生物大分子的色譜分離和純化實驗

生物大分子的色譜分離和純化實驗分離方法從現(xiàn)在分離科學(xué)理論計算得出，色譜和電泳是目前所知最好的兩種分離方法，其理論塔板數(shù)可達百萬數(shù)量級。但是，因受各種因素的限制，電泳目前尚不能用于生產(chǎn)規(guī)模的生物大分子的分離純化，這就是人們把分離和純化生物大分子（包括蛋白質(zhì)、酶、核酸和多糖等，以下簡稱蛋白）的研究重點放在色譜上的原因。生物大分子的色譜分離和純化實驗純化蛋白的設(shè)備和生產(chǎn)成本相當昂貴，以致在基因工程生產(chǎn)治療蛋白的生產(chǎn)總成本中，分離和純化要占70%～90%。色譜所分離出的雜蛋白的種類和數(shù)量要比傳統(tǒng)的方法多的多，這類蛋白可能有熱源、病毒、DNA和RNA、不準確轉(zhuǎn)化的蛋白、糖化或氧化產(chǎn)物、聚集體和與目標產(chǎn)品有類似構(gòu)象的異構(gòu)體等，以及某些蛋白的復(fù)性工序所帶入的新雜質(zhì)。生物大分子的色譜分離和純化實驗色譜分離（ChromatographicResolution，CR）

利用多組分混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)（如吸附力、分子極性、分子形狀和大小、分子親合力、分配系數(shù)等）的差別，使各組分以不同程度分布在固定相和流動相中。當多組分混合物隨流動相流動時，由于各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差別，而以不同的速率移動，使之分離。生物大分子的色譜分離和純化實驗分離效率高，每米柱長可達幾千至幾十萬的塔板數(shù)；應(yīng)用范圍廣，從極性到非極性、離子型到非離子型、小分子到大分子、無機到有機及生物活性物質(zhì)，以及熱穩(wěn)定到熱不穩(wěn)定的化合物，尤其是對生物大分子樣品的分離，是其他方法無法代替的；選擇性強；高靈敏度的在線檢測，可采用不同的高靈敏度檢測器進行連續(xù)的在線檢測；快速分離；過程自動化操作。優(yōu)點生物大分子的色譜分離和純化實驗生物大分子的色譜分離和純化實驗生物大分子的色譜分離和純化實驗在色譜操作中，加入洗脫劑而使各組分分層的操作稱為展開（Development），洗脫時從柱中流出的溶液稱為洗脫（Eluate），而展開后各組分的分布情況稱為色譜（Chromatography）。色譜分離的基本原理生物大分子的色譜分離和純化實驗1.按分離機理不同分類色譜分離的分類吸附色譜分離（AdsorptionChromatography，AC）分配色譜（DistributionChromatography，DC）離子交換色譜（IonExchangeChromatography，IEC）凝膠色譜（GelChromatography，GC）親合色譜（AffinityChromatography，AFC）生物大分子的色譜分離和純化實驗?zāi)z色譜以凝膠為固定相，是一種根據(jù)各物質(zhì)分子大小不同而進行分離的色譜技術(shù)，又稱為分子篩色譜（MolecularSieveChromatography，MSC）、空間排阻色譜或尺寸排阻色譜（SizeExclusionChromatography，SEC）。生物大分子的色譜分離和純化實驗?zāi)z是一種不帶電荷的具有三維空間的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，凝膠的每個顆粒的細微結(jié)構(gòu)就如一個篩子。當混合物隨流動相流經(jīng)凝膠柱時，較大的分子不能進入所有的凝膠網(wǎng)孔而受到排阻，它們將與流動相一起首先流出，較小的分子能進入部分凝膠網(wǎng)孔，流出的速度較慢，更小的分子能進入全部凝膠網(wǎng)孔，而最后從凝膠柱中流出。凝膠色譜主要用于脫鹽、分級分離及分子量的測定。

生物大分子的色譜分離和純化實驗吸附色譜分離

是指混合物隨流動相通過固定相（吸附劑）時，由于固定相對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物分離的方法。新的吸附色譜技術(shù)有：疏水作用色譜（HydrophobicInteractionChromatography，HIC）、金屬螯合作用色譜（MetalChelationChromatography，MCC）、共價作用色譜（CovalentInteractionChromatography，CIC）等；吸附劑有氧化鋁、硅膠、活性炭、膨潤土、磷酸鈣、氧化鈦、氫氧化鋅凝膠等。生物大分子的色譜分離和純化實驗色譜分類(按照進樣量)1、分析色譜（10mg）2、中等規(guī)模制備色譜或半制備色譜（10-50mg）3、制備色譜（）4、工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模色譜（大于20g/d）生物大分子的色譜分離和純化實驗第一節(jié)基本理論一、計量置換保留理論(1)溶質(zhì)計量置換吸附理論。它的核心是，當一個溶質(zhì)被吸附劑吸附時，在溶質(zhì)分子和吸附劑接觸表面處必然會釋放出一定數(shù)目的溶劑分子。生物大分子的色譜分離和純化實驗（2）計量置換保留理論生物大分子的色譜分離和純化實驗計量置換保留理論

Lgk’=lgI-Zlg[D]-------簡化數(shù)學(xué)表達式（基于在色譜體系中溶質(zhì)、流動相和固定相分子間的相互作用）生物大分子的色譜分離和純化實驗二、有效柱長和最短柱長液相色譜（LC）分離小分子溶質(zhì)時，從理論上講，色譜柱愈長，分離效果愈好，但因其長度受到色譜儀提供的壓力的限制，色譜柱不可能無限度長。在實際應(yīng)用中，一般認為色譜柱的長徑比為10，是色譜柱較為合適的幾何比例。生物大分子而言，它的保留主要是流動相中，置換劑的濃度決定的，柱長對生物大分子的分離幾乎沒有影響，有時甚至會出現(xiàn)短柱比長柱分離效果還好的情況。生物大分子的色譜分離和純化實驗不同溶質(zhì)在其遷移速度大于零，但小于流動相的線性流速時，溶質(zhì)在色譜柱上的遷移對分離有貢獻，此時溶質(zhì)遷移所經(jīng)歷的柱長對分離有貢獻。而當其遷移速度等于流動相速度時（即固定相不吸附溶質(zhì)或溶質(zhì)完全從固定相洗脫時），溶質(zhì)遷移所經(jīng)歷的柱長對分離無貢獻。定義溶質(zhì)從開始遷移至其遷移速度等于流動相速度時，溶質(zhì)在色譜柱上遷移的距離稱之為有效遷移距離，也稱為有效柱長。生物大分子的色譜分離和純化實驗生物大分子的色譜分離和純化實驗其它色譜條件相同的條件下，有效遷移距離Leff是隨溶質(zhì)的不同而變化的，對同一種溶質(zhì)而言，k1’值愈小，其對應(yīng)的Leff就愈小，洗脫所需時間也就愈短，反之，洗脫所需時間就愈長。（k1’為使溶質(zhì)遷移速度Ux=0時的瞬時容量因子值）最短柱長的定義為混合溶質(zhì)中，使一對最難分離的溶質(zhì)的分離度RS=1時所需的最短柱長。生物大分子的色譜分離和純化實驗生物大分子的色譜分離和純化實驗生物大分子的色譜分離和純化實驗生物大分子的色譜分離和純化實驗生物大分子的色譜分離和純化實驗生物大分子的色譜分離和純化實驗第二節(jié)裝置和操作技術(shù)1、無論是用什么類型或者用于什么目的的色譜，其裝置均包括流動相供給、進樣、色譜柱和檢測器4大部分。2、在色譜過程中，有兩種將目標產(chǎn)品從色譜柱洗脫下來的方法，一種是維持流動相熱力學(xué)參數(shù)不變的等梯度洗脫法(如溫度、濃度和pH等參數(shù)不變）；另外一種是改變其中一種或者幾種熱力學(xué)參數(shù)的梯度洗脫法（如增大流動相中某些組分的濃度使溶質(zhì)從柱上洗脫）。生物大分子的色譜分離和純化實驗第三節(jié)色譜條件及色譜純化工藝的最優(yōu)化這是一項涉及學(xué)科面廣，與色譜和現(xiàn)代分離科學(xué)乃至基礎(chǔ)理論密切相關(guān)的一門復(fù)雜的學(xué)問。單純從每一步和色譜分離最優(yōu)化條件來講，它涉及固定相（包括種類、顆粒和孔徑大小）、流動相、柱尺寸、流速、洗脫方式、質(zhì)量回收率和活性回收率等每一種參數(shù)的最優(yōu)化選擇接著便是將這些參數(shù)綜合在一起的色譜條件最優(yōu)化研究。最后，便是將各步分離純化串在一起組成一個完整的蛋白純化工藝。有時甚至連同發(fā)酵工藝一起來進行生產(chǎn)工藝的優(yōu)化選擇。生物大分子的色譜分離和純化實驗生物大分子的色譜分離和純化實驗在色譜單元純化條件的最優(yōu)化中，首先解決的問題是要對所用色譜柱的種類進行選擇，這取決于試樣和目標產(chǎn)物的性質(zhì)。一般來說，期望目標產(chǎn)品盡可能多的保留，而雜蛋白不保留，因此需選擇目標產(chǎn)品與固定相作用力強、廉價的色譜柱。生物大分子的色譜分離和純化實驗生物大分子的色譜分離和純化實驗1、選擇填料2、填料顆粒、孔徑及柱尺寸的大小。3、流動相4、流動相組成、流速和梯度洗脫方式5、選定幾種不同色譜的最優(yōu)化條件，將這些單元進行組合以得到最佳分離和純化工藝。生物大分子的色譜分離和純化實驗成本和分離條件的選擇E=P/tE為經(jīng)濟效益；P為利潤；t為一次分離和純化所需的時間生物大分子的色譜分離和純化實驗第四節(jié)蛋白的色譜復(fù)性及同時純化作為高效分離手段之一的LC是純化蛋白質(zhì)的一種最有效方法，已成為基因重組蛋白質(zhì)純化必不可少的手段。生物大分子的色譜分離和純化實驗一、各種液相色譜的蛋白質(zhì)復(fù)性方法LC法進行蛋白質(zhì)復(fù)性的優(yōu)點是：1、進樣后可很快除去變性劑2、色譜對于蛋白質(zhì)分子的吸附，提高了復(fù)性的質(zhì)量和回收率3、復(fù)性同時達到純化目的4、便于回收變性劑，以降低廢水處理成本生物大分子的色譜分離和純化實驗1、SEC---空間排阻色譜或尺寸排阻色譜（SizeExclusionChromatography）生物大分子的色譜分離和純化實驗該法的復(fù)性機理為：在變性蛋白進入柱頂端時，因有高濃度變性劑的存在，變性蛋白質(zhì)分子有一個隨機的構(gòu)象狀態(tài)和大的動力學(xué)水和半徑，不能進入柱的空隙，蛋白質(zhì)在SEC柱上不保留。當受到復(fù)性的緩沖溶液洗脫時，因其逐步取代變性劑并使蛋白質(zhì)濃度降低，使變性蛋白質(zhì)分子處于熱力學(xué)不穩(wěn)定的高能狀態(tài)，這些蛋白質(zhì)分子就會自發(fā)地向熱力學(xué)穩(wěn)定的低能態(tài)-即蛋白質(zhì)的天然狀態(tài)轉(zhuǎn)化，從而使變性蛋白質(zhì)開始復(fù)性。生物大分子的色譜分離和純化實驗此時，局部復(fù)性的蛋白質(zhì)可以進入球的內(nèi)部，開始在液-固兩相間進行分配，隨著時間的推移，當?shù)鞍踪|(zhì)分子的結(jié)構(gòu)變得更加緊密時，蛋白質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)會逐步增加。當?shù)鞍踪|(zhì)進入柱填料的空隙后，其擴散速度緩解，從而限制了蛋白質(zhì)的聚集，這樣就減少了沉淀的產(chǎn)生。蛋白質(zhì)分子大，先從柱上洗脫下來，變性劑分子質(zhì)量小，最后流出色譜柱。生物大分子的色譜分離和純化實驗2、IEC--離子交換色譜（IonExchangeChromatography）

其復(fù)性機理與SEC不同之處在于變性的蛋白質(zhì)與固定相間有分子間的電荷作用，這種作用力可導(dǎo)致變性的蛋白吸附于固定相表面，在洗脫過程中進行吸附-解析-再吸附的復(fù)性。生物大分子的色譜分離和純化實驗3、AFC--親合色譜（AffinityChromatography）AFC是利用配體與目標蛋白間的特異性的親和作用，使變性蛋白分子保留在柱的頂端從而與變性劑分離的方式，使變性蛋白在洗脫過程中進行復(fù)性。生物大分子的色譜分離和純化實驗4、HIC--疏水作用色譜（HydrophobicInteractionChromatography）生物大分子的色譜分離和純化實驗變性蛋白質(zhì)在HIC上的復(fù)性機理為：當?shù)鞍踪|(zhì)、變性劑和雜蛋白質(zhì)進入HIC系統(tǒng)后，由于HIC固定相對變性劑的作用力較弱，而對變性蛋白質(zhì)的作用力較強，變性劑首先同變性的蛋白質(zhì)分離，并隨流動相一同流出色譜柱；生物大分子的色譜分離和純化實驗HIC固定相能提供較通常方法高出數(shù)十乃至數(shù)百倍的能量，在變性蛋白質(zhì)被HIC固定相吸附的同時瞬時除去以水和狀態(tài)附著在蛋白質(zhì)表面和與固定相表面接觸區(qū)域的水分子，而蛋白質(zhì)的特定的疏水性氨基酸殘疾與HIC固定相表面作用以形成區(qū)域立體結(jié)構(gòu)，接著形成折疊中間體。隨著流動相的不斷變化，變性蛋白質(zhì)不斷地在固定相表面上進行吸附-解吸附-再吸附，并在此過程中逐漸被復(fù)性，形成與天然蛋白質(zhì)構(gòu)象相同的蛋白質(zhì)并流出色譜柱。生物大分子的色譜分離和純化實驗二、各種色譜復(fù)性方法的比較1、SEC固定相使變性蛋白質(zhì)分子在洗脫過程中分子體積逐漸減少而進入SEC填料孔中而保留，因此蛋白質(zhì)先被洗脫。而變性劑最后流出SEC柱，因此柱的負荷受到了很大限制，而且在用流動相置換變性劑的過程中不可避免地會產(chǎn)生沉淀。此外，SEC的分離效果是LC中最差的，故用與純化蛋白質(zhì)的效果也不夠理想。生物大分子的色譜分離和純化實驗2、與SEC相比，IEC的柱負荷高，且變性蛋白質(zhì)分子可與固定相作用使變性蛋白質(zhì)在色譜填料的表面吸附，減少了由于分子間聚集產(chǎn)生沉淀的趨向，較SEC強，且分離效果也好于SEC。但在IEC上進行蛋白質(zhì)復(fù)性時，最常用的變性劑鹽酸胍也會在IEC柱上保留，這不僅會影響柱容量，而且往往與蛋白質(zhì)一起在洗脫過程中流出色譜柱，從而使最有效提取蛋白質(zhì)的變性劑鹽酸胍的使用受到限制。生物大分子的色譜分離和純化實驗3、AFC固定相，特別是使用含有分子伴侶的兩組分和多組分的AFC固定相與變性蛋白分子間有特異的親和力，使變性的蛋白質(zhì)分子間形成沉淀的可能性大大減少，能將原來認為不可見折疊的蛋白質(zhì)變成了可逆的折疊，使其成為一種強有力的研究蛋白質(zhì)折疊的手段。遺憾的是一種AFC柱只對一種或少數(shù)幾種蛋白質(zhì)有親和作用，使用范圍窄，而且試液必須現(xiàn)在分子伴侶存在的條件下稀釋100倍，然后才能AFC復(fù)性，手續(xù)繁雜，所需時間長。更重要的是柱價格昂貴。生物大分子的色譜分離和純化實驗4、HIC固定相是從高濃度鹽溶液中吸附變性蛋白質(zhì)，且與變性劑瞬時分離，不僅大大降低了蛋白分子間的聚集作用，還因固定相能在分子水平上為變性蛋白質(zhì)提供很高的能量，而是水化的變性蛋白質(zhì)瞬時失水，并形成局部結(jié)構(gòu)以利于蛋白質(zhì)分子從疏水核開始折疊。此外，梯度洗脫使各種蛋白質(zhì)分子“自己選擇”對自己有利的條件進行折疊，以達到同固定相和流動相間的協(xié)同作用，更有利于復(fù)性和純化的最優(yōu)化條件的選擇。生物大分子的色譜分離和純化實驗三、蛋白質(zhì)復(fù)性及同時純化裝置原則上講，用于上述各種液相色譜的儀器均可用于變性蛋白的復(fù)性及同時純化研究。但，由于所有這些色譜法都不能完全防止在使用流動相置換變性劑時可能產(chǎn)生變性蛋白質(zhì)分子間的聚集所形成的少許沉淀。這些沉淀積累后就會使柱壓升高甚至報廢。管型色譜