現(xiàn)代分子診斷技術(shù)2

利用核酸雙鏈的堿基互補(bǔ)、變性和復(fù)性的原理，可以用已知堿基序列的單鏈核酸片段作為探針，與待測樣本中的單鏈核酸互補(bǔ)配對，以判斷有無互補(bǔ)的同源核酸序列的存在

核酸探針

是指帶有標(biāo)記的某一特定DNA或RNA片斷，能與待測樣本中單鏈核酸分子互補(bǔ)配對結(jié)合，進(jìn)而檢測同源序列

探針標(biāo)記物有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、熒光素等）兩大類本文檔共30頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期三\12點35分分離雜交探針的方法：提取某一病原微生物株系的染色體DNA限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶解得到的酶解片段克隆進(jìn)一質(zhì)粒載體，構(gòu)建質(zhì)粒文庫文庫中重組質(zhì)粒的插入片段即可用來分別同病原性微生物和非病原性微生物的核DNA進(jìn)行雜交、篩選本文檔共30頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期三\12點35分核酸雜交的靈敏度和可靠性極高用探針直接同糞便樣品、尿樣、血樣、喉洗液和組織樣品中的目標(biāo)DNA進(jìn)行雜交，且無需預(yù)先純化DNA若樣品中的目標(biāo)分子非常少，則需通過PCR將目的序列擴(kuò)增，再進(jìn)行雜交檢測

從理論上講，用DNA雜交來診斷疾病可用于對所有的致病微生物的檢測本文檔共30頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期三\12點35分4、非同位素標(biāo)記探針32P的缺點：⑴半衰期短，僅13天⑵操作起來比較危險⑶必須要有特殊的實驗室設(shè)備進(jìn)行操作⑷放射性垃圾的處理繁瑣本文檔共30頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期三\12點35分非放射性雜交檢測系統(tǒng)：通過酶促反應(yīng)將某種底物轉(zhuǎn)變成生色物質(zhì)或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)而達(dá)到放大信號的目的采用將生物素（biotin）標(biāo)記的核苷酸摻入DNA的方法制備探針生物素標(biāo)記的DNA在室溫下至少可保存一年檢測發(fā)光和顏色變化可在幾小時內(nèi)完成本文檔共30頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期三\12點35分BBBBAPBBAP生物素加入鏈霉素抗生物蛋白加入生物素標(biāo)記的堿性磷酸酶探針目的DNA加入不同的生色或化學(xué)發(fā)光底物本文檔共30頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期三\12點35分熒光標(biāo)記的引物直接進(jìn)行PCR檢測DNA引物1引物2熒光染料PCR層析熒光檢測游離引物本文檔共30頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期三\12點35分分子夾心探針檢測發(fā)出熒光分子夾心探針(沒有熒光)熒光團(tuán)猝滅劑目的DNA與目的DNA雜交本文檔共30頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期三\12點35分TaqMan探針技術(shù)原理：利用Taq酶的3′5′外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號，由于探針與模板特異性結(jié)合，熒光的強(qiáng)弱就代表了模板的數(shù)量本文檔共30頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期三\12點35分3′5′5′3′QR上游引物下游引物5

′3′3′5

′QRTaqMan探針的熒光信號產(chǎn)生機(jī)制本文檔共30頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期三\12點35分瘧疾的分子診斷：檢測是否存在瘧原蟲抽取血樣進(jìn)行鏡檢免疫診斷:ELISA檢測瘧原蟲蛋白或抗體

無法區(qū)分是以前感染還是現(xiàn)在感染DNA雜交診斷例一：本文檔共30頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期三\12點35分DNA的雜交探針是一段瘧原蟲的高度重復(fù)的DNA序列具體的分離過程：構(gòu)建一個瘧原蟲的核基因文庫用標(biāo)記的瘧原蟲核DNA作探針去篩選核基因文庫選出那些雜交信號最強(qiáng)的克隆用這些選出來的片段作探針，與瘧原蟲及其同屬中不導(dǎo)致瘧疾的種的核基因作雜交，以檢查該片段作為DNA探針的可靠性本文檔共30頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期三\12點35分錐蟲的檢測

錐蟲在人體中可侵入肝、脾、淋巴結(jié)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在其中大量繁殖并殺死寄主細(xì)胞顯微鏡檢新鮮血液取新鮮血液感染未攜帶錐蟲的寄生蟲,30-40天后殺死昆蟲,鏡檢昆蟲的腸道免疫檢測:假陽性高例二：本文檔共30頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期三\12點35分PCR檢測針對錐蟲特有的一段188bp的DNA序列設(shè)計引物，特異地從錐蟲基因組中擴(kuò)增得到188bp的條帶本文檔共30頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期三\12點35分二、細(xì)菌性傳染病及病毒性疾病的分子診斷技術(shù)抗生素的不合理使用DNA雜交PCR檢測噬菌體介導(dǎo)本文檔共30頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期三\12點35分DNA雜交設(shè)計16SrRNA為探針16SrRNA在細(xì)菌中拷貝數(shù)極高，高度的保守性特異性不是很好必須結(jié)合PCR技術(shù)本文檔共30頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期三\12點35分PCR檢測nestedPCR針對目的病原菌的不同保守區(qū)段設(shè)計多對引物每對引物都能特異的擴(kuò)增出一段目的片段，病原菌存在的可能性大大增加本文檔共30頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期三\12點35分模板使用外引物，進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增使用內(nèi)引物，進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物巢式PCR原理示意圖本文檔共30頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期三\12點35分PCR技術(shù)也會產(chǎn)生假陽性新擴(kuò)增的目的DNA特異性不強(qiáng)退火溫度過低模板中雜質(zhì)的污染假陰性存在Taq酶的抑制劑模板量過少模板DNA純度不夠本文檔共30頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期三\12點35分原位PCR(insituPCR,ISPCR)在細(xì)胞或細(xì)胞切片上對待測的低拷貝數(shù)基因進(jìn)行擴(kuò)增，并通過原位雜交進(jìn)行檢測不僅能檢測出病原微生物的存在，且能夠在組織細(xì)胞中定位本文檔共30頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期三\12點35分原位雜交（nucleicacidhybridizationinsitu）

將標(biāo)記探針與細(xì)胞或組織切片中的核酸進(jìn)行雜交，進(jìn)而檢測特異的DNA或RNA序列

細(xì)胞原位雜交

組織切片原位雜交

DNA-DNARNA-DNA

三類雜交

RNA-RNA

該法優(yōu)點：不需提取核酸，故可完整保持組織或細(xì)胞的形態(tài)，因而更能準(zhǔn)確地反映組織細(xì)胞的功能狀態(tài)有本文檔共30頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期三\12點35分噬菌體介導(dǎo)細(xì)菌檢測將熒光素酶基因引入到噬菌體的基因組，然后用轉(zhuǎn)基因噬菌體去侵染待測樣品噬菌體侵染該宿主菌，大量合成包括熒光素酶在內(nèi)的由噬菌體基因編碼的蛋白，向體系中加入熒光素和ATP，就會有熒光產(chǎn)生結(jié)核菌的檢測抗藥性菌株的檢測本文檔共30頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期三\12點35分熒光素酶熒光素＋ATP熒光利用宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、翻譯噬菌體基因熒光素酶基因宿主細(xì)菌噬菌體介導(dǎo)的細(xì)菌檢測本文檔共30頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期三\12點35分第三節(jié)DNA指紋每個人體細(xì)胞內(nèi)都含有23對染色體，每條染色體中部含有一個DNA分子，DNA分子中的核苷酸序列包含著遺傳信息，在DNA分子中存在三種類型：單拷貝序列、中等程度重復(fù)序列、高度重復(fù)序本文檔共30頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期三\12點35分每個重復(fù)序列在300個核苷酸長度之內(nèi)，由于高度重復(fù)，序列經(jīng)過超離心后以衛(wèi)星帶出現(xiàn)在主要DNA帶的附近，所以也稱衛(wèi)星DNA，其中的重復(fù)序列單元則稱為“小衛(wèi)星DNA”“小衛(wèi)星”具有高度的可變性，但在“小衛(wèi)星DNA“中有一小段序列則在所有個體中都一樣，稱為“核心序列”。如果把核心序列串聯(lián)起來作為分子探針與不同個體的DNA進(jìn)行分子雜交，就會出現(xiàn)各自特有的雜交圖譜。它們與人的指紋一樣具有專一性和特異性，因此稱作“DNA指紋”通過對人類基因組的解析，發(fā)現(xiàn)人與人之間99．99％的堿基序列都相同，而剩下的0.01%的堿基特征序列則來自于雙親，據(jù)此可用于“親子鑒定”本文檔共30頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期三\12點35分所羅門的審判：

大家都聽說過所羅門的審判這樣一件故事：兩位婦人都聲稱自己是孩子的母親，于是所羅門就命令一名侍衛(wèi)把那個孩子帶來，要用劍將其辟成兩半分給他們兩，結(jié)果假母親同意所羅門的判決，而孩子真正的母親卻懇求侍衛(wèi)饒了孩子的性命，她解釋說：“把孩子給了假母親，總比讓孩子慘死好?！碑?dāng)然，真假母親也就水落石出了。本文檔共30頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期三\12點35分滴骨驗親法：

以生者的血滴在尸骨上，觀察血能否浸入骨內(nèi)，浸入的則被認(rèn)為兩者有血緣關(guān)系，在各種古籍中有多種記錄。三國時代（公園220—280年）謝承著《會稽先賢傳》中的《以弟血滴兄骨》可能是記錄此法的最早的史料：陳業(yè)的哥哥因海難不幸殞命，當(dāng)時一同遇難的有五六十人，并且尸體都已嚴(yán)重腐敗而無法辨認(rèn)死者的身份。陳業(yè)就用刀刺破自己的手臂將血分別滴在尸骨上，發(fā)現(xiàn)其血液只能浸入一具尸骨，其余皆不能。陳業(yè)就這樣確認(rèn)其兄的尸骨。本文檔共30頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期三\12點35分合血法：

等到了明代，更是采用了“合血法”來識別親權(quán)。明末清初的檢驗書籍中都有相同的記載：“親子兄弟或自幼分離，欲相認(rèn)識。難辨真?zhèn)巍Ｃ鞔坛鲅?，滴一器?nèi)，真則共凝為一，否則不凝也。