動物細胞融合和單克隆抗體

“太空婚禮”

2002年１２月３０日，

兩場籌備了10年的“太空婚禮”首次在神舟四號飛船上舉行，植物細胞“新人”—黃花煙草和革新一號煙草葉肉細胞原生質(zhì)體，動物細胞“新人”是小鼠B淋巴細胞和骨髓瘤細胞，兩批新人同時在“產(chǎn)房”—電融合儀內(nèi)孕育新生命。一段時間后，我國首批”太空娃娃”終于順利誕生。對照實驗結(jié)果表明，細胞融合率大大提高。本文檔共35頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期六\0點7分挑戰(zhàn)自我“太空婚禮”科研項目一：植物體細胞雜交技術(shù)“太空婚禮”科研項目二：

動物細胞融合技術(shù)本文檔共35頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期六\0點7分溫故而知新：哪種植物細胞工程技術(shù)可以突破不同生物之間的生殖隔離，克服遠緣雜交不親和的障礙，培育出新的作物類型？

植物體細胞雜交技術(shù)你能回憶出植物體細胞雜交的過程嗎？本文檔共35頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期六\0點7分植物細胞A植物細胞B去掉細胞壁去掉細胞壁原生質(zhì)體A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體融合雜合的原生質(zhì)體再生出細胞壁雜種細胞脫分化再分化愈傷組織胚狀體/雜種植株溫故知新:植物體細胞雜交過程本文檔共35頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期六\0點7分動物細胞融合本文檔共35頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期六\0點7分

課前思考1、什么叫動物細胞融合？植物體細胞雜交技術(shù)與動物細胞融合有什么不同呢？2、動、植物細胞在結(jié)構(gòu)上有何區(qū)別？這與它們雜交或融合過程有什么影響？3、動物細胞融合與植物原生質(zhì)體融合的基本原理是否相同？兩者的融合過程是否也一樣？4、植物體細胞雜交誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合常用的方法有哪些？那動物細胞融合呢？本文檔共35頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期六\0點7分動物細胞融合和單克隆抗體細胞融合是正常的生命活動正在融合的兩個細胞受精作用本文檔共35頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期六\0點7分一、動物細胞融合1.概念：兩個或多個動物細胞結(jié)合形成一個細胞的過程2.原理：細胞膜的流動性本文檔共35頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期六\0點7分誘導(dǎo)方式物理法化學(xué)法生物法：滅活的病毒仙臺病毒紫外線喪失感染性（不感染細胞）保留融合活性（誘導(dǎo)細胞融合）3、誘導(dǎo)方法滅活：指用物理或化學(xué)手段使病毒失去感染能力，但是并不破壞這些病原體的抗原結(jié)構(gòu)本文檔共35頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期六\0點7分4.過程：融合有絲分裂雜交細胞含不同DNA的兩個細胞本文檔共35頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期六\0點7分過程詳解滅活的病毒誘導(dǎo)細胞融合的原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細胞互相凝聚，細胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細胞膜打開，細胞發(fā)生融合。本文檔共35頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期六\0點7分5、動物細胞融合技術(shù)的意義和應(yīng)用本文檔共35頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期六\0點7分思考題①.植物體細胞雜交時首先應(yīng)用什么方法去掉細胞壁？酶解法，如纖維素酶,果膠酶②.動物細胞融合時需要進行去壁處理嗎？為什么？無需，因為動物細胞無細胞壁

③.植物體細胞雜交誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合常用的方法有哪些？離心、電激等物理方法；PEG等化學(xué)方法

④.動物細胞融合能利用上述兩類方法嗎？還有其他方法嗎？能還可以利用滅活的病毒進行誘導(dǎo)

⑤.植物體細胞雜交應(yīng)先進行原生質(zhì)體的融合再進行組織培養(yǎng)形成完整的雜種個體，動物細胞融合后能形成雜種動物個體嗎？不能本文檔共35頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期六\0點7分細胞融合與誘導(dǎo)細胞融合物質(zhì)：誘導(dǎo)劑：仙臺病毒、聚乙二醇

誘導(dǎo)細胞融合的病毒必須滅活。

思考討論：為什么細胞融合過程中使用的病毒需要滅活？不滅活行嗎？因為不滅活的病毒會感染細胞，而不能誘導(dǎo)細胞融合。本文檔共35頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期六\0點7分植物體細胞雜交和動物細胞融合的比較比較項目植物體細胞雜交動物細胞融合過程原理細胞融合的過程誘導(dǎo)方法用途細胞膜的流動性、細胞的全能性細胞膜的流動性去除細胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合使細胞分散后誘導(dǎo)細胞融合物理、化學(xué)方法物理、化學(xué)、生物方法獲得雜種植株制備單克隆抗體細胞融合，植物組織培養(yǎng)細胞融合本文檔共35頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期六\0點7分單克隆抗體溫故知新本文檔共35頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期六\0點7分提問？#抗體是由何種細胞產(chǎn)生的？效應(yīng)B細胞（漿細胞）。#一個Ｂ淋巴細胞(漿細胞)能分泌多種抗體嗎？

每一個Ｂ淋巴細胞只分泌一種特異性抗體?？贵w的化學(xué)本質(zhì)是免疫球蛋白。B淋巴細胞與抗體的關(guān)系：

１．B淋巴細胞受抗原刺激后，可以產(chǎn)生抗體。２．每一個淋巴細胞只能產(chǎn)生一種抗體。３．動物體內(nèi)的B淋巴細胞可以產(chǎn)生百萬種以上的抗體，每種抗體對特定的抗原具有特異性免疫作用。4.抗體主要分布于動物血清中，在外分泌液中有少量抗體。本文檔共35頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期六\0點7分一、生產(chǎn)抗體的傳統(tǒng)方法效應(yīng)B細胞多種抗原動物體內(nèi)刺激抗體抗原不純抗體不純篩選單一效應(yīng)B細胞效應(yīng)B細胞不能大量增殖產(chǎn)生大量抗體本文檔共35頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期六\0點7分

所以傳統(tǒng)的抗體的生產(chǎn)方法及缺陷是什么？怎樣解決這個問題？特異性差、純度低；產(chǎn)量低、反應(yīng)不夠靈敏本文檔共35頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期六\0點7分二、單克隆抗體1.概念：

由單個B淋巴細胞經(jīng)過克隆形成的基因型相同的細胞群，這一細胞群所產(chǎn)生的化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強的抗體稱為單克隆抗體特異性強、靈敏度高化學(xué)性質(zhì)單一2.特點：本文檔共35頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期六\0點7分3、生產(chǎn)單克隆抗體所用細胞及其特點本文檔共35頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期六\0點7分接受抗原刺激后，能分泌針對該抗原的特異性抗體，在體液免疫中具有重要功能。B淋巴細胞本身是一種終末分化細胞，通常不再進行細胞分裂，存活一段時間后便會死亡——短命細胞B淋巴細胞所以B淋巴細胞在體外培養(yǎng)時不能無限增殖，而癌細胞是可以無限增殖的。本文檔共35頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期六\0點7分骨髓瘤細胞:惡性增殖的轉(zhuǎn)化細胞，只要營養(yǎng)條件適合可永遠分裂和存活——長命細胞。經(jīng)篩選與馴化，現(xiàn)已建立多種骨髓瘤細胞株——沒有抗體分泌物。因此可以利用小鼠骨髓瘤細胞與之融合，就可獲得既能無限增殖又能產(chǎn)生單一抗體的細胞。本文檔共35頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期六\0點7分如何大量生產(chǎn)單克隆抗體？利用淋巴細胞產(chǎn)生抗體的功能利用腫瘤細胞無限增殖的特性利用細胞融合的技術(shù)將兩種細胞融合獲得具有淋巴細胞和腫瘤細胞特性的雜交瘤細胞利用動物細胞培養(yǎng)技術(shù)大量培養(yǎng)雜交瘤細胞如何篩選？融合方式？本文檔共35頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期六\0點7分設(shè)計方案：一個效應(yīng)B淋巴細胞－－只分泌一種特異性抗體小鼠骨髓瘤細胞－－能無限增殖雜種細胞本文檔共35頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期六\0點7分

4.單克隆抗體制備過程

注射抗原B淋巴細胞骨髓瘤細胞細胞融合、篩選雜交瘤細胞細胞培養(yǎng)篩選，繼續(xù)培養(yǎng)足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細胞群體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔單克隆抗體本文檔共35頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期六\0點7分HAT培養(yǎng)基（屬于選擇性培養(yǎng)基，含有次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)）中進行選擇性培養(yǎng)，由于氨基蝶呤可阻礙DNA正常合成途徑，所以培養(yǎng)基中含有它時，細胞只能通過補救途徑合成DNA。未融合的骨髓瘤細胞合成DNA的主要途徑被培養(yǎng)基中的氨基蝶呤阻斷，又因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT），不能利用培養(yǎng)基中的次黃嘌呤完成DNA的合成過程而死亡。未融合的脾細胞因不能在體外長期存活而死亡；只有融合的雜交瘤細胞由于從脾細胞獲得了次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，因此能在HAT培養(yǎng)基中存本文檔共35頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期六\0點7分單克隆抗體大量制備過程（雜交瘤技術(shù)）過程：本文檔共35頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期六\0點7分

①利用淋巴細胞產(chǎn)生單一抗體特性②利用腫瘤細胞無限增殖的特性③利用細胞融合的技術(shù)將兩種細胞融合獲得具有淋巴細胞和腫瘤細胞特性的雜交瘤細胞④利用動物細胞培養(yǎng)技術(shù)大量培養(yǎng)雜交瘤細胞思考5、單克隆抗體生產(chǎn)利用了哪些原理和技術(shù)？原理技術(shù)本文檔共35頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期六\0點7分1、為什么選用小鼠骨髓瘤細胞與B細胞融合？這樣融合成的雜交瘤細胞，繼承了雙親細胞的遺傳物質(zhì)，不僅具有B細胞分泌抗體的能力，而且還有無限增殖的本領(lǐng)，因而可以獲得大量單克隆抗體本文檔共35頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期六\0點7分2、整個制備過程為何要經(jīng)過兩次篩選?（第一次篩選得到雜交瘤細胞（多種），“第二次”需先在多孔培養(yǎng)板上，在每孔只有一個雜交瘤細胞的情況下開始培養(yǎng)，然后再篩選出能產(chǎn)生特異性抗體的細胞群。由于該細胞群是單個雜交瘤細胞克隆得來的，所以產(chǎn)生的抗體必然是化學(xué)性質(zhì)單一的，特異性強的單克隆抗體。這里的單克隆確有單個細胞克隆的含義，只不過克隆的不是B淋巴細胞，而是雜交瘤細胞。）

本文檔共35頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期六\0點7分6.單克隆抗體的應(yīng)用①、作為診斷試劑——單克隆抗體最廣泛的用途②、用于治療疾病和運載藥物目前世界各國已經(jīng)研制出數(shù)以百計的單克隆抗體。許多缺乏良好診斷手段的傳染病、免疫性疾病、血液病、內(nèi)分泌疾病和遺傳病，用單克隆抗體作為診斷手段，是一個必然趨勢作為載體，運載抗癌藥物，形成“生物導(dǎo)彈”治療腫瘤本文檔共35頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期六\0點7分小結(jié)兩個過程動物細胞培養(yǎng)過程單克隆抗體制備過程三個“一”一個誘導(dǎo)細胞融合的新方法－－滅活病毒一個新細胞－－雜交瘤細胞一個優(yōu)勢－－單克隆抗體特異性強、靈敏度高的優(yōu)勢本文檔共35頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期六\0點7分1、科學(xué)家用小鼠骨髓瘤細胞與某種細胞融合，得到雜交細胞，經(jīng)培養(yǎng)可產(chǎn)生大量的單克隆抗體，與骨髓瘤細胞融合的是（）