Fmoc固相合成法合成黑色素細(xì)胞刺激素(MSH)的工藝研究

Fmoc固相合成法合成黑色素細(xì)胞刺激素（MSH）的工藝研究【摘要】目的：研究9芴甲氧羰基固相合成法合成黑色素細(xì)胞刺激素(MSH)工藝的步驟及其影響因素.方法：采用Fmoc保護(hù)α氨基，以TBTU/HOBT/DIEA為縮合劑合成MSH.用色譜儀和質(zhì)譜儀對(duì)合成的多肽進(jìn)行純化、鑒定.結(jié)果：多肽合成的得率可達(dá)63%，經(jīng)反相高效液相色譜儀對(duì)合成的多肽進(jìn)行純化后可得純度為%的目標(biāo)肽.通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行質(zhì)譜儀檢測(cè)所合成多肽的分子質(zhì)量為ku，與其理論分子質(zhì)量ku相符.結(jié)論：該合成法具有快捷、簡(jiǎn)便、高效地合成多肽MSH的特點(diǎn)，適合大批量生產(chǎn).

【關(guān)鍵詞】固相合成；肽類(lèi)；MSH；芴甲氧羰基

0引言

多肽作為生物體內(nèi)的重要組成部分之一，在體內(nèi)各臟器中有許多復(fù)雜而特殊的生理活性［1］.黑色素細(xì)胞刺激素(MSH)是由13個(gè)氨基酸組成的一種內(nèi)源性的神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)肽，可抑制發(fā)熱與主要類(lèi)型的實(shí)驗(yàn)性炎癥.固相法作為多肽合成領(lǐng)域的一個(gè)重大突破在合成多肽MSH中具有快速、簡(jiǎn)便、高效等優(yōu)點(diǎn)［2］，但需要對(duì)不參與反應(yīng)的氨基加以保護(hù)，同時(shí)氨基酸的側(cè)鏈上的活性基團(tuán)也要給予保護(hù).保護(hù)基的選擇既要保證側(cè)鏈基團(tuán)不參與反應(yīng)，又要保證在肽鏈合成過(guò)程中不受破壞，同時(shí)還要保證在最后肽鏈裂解時(shí)能被除去［3］.國(guó)內(nèi)外經(jīng)常采用叔甲氧基保護(hù)α氨基，卻難以合成對(duì)酸不穩(wěn)定的多肽.由于本次合成的多肽MSH中含有色氨酸，對(duì)酸不穩(wěn)定.我們旨在采用9芴甲氧羰基基團(tuán)保護(hù)α氨基以合成MSH.

1材料和方法1材料RPHPLC型高效液相色譜儀(Beckman公司);基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行質(zhì)譜儀；臺(tái)式離心機(jī)；臺(tái)式凍干機(jī)；Fmoc保護(hù)的氨基酸；1羥基苯并三氮唑，1氧3雙二甲胺羰基苯駢三氮唑四氟化硼鹽；二異丙基乙胺，三氟乙酸；乙腈；NN二甲基甲酰胺，二氯甲烷，異丙醇，F(xiàn)mocRinkAmideMBHAResin［吉爾生化有限公司］.

方法樹(shù)脂的選擇根據(jù)導(dǎo)入反應(yīng)基團(tuán)的不同，可以把樹(shù)脂分為氯甲基樹(shù)脂、羧基樹(shù)脂、氨基樹(shù)脂或烯肼型樹(shù)脂等［4］.本次Fmoc固相合成的MSH的末端需要酰氨化,故需要選用一種Rink氨基樹(shù)脂即RinkAmideMBHAResin，在RinkAmideMBHAResin中加入縮合劑TBTU/HOBT/DIEA使MSH的Val與樹(shù)脂之間形成酰胺鍵，以此來(lái)完成氨基酸的固定.

與FmocRinkAmideMBHAResin的連接根據(jù)合成多肽的序列，將RinkAmideMBHAResin置于已用DCM浸泡過(guò)的反應(yīng)器中，加入DMF浸泡30min左右，使其充分膨脹，然后用含200mL/L哌啶的DMF溶液脫除樹(shù)脂上的Fmoc基團(tuán)，再用異丙醇洗滌樹(shù)脂2次，最后用DMF洗滌樹(shù)脂3次，當(dāng)用50g/L茚三酮檢測(cè)呈陽(yáng)性時(shí)將FmocValOH，TBTU，HOBT,DIEA及DMF配成的反應(yīng)液加入到樹(shù)脂中，室溫下反應(yīng)h，當(dāng)用茚三酮檢驗(yàn)呈陰性時(shí)再用異丙醇、DMF溶液各洗滌2次.即完成第1個(gè)氨基酸與樹(shù)脂的連接.

接肽反應(yīng)選用的接肽反應(yīng)縮合劑為具有縮合效率高、反應(yīng)速度快、不易發(fā)生消旋化反應(yīng)的TBTU/HOBT/DIEA的混合液［5］,反應(yīng)時(shí)間約為h，每次反應(yīng)后取少量樹(shù)脂用茚三酮法檢測(cè)，若呈陽(yáng)性說(shuō)明反應(yīng)不完全，繼續(xù)加入縮合劑，使其充分反應(yīng).若呈陰性說(shuō)明反應(yīng)完全，用含200mL/L哌啶的DMF溶液脫除新接入氨基酸的Fmoc基團(tuán)以便于下一個(gè)氨基酸的羧基反應(yīng).重復(fù)此過(guò)程至MSH中所有氨基酸全部接入.

－樹(shù)脂的切割MSH合成完畢后，用N2吹干MSH樹(shù)脂，將其置于反應(yīng)器中，加入切割試劑，室溫下磁力攪拌反應(yīng)3h左右，使MSH與樹(shù)脂分離，再經(jīng)砂芯過(guò)濾，將濾液加入冰乙醚中析出多肽，最后經(jīng)離心分離獲得MSH粗品.

的純化和質(zhì)譜鑒定多肽合成過(guò)程中的各種副反應(yīng)、消旋化以及脫保護(hù)的過(guò)程中由于保護(hù)基的殘留、肽鍵的斷裂、烷基化等原因會(huì)造成產(chǎn)品不純.根據(jù)目的肽的要求可采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行純化.我們選用的是具有快速、高效和較高回收率等特點(diǎn)的RPHPLC進(jìn)行純化［6］，采用MALDIMS鑒定所得產(chǎn)品.

2結(jié)果

а氨基保護(hù)基團(tuán)的選擇及其脫除繪制Fmoc基團(tuán)的脫除效果與哌啶的含量及其脫除時(shí)間關(guān)系曲線，可以看出隨著哌啶含量的增加，脫除反應(yīng)速度在加快，本次合成選用含200mL/L哌啶的DMF溶液反應(yīng)25min，脫除率在99%以上，可以很好的脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán).

圖19芴甲氧羰基的脫除率與哌啶含量及脫除時(shí)間的關(guān)系

粗品的分析圖色譜圖中峰數(shù)較多，利用色譜工作站軟件可知，合成的多肽粗品中，主峰物質(zhì)占68%.

PRHPLC色譜條件：mm×25cm(c18,反相)；流動(dòng)相中A液:1mL/L三氟乙酸的純水溶液，B液:1mL/L三氟乙酸的乙腈溶液；梯度洗脫方式:900mL/LA液+100mL/LB液在30min內(nèi)降為100mL/LA液+900mL/LB液，流速:1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng):215nm.

圖2MSH粗品的色譜圖

粗品的質(zhì)譜檢測(cè)MSH粗品的質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，質(zhì)譜圖中主峰顯示的分子質(zhì)量為ku，與MSH的理論分子質(zhì)量ku接近，說(shuō)明MSH粗品中含有MSH(圖3).

圖3MSH粗品的質(zhì)譜圖

的純化及純化后的色譜分析在RPHPLC純化過(guò)程中選用的離子對(duì)為三氟乙酸.從多肽MSH純化后的色譜分析結(jié)果可以看出，主峰面積較大，其他峰面積與主峰相比較小，表明合成的粗品經(jīng)RPHPLC純化后可能會(huì)得到較純的MSH.

純化后的質(zhì)譜鑒定MALDIMS分析的結(jié)果顯示，實(shí)際合成的多肽分子質(zhì)量為ku，與MSH的理論分子質(zhì)量ku相差無(wú)幾.同時(shí)也可以看出，圖中峰數(shù)很少，而且主峰明顯，說(shuō)明本次合成的MSH經(jīng)色譜儀純化后，可以除去大部分的雜質(zhì)，從而得到較純的MSH.

PRHPLC色譜條件：mm×25cm(c18,反相)；流動(dòng)相中A液:1mL/L三氟乙酸的純水溶液，B液:1mL/L三氟乙酸的乙腈溶液；梯度洗脫方式:900mL/LA液+100mL/LB液，在30min內(nèi)降為100mL/LA液+900mL/LB液；流速:1mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):215nm.

圖4MSH純化后的色譜圖

圖5MSH純化后的質(zhì)譜圖

3討論

用于合成多肽的樹(shù)脂具有多種類(lèi)型，實(shí)際合成中要根據(jù)合成多肽的特點(diǎn)，選擇合適的樹(shù)脂作為載體,由于MSH的末端需要酰氨化,所以選用RinkAmideMB

HAResin,這種樹(shù)脂具有穩(wěn)定的理化性質(zhì)、足夠多的反應(yīng)位點(diǎn)及副反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，可以提高產(chǎn)物得率，降低純化成本.

固相合成通常采用Boc和Fmoc兩種策略對(duì)α氨基加以保護(hù)［7］,與Boc法相比，F(xiàn)moc法更適合合成對(duì)酸不穩(wěn)定的多肽,而且具有反應(yīng)條件溫和、副反應(yīng)少、可以大量合成等優(yōu)點(diǎn).由于本次合成的多肽MSH，其中含有的色氨酸對(duì)酸不穩(wěn)定，所以要選擇Fmoc基團(tuán)對(duì)α氨基進(jìn)行保護(hù).

DCC是多肽合成中常用的一種縮合試劑，但它往往會(huì)伴隨一些副反應(yīng)，這樣會(huì)降低產(chǎn)物得率，提高純化成本.TBTU/HOBT/DIEA作為新型的復(fù)合型縮合試劑，是減少在肽鏈延伸過(guò)程中這些副反應(yīng)產(chǎn)生的有效方法，同時(shí)也具有反應(yīng)快速，縮合條件溫和以及產(chǎn)物易于純化等特點(diǎn)，所以可以達(dá)到提高產(chǎn)物得率，降低純化費(fèi)用的目的，便于多肽MSH的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)［8］.

合成多肽MSH時(shí)，在每一步反應(yīng)完成后，下一個(gè)氨基酸接入之前，需要脫除Fmoc基團(tuán)，通常采用哌啶的DMF溶液，其脫除效果與哌啶含量有關(guān)，200mL/L哌啶的DMF溶液與100mL/L哌啶的DMF溶液相比，脫除時(shí)間較短，脫除效果卻更好，但當(dāng)哌啶含量過(guò)大時(shí)，就會(huì)因反應(yīng)過(guò)于劇烈而出現(xiàn)副反應(yīng)，這樣不利于脫除后的洗滌.所以我們采用的是200mL/L的DMF溶液.

Fmoc固相法合成多肽MSH，首先采用RPHPLC對(duì)粗品進(jìn)行分析，確定粗品分析圖中主峰物質(zhì)的含量并將其作為樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析，再采用RPHPLC對(duì)其進(jìn)行純化，可以得到%的高純度產(chǎn)物，最后經(jīng)MALDIMS鑒定，主峰顯示的分子質(zhì)量為ku，與MSH的理論分子質(zhì)量ku接近.由于采用Fmoc基團(tuán)保護(hù)а氨基，選用TBTU/HOBT/DIEA作為縮合劑，可以有效的提高M(jìn)SH的合成效率.因此，采用本合成工藝合成多肽MSH具有反應(yīng)條件溫和，縮合效率高以及合成成本低的特點(diǎn)，適合于大規(guī)模生產(chǎn).

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