生物基因克隆載體的種類和特征

生物基因克隆載體的種類和特征第二章基因克隆載體的種類和特性生物基因克隆載體的種類和特征基因工程的基本條件A目的基因（從特定的生物基因組或cDNA中通過各種方法分離和擴(kuò)大繁殖獲得足夠量的目的基因或cDNA序列）B用于基因克隆的載體（合適的載體，并對(duì)載體DNA進(jìn)行克隆，制備足夠量的達(dá)到一定純度的載體DNA）C用于核酸操作的工具酶D用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞（宿主細(xì)胞）（能攝取外源重組DNA并使其穩(wěn)定維持和表達(dá)，或有待于實(shí)施遺傳改良的細(xì)胞）生物基因克隆載體的種類和特征一、載體的功能、特征及種類載體（vector)：攜帶外源基因(或DNA片段)進(jìn)入受體細(xì)胞（復(fù)制、整合或表達(dá)）的工具。使用載體的目的基因的復(fù)制擴(kuò)增基因的表達(dá)基因的整合基因的調(diào)控其他生物基因克隆載體的種類和特征1、載體的功能（1）運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞（2）為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力（3）為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供條件生物基因克隆載體的種類和特征2、載體應(yīng)具備的條件（1）具有對(duì)受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性（2）具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)（3）長(zhǎng)度盡可能小，以提高其載裝能力（4）具有多種單一的核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)(MultipleCloningSite,即多克隆位點(diǎn)，MCS）（5）具有合適的選擇性標(biāo)記生物基因克隆載體的種類和特征3、載體的種類（1）質(zhì)粒（plasmid）載體（又可分為：克隆載體、中間載體、穿梭載體和表達(dá)載體）（2）噬菌體（phage）載體

A、λ—噬菌體

B、考斯質(zhì)粒（粘性質(zhì)粒）（cosmid)

C、M13—DNA（單鏈絲狀噬菌體）（3）酵母人工染色體載體（YAC）（4）細(xì)菌人工染色體載體（BAC）（5）其他載體生物基因克隆載體的種類和特征4、載體的要求獨(dú)立復(fù)制可插入外源片段易分離，易操作生物基因克隆載體的種類和特征二、質(zhì)粒（plasmid)1、質(zhì)粒是存在于細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中獨(dú)立于染色體而自主復(fù)制的共價(jià)、閉合、環(huán)狀雙鏈DNA分子（CovalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)，質(zhì)粒是一類引人注目的亞細(xì)胞有機(jī)體，其結(jié)構(gòu)比病毒還要簡(jiǎn)單，既無(wú)蛋白質(zhì)外殼，也無(wú)細(xì)胞外生命周期，只能在寄主細(xì)胞內(nèi)增殖，并隨著寄主細(xì)胞的分裂而被遺傳下去。2、它并不是細(xì)菌生長(zhǎng)所必需的，但可以賦予細(xì)菌某些抵御外界環(huán)境因素不利影響的能力。質(zhì)粒類型多種多樣，有F質(zhì)粒也叫性質(zhì)粒；有編碼抗菌素抗性基因的質(zhì)粒叫R質(zhì)粒，R質(zhì)?？蓪⑵淇剐赞D(zhuǎn)移到缺乏該質(zhì)粒的適宜的受體細(xì)胞，使后者也獲得同樣的抗菌素抗性能力；有產(chǎn)生大腸桿菌毒素的Col質(zhì)粒等。3、質(zhì)粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定地條件下又會(huì)可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過細(xì)胞分裂傳遞到后代。4、質(zhì)粒DNA不僅能在細(xì)菌中復(fù)制，并且在添加真核復(fù)制信號(hào)和啟動(dòng)子后，可以構(gòu)建出能在原核和真核細(xì)胞中均可復(fù)制的穿梭質(zhì)粒，并在真核細(xì)胞中表達(dá)，因此這類載體在基因工程中應(yīng)用廣泛。生物基因克隆載體的種類和特征除了酵母的殺傷質(zhì)粒(Killerplasmid)是RNA質(zhì)粒外，所有的質(zhì)粒都是DNA質(zhì)粒。質(zhì)粒DNA的大小：文獻(xiàn)中有3種說(shuō)法：小的僅有103KD，僅能編碼2-3種蛋白質(zhì)；大的可達(dá)105KD，兩者相差上百倍。

1Kb～200Kb(Sambroketal.)

5Kb～400Kb(Lehninger)

MD(megadaltons)=106D(兆道爾頓)

1.5Kb≈1MD質(zhì)粒DNA分子量范圍：一般在1-200kb之間,多數(shù)10kb左右生物基因克隆載體的種類和特征質(zhì)粒常見于原核細(xì)菌和真菌中生物基因克隆載體的種類和特征發(fā)展概況

1.

第一階段（1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322(1977,Bolivaretal)2.

第二階段：增大載體容量（降低載體長(zhǎng)度），建立多克隆位點(diǎn)區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如pUC系列載體。

3.第三階段：進(jìn)一步完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動(dòng)子載體，表達(dá)型載體及各種探針型載體。質(zhì)粒載體是上世紀(jì)70年代實(shí)驗(yàn)室普遍使用的基因克隆載體。生物基因克隆載體的種類和特征（一）質(zhì)粒的生物學(xué)特點(diǎn)1、自主復(fù)制性(Self-replication)：2、相容性和不相容性(incompatibility)

：3、可轉(zhuǎn)移性：生物基因克隆載體的種類和特征1、質(zhì)粒的自主復(fù)制性：質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制質(zhì)粒DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對(duì)應(yīng)關(guān)系根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)粒可分為兩大復(fù)制類型：

嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒（stringentplasmid）：質(zhì)粒的復(fù)制受寄主細(xì)胞染色體DNA和染色體蛋白質(zhì)的控制，在細(xì)胞中以低拷貝數(shù)量形式存在，1-3

拷貝。（低拷貝數(shù)質(zhì)粒）

松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒（relaxedplasmid）：質(zhì)粒的復(fù)制不受寄主細(xì)胞染色體DNA和染色體蛋白質(zhì)的控制，在細(xì)胞中以高拷貝數(shù)量形式存在，10-60

拷貝。（高拷貝數(shù)質(zhì)粒）

生物基因克隆載體的種類和特征1、質(zhì)粒的自主復(fù)制性：拷貝數(shù)的控制機(jī)制–質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動(dòng)控制控制復(fù)制起始因子與復(fù)制起始位點(diǎn)（ori）的結(jié)合PcopcopP/OrepreporiCopRep抑制蛋白↘起始蛋白↘生物基因克隆載體的種類和特征質(zhì)粒復(fù)制控制的分子模型：*抑制蛋白質(zhì)稀釋模型(Inhibitordilutionmodel)

關(guān)鍵論點(diǎn)是：阻遏蛋白質(zhì)是組成型合成，其濃度同質(zhì)粒的拷貝數(shù)成正比。*自體阻遏蛋白質(zhì)模型(Autorepressormodel)

關(guān)鍵論點(diǎn)是：阻遏蛋白質(zhì)的合成受負(fù)反饋(Negativefeedback)機(jī)理調(diào)節(jié)，而且其濃度是恒定的。生物基因克隆載體的種類和特征1）．抑制蛋白質(zhì)稀釋模型觀點(diǎn)：

a.質(zhì)粒DNA的復(fù)制，是受一種由質(zhì)粒DNA編碼的抑制蛋白質(zhì)Cop調(diào)控的。

b.細(xì)胞中Cop蛋白質(zhì)的濃度是同質(zhì)粒分子的拷貝數(shù)成正比。蛋白質(zhì)抑制質(zhì)粒DNA復(fù)制活性的作用方式有兩種途徑：第一種途徑：直接抑制途徑。通過同質(zhì)粒DNA的復(fù)制起點(diǎn)(Ori)結(jié)合，直接地抑制質(zhì)粒的復(fù)制。第二種途徑：間接抑制途徑通過阻斷起始蛋白質(zhì)的合成，間接地抑制質(zhì)粒DNA的合成。*一般認(rèn)為單體狀態(tài)的Cop抑制蛋白質(zhì)沒有活性，只有它處于多體狀態(tài)時(shí)才有活性的；單體抑制蛋白質(zhì)和多體抑制蛋白質(zhì)間的平衡，完全取決于細(xì)胞中的抑制蛋白質(zhì)自身的濃度；作用機(jī)理：在細(xì)胞生長(zhǎng)過程中，體積加大→抑制蛋白質(zhì)的濃度隨之下降→形成單體的抑制蛋白質(zhì)→失去抑制活性，結(jié)果對(duì)質(zhì)粒DNA的復(fù)制的抑制作用也就被撤除了→質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動(dòng)→拷貝數(shù)不斷上升→到一定程度形成多體形式的抑制蛋白質(zhì)→具有抑制活性→重新導(dǎo)致質(zhì)粒DNA復(fù)制活性的抑制。生物基因克隆載體的種類和特征2）．自體阻遏蛋白質(zhì)模型第一種解釋：質(zhì)粒DNA的復(fù)制是由一種叫做起始因子蛋白質(zhì)Rep引發(fā)的；這種Rep蛋白質(zhì)是質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動(dòng)作用的限速因子，它的濃度決定著每個(gè)細(xì)胞每個(gè)世代之質(zhì)粒分子的最終復(fù)制總數(shù)；Rep=起始因子蛋白質(zhì)起始因子蛋白質(zhì)Rep的編碼基因rep和自體阻遏蛋白質(zhì)編碼基因atr，同屬于一個(gè)操縱子,共轉(zhuǎn)錄成一個(gè)mRNA分子；Atr=自體阻遏蛋白質(zhì)自體阻遏蛋白質(zhì)通過同啟動(dòng)子-操縱單元(P/O)的結(jié)合作用,調(diào)節(jié)質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)錄作用，以維持細(xì)胞中Atr和Rep蛋白質(zhì)處于恒定的水平；由Atr蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)產(chǎn)生的Rep蛋白質(zhì)，是通過同復(fù)制起點(diǎn)(ori)的結(jié)合，引發(fā)質(zhì)粒DNA的復(fù)制。第二種解釋：Rep蛋白質(zhì)是一種具有雙重功能的蛋白質(zhì)：

a.它既有自體阻遏蛋白質(zhì)的功能，可同P/O區(qū)結(jié)合而抑制轉(zhuǎn)錄作用；

b.它又有起始蛋白質(zhì)的功能，能對(duì)復(fù)制起點(diǎn)(ori)發(fā)生作用，引發(fā)質(zhì)粒DNA進(jìn)行復(fù)制。自體阻遏蛋白質(zhì)提供的這種負(fù)反饋環(huán)(Negativefeedbackloop)。保證了細(xì)胞中的Rep蛋白質(zhì)的濃度，因而也就使質(zhì)粒DNA的復(fù)制速率處于恒定狀態(tài)，而與細(xì)胞的體積、生長(zhǎng)速率或質(zhì)粒的拷貝數(shù)無(wú)關(guān)。生物基因克隆載體的種類和特征2、質(zhì)粒的相容性和不相容性(又稱為親和性與不親和性)

①：在同一時(shí)間內(nèi)從一個(gè)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)多個(gè)不同類型的質(zhì)粒，只有當(dāng)不同的質(zhì)粒是相容的時(shí)才能存在于同一個(gè)細(xì)胞中；②：質(zhì)粒的不相容性是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一寄主細(xì)胞中穩(wěn)定共存的現(xiàn)象。不相容的質(zhì)粒一般都利用同一復(fù)制系統(tǒng)，拷貝多的復(fù)制更快，結(jié)果在細(xì)菌繁殖幾代之后，細(xì)菌的子細(xì)胞中絕大多數(shù)都含有占優(yōu)勢(shì)的質(zhì)粒。③：注意：只有當(dāng)有確切的證據(jù)表明第二種B質(zhì)粒已經(jīng)進(jìn)入含有A質(zhì)粒的寄主細(xì)胞，而且它的DNA不受寄主細(xì)胞限制體系的降解作用，但這兩種細(xì)胞卻不能長(zhǎng)期共存，只有在這種情況下，我們才能說(shuō)A和B是不親和的質(zhì)粒。④：不親和群的概念：彼此之間互不相容的質(zhì)粒，屬于同一不親和群(incompatibilitygroup)。彼此能夠共存的質(zhì)粒則屬于不同的不親和群。同一不親和群的質(zhì)粒在親緣關(guān)系上則比較接近。生物基因克隆載體的種類和特征⑤質(zhì)粒不親和性的分子基礎(chǔ)質(zhì)粒不親和性的分子基礎(chǔ)，主要是由于它們?cè)趶?fù)制功能之間的相互干擾造成的：*1負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)(negativefeed-backloop)大多數(shù)質(zhì)粒產(chǎn)生可控制質(zhì)粒復(fù)制的阻遏蛋白質(zhì)，其數(shù)量與細(xì)胞中質(zhì)?？截悢?shù)成正比。在質(zhì)?？截悢?shù)少的情況下，細(xì)胞中阻遏蛋白質(zhì)亦相對(duì)降低，于是阻遏蛋白質(zhì)與質(zhì)粒DNA中靶序列相互作用，使之發(fā)生復(fù)制。隨著質(zhì)粒DNA復(fù)制的結(jié)果，質(zhì)?？截悢?shù)上升，于是所編碼產(chǎn)生的阻遏蛋白質(zhì)也就隨之增多。細(xì)胞中阻遏蛋白質(zhì)濃度增多的結(jié)果，會(huì)形成二聚體，于是失去與質(zhì)粒DNA結(jié)合并促使其發(fā)生復(fù)制的能力。結(jié)果質(zhì)粒復(fù)制停止，也就是說(shuō)質(zhì)粒拷貝數(shù)是受阻遏蛋白質(zhì)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)：負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)(negativefeed-backloop)

當(dāng)質(zhì)粒面臨高拷貝數(shù)和高濃度的阻遏蛋白時(shí)，其復(fù)制活動(dòng)便被抑制了。當(dāng)質(zhì)粒處于低拷貝數(shù)和低濃度的阻遏蛋白時(shí)，其復(fù)制活動(dòng)更會(huì)繼續(xù)進(jìn)行。生物基因克隆載體的種類和特征*2.同一個(gè)細(xì)胞含兩種相容質(zhì)粒

由于這兩種相容質(zhì)粒親緣關(guān)系遠(yuǎn)，故它們所產(chǎn)生的阻遏蛋白質(zhì)就不會(huì)互相影響另一個(gè)質(zhì)粒的復(fù)制。于是這兩種相容的質(zhì)粒在同一細(xì)胞中都保持著自己的正常拷貝數(shù)。*3.同一細(xì)胞含兩種不相容的質(zhì)粒鑒于兩不相容的質(zhì)粒親緣關(guān)系密切，它們所產(chǎn)生的阻遏蛋白質(zhì)不僅影響自身質(zhì)粒DNA復(fù)制，還會(huì)彼此影響對(duì)方質(zhì)粒DNA的復(fù)制。這就出現(xiàn)了兩種阻遏蛋白質(zhì)聯(lián)合調(diào)控質(zhì)粒復(fù)制速率?！|(zhì)?？截悢?shù)控制體系無(wú)法辨別這兩種不相容性質(zhì)粒，只是隨機(jī)地選擇其中一種進(jìn)行復(fù)制。于是出現(xiàn)拷貝數(shù)偏差?！齼煞N不相容質(zhì)粒往往拷貝數(shù)不相當(dāng)，其中高拷貝數(shù)的對(duì)復(fù)制抑制劑的敏感性較低拷貝數(shù)的要差一些。因此在復(fù)制抑制劑(阻遏蛋白質(zhì))濃度低的情況下，高拷貝質(zhì)粒仍可復(fù)制，從而最終使低拷貝質(zhì)粒被淘汰掉(稀釋掉)。生物基因克隆載體的種類和特征革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢悾?/p>

接合型質(zhì)粒：能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞（接合作用），如F、Col、R質(zhì)粒等；

非接合型質(zhì)粒：不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用，如Col、R的其它成員值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個(gè)過程由bom和mob基因決定基因工程一般只能利用非接接合型質(zhì)粒，保證分子操作過程中質(zhì)粒在細(xì)胞中的穩(wěn)定性。3、質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性生物基因克隆載體的種類和特征質(zhì)粒DNA的分子構(gòu)型SC構(gòu)型：即共價(jià)閉合環(huán)形的cccDNA所呈現(xiàn)的超螺旋構(gòu)型。走在凝膠的最前面。OC構(gòu)型：即開環(huán)DNA(ocDNA)所呈現(xiàn)的構(gòu)型，其中一條DNA鏈保持完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)，另一條鏈上則出現(xiàn)有一個(gè)至數(shù)個(gè)的缺口。走在凝膠的最后方部位。L構(gòu)型：發(fā)生雙鏈斷裂形成的線性DNA分子所呈現(xiàn)的構(gòu)型，通稱L型。走在凝膠中間部位。生物基因克隆載體的種類和特征生物基因克隆載體的種類和特征質(zhì)粒的電泳圖譜生物基因克隆載體的種類和特征（二）質(zhì)粒載體必須具備的條件

（3種共同的組成部分）1、具有復(fù)制區(qū)或復(fù)制因子(replicator)

復(fù)制因子：是指一段特定的質(zhì)粒DNA，它含有質(zhì)粒DNA的復(fù)制起點(diǎn)(ori)(origin

of

replication)，以及編碼質(zhì)粒DNA和質(zhì)粒復(fù)制所需要的DNA序列結(jié)構(gòu)。*注意復(fù)制因子(replicator)和復(fù)制子(replicon)之間在概念上的差別。復(fù)制子(replicon)：系指含有一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)的DNA復(fù)制單位，例如細(xì)菌染色體、病毒基因組、質(zhì)粒基因組等，凡其DNA能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單元均稱為復(fù)制子。*在一般的情況下，一個(gè)質(zhì)粒只含有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，構(gòu)成一個(gè)獨(dú)立的復(fù)制子。但在少數(shù)的情況下，由融合產(chǎn)生的質(zhì)粒也會(huì)含有兩個(gè)復(fù)制子，但其中只有一個(gè)有活性。生物基因克隆載體的種類和特征2、具有抗菌素抗性基因

一種理想的質(zhì)粒克隆載體應(yīng)具有兩種抗菌素抗性基因，以便為寄主細(xì)胞提供易于檢測(cè)的表型性狀作為選擇記號(hào)，而且在有關(guān)的限制酶識(shí)別位點(diǎn)上插入外源DNA片段之后形成的重組質(zhì)粒，至少仍要保留一個(gè)強(qiáng)選擇記號(hào)。3、具有若干限制酶單一識(shí)別位點(diǎn)

這樣的分子結(jié)構(gòu)特性，可以滿足基因克隆的需要，而且在其中插入適當(dāng)大小的外源DNA片段之后，應(yīng)不影響質(zhì)粒DNA的復(fù)制功能。生物基因克隆載體的種類和特征4、具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)這類質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)在于：

a.低分子量質(zhì)粒易于操作，克隆了外源DNA片段之后(一般不超過15Kb)仍可有效地轉(zhuǎn)化給受體細(xì)胞；

b.含有較高的拷貝數(shù)有利于質(zhì)粒DNA的制備，增加克隆DNA片段(基因)的產(chǎn)量；

c.低分子量的質(zhì)粒分子中對(duì)某種限制酶具多重識(shí)別位點(diǎn)的機(jī)率也就相應(yīng)下降；生物基因克隆載體的種類和特征質(zhì)粒的遺傳標(biāo)記基因1、標(biāo)記基因的作用

1）指示外源DNA分子（載體或重組分子）是否進(jìn)入宿主細(xì)胞這種指示可以是選擇性的（Ampr

，Tetr

，Kanr），也可以是非選擇性的（如lacZ）

2）指示外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子。*這種指示也可以是選擇性的（如TcS），也可以是非選擇性的（如TcS，

lacZα），絕大多數(shù)為后者。

**有的遺傳標(biāo)記基因可以完成上述兩項(xiàng)作用。當(dāng)充任第一作用時(shí)，最好是選擇性標(biāo)記基因；當(dāng)完成第二作用時(shí)，目前多采用非選擇性的—檢測(cè)性標(biāo)記基因。有的基因是不能用作選擇性標(biāo)記基因（lacZ等）。生物基因克隆載體的種類和特征2、

標(biāo)記基因的種類

1）抗性標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）主要是抗生素抗性基因:Ampr

，Tetr

，Cmlr，Kanr，Strr2）生化標(biāo)記基因其表達(dá)產(chǎn)物可催化某些易檢測(cè)的生化反應(yīng)，如lacZ生物基因克隆載體的種類和特征3、常用的遺傳標(biāo)記基因及其作用機(jī)制1)四環(huán)素抗性基因（TetrorTcr）

Tetracycline

可結(jié)合在核糖體30s亞基中的一種蛋白質(zhì)分子上，抑制核糖體的轉(zhuǎn)位過程。四環(huán)素抗性基因編碼一種399AAs的蛋白質(zhì)，與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合，阻止四環(huán)素分子進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞。

2)氨芐青霉素抗性基因（Ampr

orApr）

Ampicillin可抑制細(xì)菌細(xì)胞膜上參與細(xì)胞壁合成酶類的活性。Apr抗性基因編碼一種分泌到細(xì)菌細(xì)胞周間質(zhì)的酶，可特異性地切割氨芐青霉素的β—內(nèi)酰胺環(huán)，使氨芐青霉素失活。生物基因克隆載體的種類和特征3)氯霉素抗性基因（CmlrorCmr）

Chlorophenicol可結(jié)合在核糖體50S亞基上，阻止蛋白質(zhì)合成。Cmr基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，使氯霉素乙?；?，導(dǎo)致乙?；穆让顾夭荒芙Y(jié)合在核糖體上。4)卡那霉素(Kanr),新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因

Kanamycin，Neomycin和G418均屬脫氧鏈霉胺氨基葡萄糖苷類抗生素，可結(jié)合在核糖體上阻止蛋白質(zhì)的合成。Kanr等抗性基因均可使這類抗生素磷酸化，使之不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。生物基因克隆載體的種類和特征5）β—半乳糖苷酶基因（lacZ

和lacZα）

β—半乳糖苷酶基因有1021AAs，基因產(chǎn)物裝配為四聚體后才有酶活。該蛋白質(zhì)可分為兩部分：α鏈和β鏈。前者負(fù)責(zé)四聚體裝配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有當(dāng)兩者都存在時(shí)，才會(huì)表現(xiàn)出酶活性，該作用稱之為α-互補(bǔ)作用。這兩個(gè)部分可獨(dú)立存在，分別由兩個(gè)基因編碼。為α鏈編碼的基因稱之為lacZα(編碼145

AAs)。這兩個(gè)基因（LacZ和LacZα）均可作為標(biāo)記基因。

lacZ（lacZα）中含有多克隆位點(diǎn)，當(dāng)無(wú)外源DNA片段插入時(shí)，質(zhì)粒表達(dá)β—半乳糖苷酶的α-肽，與缺失突變體宿主菌（不能編碼α-肽）表達(dá)的lacZ基因產(chǎn)物（β鏈）互補(bǔ)，產(chǎn)生有活性的β—半乳糖苷酶，在含有指示劑X-gal和誘導(dǎo)劑IPTG的存在下，菌落呈現(xiàn)蘭色；外源基因插入后，破壞了lacZα-肽基因的結(jié)構(gòu)，細(xì)菌內(nèi)不能產(chǎn)生β—半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。生物基因克隆載體的種類和特征β—半乳糖苷酶基因的優(yōu)點(diǎn):

a.

酶催化X-Gal水解為蘭色產(chǎn)物，檢測(cè)直觀

b.lacZα編碼的5‘-端可允許很大的變化（如加入多克隆位點(diǎn)）而不影響酶活性

c.lacZα和β鏈基因的分別表達(dá)可使載體小而容量大生物基因克隆載體的種類和特征PLacZαLacZβ

轉(zhuǎn)錄

翻譯

αβLacZ基因的結(jié)構(gòu)與產(chǎn)物pUC18BamHI片段重組DNA分子

轉(zhuǎn)化E.coli外源DNABamHI片段

涂布在含X-Gal和Ap的平板上,白色菌落為重組子，蘭色菌落為原載體利用LacZ基因篩選重組子生物基因克隆載體的種類和特征質(zhì)粒的選擇性標(biāo)記生物基因克隆載體的種類和特征（三）質(zhì)粒的分類1、根據(jù)質(zhì)?；蚓幋a的特性分五大類：A、致育質(zhì)粒（fertilityplasmid)/F-質(zhì)粒：只含有轉(zhuǎn)移基因（tra-)，除了促進(jìn)接合轉(zhuǎn)移外沒有其他功能。B、抗性質(zhì)粒（resistance

plasmid)/R質(zhì)粒：含有氯霉素、青霉素或水銀抗性基因。如RP4質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)于假單胞桿菌。C、Col質(zhì)粒（col-plasmid)：編碼大腸桿菌毒素（colicine)，可以殺死其他細(xì)菌，如存在于中的CoE1質(zhì)粒。生物基因克隆載體的種類和特征D、降解質(zhì)粒（Degradativeplasmids)：可以降解特殊的分子，如：甲苯、水楊酸。E、致瘤質(zhì)粒（Virulence

plasmids)或叫烈性質(zhì)粒：可以使宿主細(xì)菌變成病原體，如根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒。生物基因克隆載體的種類和特征2、人工構(gòu)建的質(zhì)粒據(jù)功能及用途可分為六大類：A、多拷貝質(zhì)粒：復(fù)制子經(jīng)過人工突變，除去控制拷貝數(shù)的負(fù)調(diào)節(jié)基因，使質(zhì)?？截悢?shù)達(dá)到每個(gè)細(xì)胞數(shù)千，用于擴(kuò)增外源基因。B、測(cè)序質(zhì)粒：C、整合質(zhì)粒：裝有整合促進(jìn)基因及整合特異序列，便于外源基因準(zhǔn)確重組整合入受體細(xì)胞的染色體上。D、穿梭質(zhì)粒：含有兩個(gè)不同的復(fù)制子，能在兩種不同的受體細(xì)胞中復(fù)制。E、表達(dá)質(zhì)粒：裝有強(qiáng)的啟動(dòng)基因，合適的順序以及有效的終止子，以便任何外源基因在受體細(xì)胞內(nèi)的高效表達(dá)。F、探針質(zhì)粒：篩選克隆或?qū)ふ一蛟ǔＱb有一個(gè)可定量測(cè)定其表達(dá)的標(biāo)記基因，如抗性基因。篩選啟動(dòng)子、終止子等。生物基因克隆載體的種類和特征（四）實(shí)驗(yàn)室常用質(zhì)粒1、pBR322：該質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)：1）分子大小4363bp，容易純化。2）含有2個(gè)抗生素抗性基因,ampR和tetR,可以作為選擇標(biāo)記。3）受體細(xì)胞內(nèi)，pBR322以多拷貝存在，一般一個(gè)細(xì)胞內(nèi)可達(dá)到15個(gè)，而在蛋白質(zhì)合成抑制劑存在下，可達(dá)到1000-3000拷貝，如氯霉素?？梢援a(chǎn)生大量的重組pBR322分子。生物基因克隆載體的種類和特征pBR332質(zhì)粒生物基因克隆載體的種類和特征生物基因克隆載體的種類和特征生物基因克隆載體的種類和特征生物基因克隆載體的種類和特征2、pBR325、pBR327：

它們都是在pBR322

基礎(chǔ)上去掉1000bp左右的片段，留下了ampR和tetR的完整片段，但改變了質(zhì)粒復(fù)制和接合能力。生物基因克隆載體的種類和特征生物基因克隆載體的種類和特征生物基因克隆載體的種類和特征3、pUC質(zhì)粒：也來(lái)自于pBR322，pUC18和pUC19是最常用的質(zhì)粒載體，幾乎未含多余的DNA片段。優(yōu)點(diǎn)：ColE1復(fù)制起點(diǎn)，松弛性，高拷貝，Rop基因（控制拷貝數(shù)的基因）突變，松弛性更強(qiáng)。Amp(R)MCS（單一的多種常用內(nèi)切酶位點(diǎn)）－互補(bǔ)（在MCS中插入外源片段后，可通過—互補(bǔ)作用形成的藍(lán)色和白色菌落篩選重組質(zhì)粒）小分子質(zhì)粒（小于3000bp)生物基因克隆載體的種類和特征拷貝數(shù)：500-2000裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）正選擇顏色標(biāo)記lacZ’用于基因克隆和測(cè)序重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體：pUC18/pUC19生物基因克隆載體的種類和特征生物基因克隆載體的種類和特征4、pGEM3Z：

pGEM3Z與pUC載體非常相似，不同的是pGEM3Z含有兩段額外的短的DNA片段，每一段可以作為RNA聚合酶的識(shí)別位點(diǎn)。生物基因克隆載體的種類和特征生物基因克隆載體的種類和特征生物基因克隆載體的種類和特征5、多功能質(zhì)粒載體：pBluescriptKS(±)或SK(±)生物基因克隆載體的種類和特征生物基因克隆載體的種類和特征質(zhì)粒載體的優(yōu)缺點(diǎn)簡(jiǎn)便易操作質(zhì)粒穩(wěn)定質(zhì)粒文庫(kù)不穩(wěn)定質(zhì)粒容載外源DNA的長(zhǎng)度有限質(zhì)粒文庫(kù)放大不均衡生物基因克隆載體的種類和特征三、細(xì)菌噬菌體載體細(xì)菌噬菌體簡(jiǎn)稱噬菌體，它是專性侵染細(xì)菌的病毒。能高效率高特異性地侵染宿主細(xì)胞，然后或自主復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來(lái)，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會(huì)相互轉(zhuǎn)化。高效率的感染性能使外源基因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞，自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增噬菌體結(jié)構(gòu)非常簡(jiǎn)單，一般由蛋白質(zhì)外殼和內(nèi)部DNA分子組成。兩種主要的噬菌體結(jié)構(gòu)類型是：

1）頭尾結(jié)構(gòu)（λ噬菌體載體）

2）絲狀結(jié)構(gòu)（M13單鏈絲狀噬菌體）。生物基因克隆載體的種類和特征（一）λ噬菌體載體（lambdaphagevector)1、λ噬菌體的生物學(xué)特性2、λ噬菌體的感染周期3、λ噬菌體的溶源狀態(tài)生物基因克隆載體的種類和特征大腸桿菌的λ噬菌體DNA1、λ噬菌體的生物學(xué)特性：λ噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體，λ

-DNA全長(zhǎng)48502個(gè)核苷酸，λ

-DNA上至少有61個(gè)基因生物基因克隆載體的種類和特征5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’

粘性末端（COS位點(diǎn)）COScos頭部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因