的篩選外源目的基因轉化頻率低目的基因已被整合到核基因組并表達轉化細胞更少使用特異性選擇標記基因（selectablemarkergenes）進行標記，有效地選擇出真正轉化細胞。常用選擇標記基因：抗生素抗性基因；除草劑抗性基因將選擇標記基因與適當啟動子構成嵌合基因，克隆到質粒載體上，與目的基因同時進行轉化。標記基因在受體細胞表達，使轉化細胞具有抵抗相應抗生素或除草劑的能力而存活下來。非轉化細胞則被抑制、殺死。本文檔共66頁；當前第45頁；編輯于星期三\1點58分452.轉化體的鑒定（1）DNA水平的鑒定（2）轉錄水平的鑒定（3）翻譯水平的鑒定本文檔共66頁；當前第46頁；編輯于星期三\1點58分46第九節(jié) RNAi技術RNA干擾（RNAinterference,RNAi）是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-strandedRNA，dsRNA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。一、RNAi的發(fā)現(xiàn)1995年，康乃爾大學的Guo等秀麗新小桿線蟲(C.elegans)本文檔共66頁；當前第47頁；編輯于星期三\1點58分47二、RNA干擾的作用機制本文檔共66頁；當前第48頁；編輯于星期三\1點58分48基因敲除又叫基因打靶，通過外源DNA與染色體DNA之間的同源重組，進行精確的定點修飾和基因改造，具有專一性強、染色體DNA可與目的片段共同穩(wěn)定遺傳等特點。完全基因敲除條件型基因敲除第十節(jié)基因敲除技術(geneknock-out)本文檔共66頁；當前第49頁；編輯于星期三\1點58分49本文檔共66頁；當前第50頁；編輯于星期三\1點58分50第十節(jié) 蛋白組學及其研究技術一、蛋白質組學的研究內(nèi)容二、蛋白質組學的研究技術1.免疫組織化學技術2.雙向電泳技術3.生物質譜技術4.酵母雙雜交和噬菌體展示技術5.芯片技術6.凝膠阻滯電泳（EMSA）7.DNaseI足跡法本文檔共66頁；當前第51頁；編輯于星期三\1點58分51mRNA經(jīng)翻譯產(chǎn)生蛋白質，一個細胞在特定生理或病理狀態(tài)下表達的所有種類的蛋白質稱為蛋白質組(proteome)蛋白質組學(proteomics)是1994年澳大利亞學者Wilkins和Williams提出的。蛋白組學(proteomics)旨在闡明生物體全部蛋白質的表達模式及功能模式，其內(nèi)容包括鑒定蛋白質的表達、存在方式、結構、功能和相互作用等。本文檔共66頁；當前第52頁；編輯于星期三\1點58分52一、蛋白質組學的研究內(nèi)容1.蛋白質鑒定2.翻譯后修飾3.蛋白質功能確定4.醫(yī)學應用本文檔共66頁；當前第53頁；編輯于星期三\1點58分53二、蛋白質組學的研究技術蛋白質組學分為結構蛋白質組學和功能蛋白質組學兩大類。前者主要研究蛋白質氨基酸序列及三維結構、種類分析和數(shù)量確定；后者主要研究蛋白質的功能和相互作用。本文檔共66頁；當前第54頁；編輯于星期三\1點58分54（一）免疫組織化學技術本文檔共66頁；當前第55頁；編輯于星期三\1點58分55（二）雙向電泳技術本文檔共66頁；當前第56頁；編輯于星期三\1點58分56（三）生物質譜技術本文檔共66頁；當前第57頁；編輯于星期三\1點58分57本文檔共66頁；當前第58頁；編輯于星期三\1點58分58（四）酵母雙雜交和噬菌體展示技術本文檔共66頁；當前第59頁；編輯于星期三\1點58分59（五）芯片技術本文檔共66頁；當前第60頁；編輯于星