目的基因的原核誘導的具體表達及SDSPAGE凝膠電泳

目的基因的原核誘導的具體表達及SDSPAGE凝膠電泳實驗目的重點掌握表達載體構(gòu)建的原理及方法掌握目的基因原核誘導表達的原理及方法了解目的蛋白質(zhì)“標簽”純化的基本原理和方法掌握PAGE變性凝膠電泳的原理及方法掌握考馬斯亮藍染色的方法目的基因的原核誘導的具體表達及SDSPAGE凝膠電泳目的蛋白質(zhì)的誘導表達目的蛋白質(zhì)的純化目的蛋白質(zhì)的檢測實驗原理目的基因的原核誘導的具體表達及SDSPAGE凝膠電泳蛋白質(zhì)的表達：將克隆基因插入合適載體后導入宿主細胞表達大量蛋白質(zhì)的方法。體內(nèi)很難分析單個蛋白質(zhì)的作用進行大量表達和純化是為了在體外進行研究應用于蛋白純化、定位及功能分析等方面實驗原理目的基因的原核誘導的具體表達及SDSPAGE凝膠電泳圖pET14b-His-TAT-EGFP-p38-16peptides融合蛋白在Hela細胞中的熒光顯微鏡檢測（×400）例目的基因的原核誘導的具體表達及SDSPAGE凝膠電泳酵母表達系統(tǒng)昆蟲表達系統(tǒng)哺乳動物細胞表達系統(tǒng)表達的蛋白具有正常的活性、構(gòu)象技術(shù)難度較大、耗時、耗資大腸桿菌表達系統(tǒng)實驗技術(shù)簡單，時間較短，費用低，系統(tǒng)比較完備不能有效地對重組蛋白質(zhì)進行修飾加工，易形成包涵體原核細胞表達系統(tǒng)

真核細胞表達系統(tǒng)實驗原理目的基因的原核誘導的具體表達及SDSPAGE凝膠電泳原核細胞表達系統(tǒng)菌株菌株內(nèi)源的蛋白酶過多，可能會造成外源表達產(chǎn)物的不穩(wěn)定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成為理想的起始表達菌株。堪稱經(jīng)典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型，也是我們非常熟悉的表達菌株。大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌則是添加T7聚合酶基因，為T7表達系統(tǒng)而設(shè)計。實驗原理目的基因的原核誘導的具體表達及SDSPAGE凝膠電泳原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建目的基因表達載體PlasmidTaglacIqPromoterAmpr多克隆位點實驗原理目的基因的原核誘導的具體表達及SDSPAGE凝膠電泳目的基因

/DNA/PCR/酶切/Primer例：p38中抑制多肽16肽序列GGAAGAACATTGTTTCCTGGTACAGACCATATTGATCAGTTGAAGCTCF5’-ACGGATCCTAGGAAGAACATTGTTTCCTGGT-3’R5’-ACGGATCCTTAGAGCTTCAACTGATCAATATGG-3’5’端引物中AC是隨機保護堿基，GGATCC是BamHI酶切位點，TA是為防止移碼而引入的兩個堿基，隨后是編碼16肽前7個氨基酸的堿基序列。3’端引物中AC是隨機保護堿基，GGATCC是BamHI酶切位點，TAA是終止密碼子的反向互補序列，隨后是從編碼16肽堿基序列的最后一個堿基開始的反向互補序列。實驗原理目的基因的原核誘導的具體表達及SDSPAGE凝膠電泳目的基因的原核誘導的具體表達及SDSPAGE凝膠電泳表達載體能將外源基因運載到大腸桿菌細胞中;在基本骨架的基礎(chǔ)上增加表達元件，就構(gòu)成了表達載體。元件啟動子、終止子、核糖體識別序列誘導性表達所需要的元件操縱子序列調(diào)控基因多克隆位點融合Tag復制起始序列篩選標記/報告基因各種表達載體的不同之處在于其表達元件的差異。實驗原理目的基因的原核誘導的具體表達及SDSPAGE凝膠電泳啟動子的強弱是對表達量有決定性影響的因素之一。從轉(zhuǎn)錄模式上看有組成型表達和誘導調(diào)控型表達。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用的啟動子，轉(zhuǎn)錄終止子核糖體結(jié)合位點啟動子、終止子、核糖體識別序列操縱子序列及配套的調(diào)控基因誘導性表達所需要的元件多克隆位點

復制起始序列實驗原理目的基因的原核誘導的具體表達及SDSPAGE凝膠電泳用作分離的載體蛋白被稱為標簽蛋白或標簽多肽（Tag）。標簽位于表達載體的多克隆位點的N端或者C端，能夠與目的基因融合表達（N端或者C端融合表達）。目前常用的標簽有組氨酸標簽（His-Tag）谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（glutathioneStransferase）標簽（GST-Tag）硫氧還蛋白（thioredoxin,Trx）標簽麥芽糖結(jié)合蛋白（MaltoseBindingProtein,MBP）蛋白質(zhì)A（proteinA）纖維素結(jié)合位點（cellulosebindingdomain）標簽等。一般對于小分子用較大的Tag（如GST）以獲得穩(wěn)定表達；而一般的基因多選擇小Tag（如His）減少對目的蛋白的影響。實驗原理目的基因的原核誘導的具體表達及SDSPAGE凝膠電泳篩選標記/報告基因表達抗藥性基因，Amp是最常見的篩選標記，kana，新霉素，四環(huán)素，紅霉素和氯霉素?？剐曰虻倪x擇要注意是否會對研究對象產(chǎn)生干擾，比如代謝研究中要留意抗性基因編碼的酶是否和代謝物相互作用。GFP（綠色熒光蛋白）是最常用的報告基因了，半乳糖苷酶，熒光素酶。一些融合表達Tag也有報告基因的功能。實驗原理目的基因的原核誘導的具體表達及SDSPAGE凝膠電泳常用表達載體pGEX系列載體是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）融合蛋白表達系統(tǒng)的載體。PtacPromoterAmppGEX-KGpET系列的載體是His6融合蛋白的表達載體。T7KanapET-14b實驗原理目的基因的原核誘導的具體表達及SDSPAGE凝膠電泳目的基因的原核誘導的具體表達及SDSPAGE凝膠電泳目的蛋白質(zhì)的誘導表達lacIq（Lactose）lacI是大腸桿菌中l(wèi)ac操縱子（Operon）的調(diào)節(jié)基因，它所表達的阻遏蛋白是lac操縱基因（Operator）的抑制因子，抑制轉(zhuǎn)錄啟動。當有乳糖存在時，這種阻遏蛋白能與過量的乳糖結(jié)合而失去對操縱基因的抑制，使lac操縱子上的結(jié)構(gòu)基因lacZ（β-半乳糖苷酶)、lacY（透性酶)、lacA(乙?；D(zhuǎn)移酶）得以正常表達，啟動轉(zhuǎn)錄。IPTG（異丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷)作為乳糖的類似物與lacI阻遏蛋白結(jié)合而使操縱基因不被抑制，因此IPTG經(jīng)常作為lac操縱子的誘導劑而使用。實驗原理目的基因的原核誘導的具體表達及SDSPAGE凝膠電泳AmpRPlasmidpGEX-KGGSTlacIqPtacPromoterAmprIPTG多克隆位點實驗原理目的基因的原核誘導的具體表達及SDSPAGE凝膠電泳BamHINdeIBamHIcDNA酶切NdeI基因片段酶切后的目的基因

酶切

連接轉(zhuǎn)化篩選（藍白斑）鑒定（PCR、酶切、測序）原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建成功目的基因的原核誘導的具體表達及SDSPAGE凝膠電泳原核表達的誘導條件IPTG濃度：誘導時間：～3h誘導溫度：15-42℃實驗原理目的基因的原核誘導的具體表達及SDSPAGE凝膠電泳目的蛋白質(zhì)的純化破碎細胞超聲破碎溶菌酶裂解從細胞蛋白中純化出GST和His融合蛋白GST可以通過谷胱甘肽-瓊脂糖親和層析進行純化。由于GST對谷胱甘肽的親和力非常高，因此可以利用谷胱甘肽固化于瓊脂糖形成的親和層析樹脂對GST及其融合蛋白進行純化，最后通過含有游離的谷胱甘肽的緩沖液,洗脫結(jié)合的GST融合蛋白。PolyHis多聚組氨酸能與多種過渡金屬或過渡金屬鰲和物結(jié)合，因此帶HIS-6的蛋白能結(jié)合與固化的Ni2+樹脂，用適當?shù)木彌_液（PBS）洗沖洗去除其他雜蛋白后，再用可溶的競爭性鰲合劑（咪唑）洗脫可以回收靶蛋白。實驗原理目的基因的原核誘導的具體表達及SDSPAGE凝膠電泳目的基因的原核誘導的具體表達及SDSPAGE凝膠電泳目的蛋白質(zhì)的檢測蛋白質(zhì)分子量的檢測SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳目的蛋白質(zhì)的分析實驗原理目的基因的原核誘導的具體表達及SDSPAGE凝膠電泳十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）是目前用于測定蛋白質(zhì)分子量最好的方法。

SDS是一種強陰離子型去污劑，能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)分子的二級和三級結(jié)構(gòu)。在樣品和凝膠中加入SDS和還原劑后，強還原劑例如β巰基乙醇和二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂，通過加熱使蛋白質(zhì)解離。解離后的氨基酸側(cè)鏈與SDS結(jié)合形成帶負電荷的蛋白質(zhì)-SDS復合物。實驗原理目的基因的原核誘導的具體表達及SDSPAGE凝膠電泳蛋白質(zhì)中加入SDS并加熱，SDS分子上的非極性區(qū)(黃色尾巴)會與蛋白質(zhì)上的非極性區(qū)結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性，成為一線狀長條分子，上面布滿SDS分子。SDS分子的極性區(qū)(洋紅色圓點)，則露在外面，以增加親水性。SDS是一種陰離子表面活性劑，能打斷氫鍵和疏水鍵，并按一定的比例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復合物，使蛋白質(zhì)帶負電荷的量遠遠超過其本身原有的電荷，掩蓋了各種蛋白質(zhì)分子間的天然的電荷差異。SDS最終使蛋白質(zhì)變成具有高負電荷的線狀分子。目的基因的原核誘導的具體表達及SDSPAGE凝膠電泳97.0kDa目的基因的原核誘導的具體表達及SDSPAGE凝膠電泳實驗準備目的基因的原核誘導的具體表達及SDSPAGE凝膠電泳誘導、培養(yǎng)37℃恒溫搖床電泳檢測HoeferminiVEVerticalElectrophoresisSystem

儀器與設(shè)備目的基因的原核誘導的具體表達及SDSPAGE凝膠電泳LB培養(yǎng)基、Amp、IPTG30%丙烯酰胺貯液1.0MTris(PH6.8)(濃縮膠),1.5MTris(PH8.8)(分離膠)10%SDS，10%過硫酸銨（AP），四甲基乙二銨（TEMED）1XTris-甘氨酸電泳緩沖液：25mMTris,250mM甘氨酸，0.1%SDS1xSDS上樣緩沖液：50mMTris-HCl（），100mMDTT，2%SDS，10%甘油，0.1%溴酚藍染色液：90甲醇：90冰乙酸：20水＋0.5gR-250脫色液：90甲醇：90冰乙酸：20水實驗試劑目的基因的原核誘導的具體表達及SDSPAGE凝膠電泳實驗步驟目的基因的原核誘導的具體表達及SDSPAGE凝膠電泳培養(yǎng)誘導樣品制備SDS凝膠檢測實驗步驟目的基因的原核誘導的具體表達及SDSPAGE凝膠電泳1）挑取單菌落，接入3ml含氨芐青霉素（50ug/ml）的LB培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)過夜。2）取50ul過夜培養(yǎng)物接入3ml含氨芐青霉素（50ug/ml）的LB培養(yǎng)液，37℃振蕩培養(yǎng)2h以上，至對數(shù)中期（）。3）吸出500ul未經(jīng)誘導的培養(yǎng)物放在一個微量離心管中，室溫高速離心1min，沉淀懸浮于100ul1xSDS凝膠加樣緩沖液，100度加熱3min，室溫高速離心1min，冰上放置。4）在剩余培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度1mmol/L，37℃繼續(xù)培養(yǎng)3h，取500ul樣品放于微量離心管中，室溫高速離心1min。5）沉淀懸浮于100ul1xSDS凝膠加樣緩沖液，100度加熱3min，室溫高速離心1min，冰上放置，待全部樣品處理完后上樣。目的蛋白質(zhì)的誘導表達及檢測目的基因的原核誘導的具體表達及SDSPAGE凝膠電泳6）將電泳槽玻璃板洗凈，吹干，并用凡士林封邊,安裝好7）配12%分離膠，將配好的分離膠立即倒入凝膠槽內(nèi)，至凝膠槽高三分之二處，加蒸餾水密封。待膠凝固后（約需30min倒掉水，用吸水紙吸干8）配5%濃縮膠將配好的濃縮膠立即倒入凝膠槽內(nèi)（以插入梳子不溢出為宜），插入梳子9）待膠凝固后，拔出梳子，放入電泳槽中10）制備好的樣品加入上樣孔11）連接電泳儀12）打開電源，調(diào)整電壓至80V，待樣品跑過濃縮膠（大約需

30min）后將電壓調(diào)至120V，待指示劑（溴酚蘭）到達凝膠的底部距離下緣1cm時停止電泳，大約需2h，電泳結(jié)束。SDS目的基因的原核誘導的具體表達及SDSPAGE凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠配制（miniVE）12％分離膠5%濃縮膠H2O2.45ml2.05ml30%丙稀酰胺3.0ml0.5mlTris緩沖液1.9ml（1.5MpH8.8）375ul（1.0MpH6.8）10%SDS75ul30ul10%過硫酸銨75ul30ulTEMED3ul3ul注：1.丙稀酰胺為神經(jīng)毒劑，使用時