紅細(xì)胞免疫功能測(cè)定方法

紅細(xì)胞免疫功能測(cè)定方法第一頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中免疫功能起著重要的作用，過(guò)去的觀點(diǎn)認(rèn)為免疫功能主要和白細(xì)胞有關(guān)，而紅細(xì)胞在其中所起的作用一直未受重視。1981年siegel提出了紅細(xì)胞免疫系統(tǒng)的新概念，開(kāi)辟了機(jī)體免疫功能研究的新紀(jì)元。紅細(xì)胞作為人體血液有形成份的主要組成部分與腫瘤細(xì)胞的接觸機(jī)會(huì)比其他細(xì)胞要大1000倍。紅細(xì)胞可以通過(guò)促吞噬作用、清除循環(huán)免疫復(fù)合物(CIC)、效應(yīng)細(xì)胞樣作用及對(duì)淋巴細(xì)胞和細(xì)胞因子的調(diào)控作用來(lái)達(dá)到抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。在正常情況下，紅細(xì)胞免疫和白細(xì)胞免疫(如T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)在機(jī)體內(nèi)相互聯(lián)系、密切配合、協(xié)同作戰(zhàn)，識(shí)別和清除腫瘤細(xì)胞，共同維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡和生物功能的穩(wěn)定。第二頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五1紅細(xì)胞與其它免疫反應(yīng)細(xì)胞的比較

紅細(xì)胞與其它血細(xì)胞均來(lái)源于骨髓造血干細(xì)胞。以往認(rèn)為雖然它們來(lái)源相同，但功能各異，前者主要是運(yùn)輸氣體，而后者則參與免疫和防御機(jī)制。目前研究表明，紅細(xì)胞不僅具有呼吸功能，且同白細(xì)胞一樣具有免疫功能。

第三頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五2紅細(xì)胞的免疫功能

2.1增強(qiáng)吞噬作用

納爾遜(Nelson)用肺炎球菌和梅毒螺旋體等進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)被相應(yīng)抗體致敏的肺炎球菌或梅毒螺旋體，只有在含補(bǔ)體、紅細(xì)胞及白細(xì)胞的混合物中，80％～95％能迅速被吞噬而從液相中消失；若缺少紅細(xì)胞，則在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)僅有少數(shù)被吞噬。1956年Nelson又將抗體調(diào)理過(guò)的肺炎球菌注入猴體內(nèi)，獲得的結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)相同，100％的肺炎球菌粘附于紅細(xì)胞。

第四頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五粘附的復(fù)合物較懸浮于血漿中游離的復(fù)合物更易被吞噬。某些病毒在體內(nèi)也能粘附于紅細(xì)胞，從而被吞噬消滅。免疫粘附可以增強(qiáng)吞噬作用4～5倍。紅細(xì)胞還能阻止癌細(xì)胞在循環(huán)中播散，因在外周血中癌細(xì)胞遇到紅細(xì)胞比遇到白細(xì)胞的機(jī)會(huì)多500～1000倍。當(dāng)癌細(xì)胞表面結(jié)合有抗體與補(bǔ)體時(shí)，則可通過(guò)紅細(xì)胞表面的C3b受體，使癌細(xì)胞粘附于紅細(xì)胞，故容易被吞噬細(xì)胞捕捉與吞噬，從而防止癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與擴(kuò)散。紅細(xì)胞還有吞噬細(xì)胞樣的功能，因?yàn)樵谄浼?xì)胞膜表面具有過(guò)氧化物酶，該酶是典型的溶酶體酶，它可起著巨噬細(xì)胞樣的殺傷作用。

第五頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五2.2紅細(xì)胞的免疫粘附作用

免疫粘附是指抗原-抗體復(fù)合物與補(bǔ)體C3b結(jié)合后，可粘附于靈長(zhǎng)目或非靈長(zhǎng)目的紅細(xì)胞與血小板上，這一現(xiàn)象統(tǒng)稱為“血細(xì)胞免疫粘附作用”。紅細(xì)胞的免疫粘附活性是通過(guò)I型補(bǔ)體受體（complementreceptortypeI，CR1)為基礎(chǔ)實(shí)現(xiàn)的。血循環(huán)中免疫復(fù)合物(IC)的清除主要由紅細(xì)胞CR1攜帶至肝脾網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)交給巨噬細(xì)胞消滅。CR1成簇分布，人類每個(gè)紅細(xì)胞大約表達(dá)200～500個(gè)CR1分子，主要配體為C3b。該受體為糖蛋白，分子量為205，000。紅細(xì)胞上的C3b受體占血循環(huán)中C3b受體總數(shù)的95％以上。因此，血循環(huán)中的抗原-抗體復(fù)合物遇到紅細(xì)胞比遇到白細(xì)胞的機(jī)會(huì)多500～1000倍。第六頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五2.3防御感染

紅細(xì)胞與細(xì)菌、病毒等微生物免疫粘附后，不僅可以通過(guò)過(guò)氧化物酶對(duì)它們產(chǎn)生直接的殺傷作用，而且還可以促進(jìn)吞噬細(xì)胞對(duì)它們的吞噬作用。因此，紅細(xì)胞的免疫功能可以看作是機(jī)體抗感染免疫的因素之一。小結(jié)：目前已知紅細(xì)胞具有以下免疫功能：(1)識(shí)別攜帶抗原；(2)清除循環(huán)中免疫復(fù)合物；(3)增強(qiáng)T細(xì)胞依賴反應(yīng)；(4)效應(yīng)細(xì)胞樣作用；(5)促進(jìn)吞噬作用。而這些免疫功能的生理學(xué)基礎(chǔ)即為紅細(xì)胞免疫粘附作用。

第七頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五3紅細(xì)胞免疫功能異常與疾病近年研究證實(shí)在某些病理狀態(tài)下，紅細(xì)胞的免疫粘附活性可發(fā)生改變。Siegel等檢查了23名宮頸癌、胃癌和直腸癌患者的紅細(xì)胞免疫粘附功能，發(fā)現(xiàn)這些患者的紅細(xì)胞粘附抗原-抗體-補(bǔ)體復(fù)合物的能力較正常人顯著降低。這一資料提示在腫瘤的發(fā)展過(guò)程中，除可抑制白細(xì)胞免疫功能外，還可抑制紅細(xì)胞的免疫功能。系統(tǒng)性紅斑性狼瘡（SLE）、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病，是因?yàn)榛颊唧w內(nèi)針對(duì)自身組織發(fā)生免疫反應(yīng)所致。一般認(rèn)為，自身免疫病患者的細(xì)胞免疫和/或體液免疫功能處于相對(duì)增強(qiáng)狀態(tài)。通過(guò)對(duì)此類病人紅細(xì)胞免疫系統(tǒng)的研究結(jié)果表明，其免疫功能亦明顯增強(qiáng)，且與白細(xì)胞免疫系統(tǒng)的功能改變相平行，這可能與自身免疫病患者血清中存在著紅細(xì)胞C3b受體活性抑制因子有關(guān)。第八頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五目前認(rèn)為原發(fā)性癲癇和銀屑病的發(fā)病也與自身免疫有關(guān)。郭峰等曾觀察到這兩種疾病患者的紅細(xì)胞免疫功能的變化與SLE等其它自身免疫病患者是一致的。

另外，再生障礙性貧血的患者，其紅細(xì)胞的免疫粘附作用降低，可能是由于患者造血功能障礙，所產(chǎn)生的紅細(xì)胞數(shù)量少而且質(zhì)量低劣，致使紅細(xì)胞膜上的C3b受體生成不足。慢性布氏菌病患者，其紅細(xì)胞免疫功能亦降低，致使清除感染因子的能力減弱，這種現(xiàn)象可能是引起該病經(jīng)久不愈的原因之一。第九頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五4紅細(xì)胞免疫功能的檢測(cè)及其臨床意義

4.1紅細(xì)胞C3b受體的測(cè)定原理：紅細(xì)胞膜上的C3b受體(CR1)可與補(bǔ)體致敏的酵母菌粘附形成花環(huán)(RBC-C3bR花環(huán))；同時(shí)紅細(xì)胞膜上粘附的IC中C3b分子或抗原補(bǔ)體復(fù)合物中的C3b分子可與未致敏的酵母菌的酵母多糖粘附形成花環(huán)（RBC-IC花環(huán)）。第十頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五意義：RBC-C3bR花環(huán)率和RBC-IC花環(huán)率可作為紅細(xì)胞天然免疫粘附功能的指標(biāo)。（1）若兩項(xiàng)指標(biāo)都低下，判為原發(fā)性紅細(xì)胞免疫功能低下，為紅細(xì)胞膜C3b受體受到破壞或遺傳基因缺陷及其他影響所致。（2）若RBC-C3bR花環(huán)率降低，而RBC-IC花環(huán)率增高，則為繼發(fā)性紅細(xì)胞免疫功能低下，是由于紅細(xì)胞CR1上免疫復(fù)合物或補(bǔ)體調(diào)理的抗原量增加所致。（3）若這兩項(xiàng)指標(biāo)都上升，判斷為紅細(xì)胞天然免疫功能亢進(jìn)與紊亂。第十一頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五4.2紅細(xì)胞CR1數(shù)量的測(cè)定

4.2.1紅細(xì)胞CR1密度相關(guān)基因多態(tài)性測(cè)定方法

DNA提取

PCR擴(kuò)增

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性酶切分析（RFLP分析）

瓊脂糖凝膠電泳第十二頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五4.2.2紅細(xì)胞CR1流式細(xì)胞儀測(cè)定方法

原理：?jiǎn)蝹€(gè)紅細(xì)胞CR1數(shù)量比白細(xì)胞CR1低，為了提高試驗(yàn)的敏感度，采用間接免疫熒光染色法流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù)。用鼠抗人紅細(xì)胞CR1單抗與一定量待測(cè)純紅細(xì)胞數(shù)反應(yīng)洗滌，再加羊抗鼠IgG熒光標(biāo)記抗體反應(yīng)洗滌后，上流式細(xì)胞儀測(cè)定，算出熒光染色紅細(xì)胞平均強(qiáng)度，為紅細(xì)胞CR1數(shù)量指標(biāo)。第十三頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五具體操作程序：在編號(hào)試管中分別加冷PBS50μl，加入鼠抗人紅細(xì)胞CR1(CD35)單抗1.5μl及待測(cè)枸櫞酸鈉抗凝新鮮血0.5μl，充分吹打混勻，置室溫下避光30min。加入PBS液2ml，1500r/min離心5min，棄上清液；加入熒光素標(biāo)記的第二抗體—羊抗鼠IgG-FITC1μl，吹打混勻，置室溫下避光30min；再加入PBS液2ml，充分混勻、洗滌，1500r/min離心5min，棄去上清夜后加入PBS300μl，混勻后置流式測(cè)試管中，嚴(yán)格按照流式細(xì)胞儀操作程序測(cè)定樣品和對(duì)照品，在計(jì)算機(jī)屏幕上顯示或記錄各待測(cè)標(biāo)本紅細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度。第十四頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五意義：紅細(xì)胞CR1數(shù)量流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)合CR1基因多態(tài)性及紅細(xì)胞CR1活性測(cè)定，對(duì)臨床上紅細(xì)胞免疫功能缺陷與亢進(jìn)分型更為客觀，對(duì)臨床輔助診斷及療效指標(biāo)都具有重要應(yīng)用價(jià)值。4.2.3紅細(xì)胞CR1單抗免疫酶聯(lián)法（ELISA法）

第十五頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五5正常紅細(xì)胞與異常紅細(xì)胞毛細(xì)管電泳分離能直接反映顆粒電性質(zhì)的毛細(xì)管電泳具有高效、簡(jiǎn)便、靈敏度高、樣品消耗少等優(yōu)點(diǎn)，在生化領(lǐng)域已經(jīng)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)及其衍生物、肽類、氨基酸、糖類物質(zhì)、無(wú)機(jī)離子、手性物質(zhì)等的分離與分析。運(yùn)用毛細(xì)管電泳的方法可以對(duì)正常紅細(xì)胞和被病毒感染的異常紅細(xì)胞進(jìn)行比較，以此來(lái)反映鑒定不同狀態(tài)的細(xì)胞。第十六頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五樣品制備1)正常紅細(xì)胞懸浮液用含6%葡萄糖的0.1mol/L，pH7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋紅細(xì)胞，通過(guò)血球板計(jì)數(shù)法，確定細(xì)胞濃度為1.86×107個(gè)/mL。2)異常紅細(xì)胞懸浮液取上述濃度紅細(xì)胞0.2mL與H1N1甲亞型流感病毒0.02mL充分混合，常溫(25℃)下反應(yīng)1ｈ。第十七頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五電泳條件每天運(yùn)行前用0.1mol/LHCl、0.1mol/LNaOH、水、緩沖液分別洗柱3、6、3、3min；每輪運(yùn)行前均用0.1mol/LNaOH、水、緩沖液分別洗柱3、1、1min；結(jié)束實(shí)驗(yàn)時(shí)用0.1mol/LHCl、0.1mol/LNaOH和水分別洗柱5、10、5min，最后將毛細(xì)管內(nèi)壁吹干保存。正極進(jìn)樣，負(fù)極檢測(cè)，均在室溫下進(jìn)行。進(jìn)樣壓力3.448kPa，進(jìn)樣時(shí)間5s；分離電壓20kV；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)214nm；分離溫度25℃。第十八頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五感染病毒后，在病毒作用下紅細(xì)胞表面荷電量會(huì)發(fā)生改變，致使細(xì)胞電泳速度和zeta電位發(fā)生改變。實(shí)驗(yàn)證明，被病毒感染的紅細(xì)胞與正常的紅細(xì)胞的出峰時(shí)間有明顯的差別