胡忠義-結(jié)核病耐藥性快速檢測 技術研究進展

結(jié)核病耐藥性快速檢測技術研究進展

胡忠義

同濟大學附屬上海市肺科醫(yī)院上海市結(jié)核病(肺)重點實驗室

當前藥敏檢測存在的問題：

固體培養(yǎng)法：需時久、準確性差液體培養(yǎng)法：結(jié)果觀察費用高、需1～2周快速培養(yǎng)儀：需昂貴的儀器試劑，費用高分子藥敏：檢出率不高，處于研究階段

1.細胞培養(yǎng)板藥敏試驗

2.微孔板MIC藥敏試驗標本直接藥敏MIC測定同步檢測多種藥敏微孔板液體培養(yǎng)基藥敏優(yōu)點操作簡單，藥敏結(jié)果豐富一次完成九個抗結(jié)核藥物的MIC判讀快速，成本低全程只需1周，比快速儀器藥敏提早報告1周3.雙相羅氏培養(yǎng)基藥敏試驗在羅氏培養(yǎng)基中加入液體培養(yǎng)基，制成同時含有固體和液體培養(yǎng)基的雙相羅氏培養(yǎng)基。在雙項羅氏培養(yǎng)基的液體培養(yǎng)基中加入某種抗結(jié)核藥物，制成雙相羅氏藥敏培養(yǎng)基。

雙相羅氏藥敏培養(yǎng)基特點可縮短藥敏時間藥敏結(jié)果準確性好可觀察菌落特征進行初步鑒定204株MTB臨床分離株雙相羅氏藥敏培養(yǎng)基檢測結(jié)果常規(guī)羅氏藥敏結(jié)果藥物雙相羅氏藥敏結(jié)果敏感株耐藥株敏感性=124/127=97.6%鏈霉素敏感株12713特異性=61/74=82.4%耐藥株361符合率=188/204=92.2%敏感株耐藥株敏感性=108/114=94.7%異煙肼敏感株1086特異性=84/90=93.3%耐藥株684符合率=192/204=94.1%敏感株耐藥株敏感性=112/120=93.3%利福平敏感株1126特異性=78/84=92.5% 耐藥株878符合率=190/204=93.1%敏感株耐藥株敏感性=127/143=88.8%乙胺丁醇敏感株1274特異性=57/61=93.4%耐藥株1657符合率=184/204=90.2%

藥敏時間比較

雙相羅氏藥敏培養(yǎng)基的藥敏時間為7～14天，常規(guī)羅氏藥敏培養(yǎng)基的藥敏時間為21～28天，前者報告時間提早14～16天。

方法評價簡便、快速，準確比常規(guī)法藥敏結(jié)果提早2－3周不需特殊儀器設備不能觀察菌落特征結(jié)果判斷帶有主觀性退色，影響結(jié)果判斷優(yōu)點缺點

該法1997建立，并用于結(jié)核分枝桿菌耐藥性測定。近年來進展很快。近來用于診斷研究報道不少。4.噬菌體法藥敏試驗

臨床標本耐多藥性檢測對230份肺結(jié)核患者痰標本直接進行利福平、異煙肼、鏈霉素和乙胺丁醇的耐藥性快速測定，并與培養(yǎng)陽性后的菌株耐藥性測定結(jié)果進行比較。結(jié)果共有161株菌株進行了二種方法的耐藥性測定結(jié)果比較。

痰標本直接藥敏試驗結(jié)果檢測利福平敏感性90.9%

特異性90.6％陽性預測值71.4％陰性預測值97.5％準確性90.7％

方法評價簡便：快速：２-３天安全：結(jié)果將耐藥菌裂解價廉：不需特殊儀器

5.顯微鏡觀察藥敏試驗(MODS)

（Microscopicobservationdrugsusceptibility）依據(jù)MTB在液體培養(yǎng)基中生長時形成索狀結(jié)構(gòu)，采用倒置顯微鏡觀察索狀結(jié)構(gòu)可用于MTB的快速診斷。

MODS檢測優(yōu)點

高敏感性：檢測痰標本敏感性達97.8%?？焖佟⒑啽悖?天可獲得診斷和藥敏結(jié)果。費用低：無需昂貴儀器設備。MODS培養(yǎng)和直接藥敏試驗rifampicinisoniazidstreptomycinsample1ethambutolsample2DrugfreeHighLow

我們的結(jié)果

對66株MTB臨床分離株進行耐藥性檢測，其中65株在6天內(nèi)獲得藥敏結(jié)果，1株在第8天獲得藥敏結(jié)果；而羅氏藥敏4周才能判定結(jié)果。

中華預防醫(yī)學雜志，2009，43（1）:24-27MODS檢測MTB耐藥性結(jié)果

（以傳統(tǒng)羅氏藥敏結(jié)果為判斷標準）

藥物敏感度特異性PPVNPV準確性鏈霉素96.0%97.6%96.0%97.6%97.0%異煙肼100%85.4%81.0%100%91.0%利福平96.2%95.0%92.6%97.4%95.5%乙胺丁醇73.7%91.5%77.8%89.6%86.4%6.線性探針雜交法(LiPA)

檢測原理是將常見突變位點的寡核苷酸探針(R探針)和正常序列的探針(S探針)分別固定在硝酸纖維素膜上，與待檢菌株PCR擴增產(chǎn)物雜交。然后加入顯色系統(tǒng)，以呈色反應判定藥敏試驗結(jié)果。若擴增產(chǎn)物與S探針雜交陰性，與R探針雜交陽性，則待檢菌株為耐藥株，反之為敏感株。23

耐多藥結(jié)核的快速檢測試劑盒

可以用于菌株和涂片陽性痰標本的利福平和異煙肼的耐藥性快速檢測。（GenoType

MTBDR）（GenoType

MTBDRplus)德國HainLife

Science

耐藥檢測的商品化試劑盒GenoTypeMTBDRassaysforthediagnosisofmultidrug-resistanttuberculosis:ameta-analysis，EurRespirJ2008;32:1165–1174產(chǎn)品名稱靈敏度特異度MTBDRplus-利福平99-10098-99MTBDRplus-異煙肼73-10093-10025檢測利福平耐藥性的敏感性和特異性均為99%；

檢測異煙肼耐藥性的敏感性為96%，特異性為100%

方法評價：

快速快速靈敏特異簡便優(yōu)點7.基因芯片檢測技術原理：基本原理是將多種寡核苷酸探針固定在玻璃等基質(zhì)上，然后與待測樣本的DNA或RNA片斷雜交、再經(jīng)洗滌、顯色，用熒光掃描儀探測分析各條探針的雜交信號強度，進而作出檢測結(jié)果。

操作步驟制備基因芯片提取待檢樣品DNAPCR擴增－獲得檢測片斷產(chǎn)物變性－獲得單鏈DNA探針雜交洗滌、顯色掃描分析判定結(jié)果

在耐藥性測定中的應用

1998年Gingeras等利用基因芯片雜交對對44株利福平耐藥的MTB臨床分離株進行了rpoB基因突變檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有41株8個密碼子12種突變。

1999年，美國Troesch等利用結(jié)核病相關芯片檢測了27個不同種屬的70株MTB臨床分離株和15株利福平耐藥菌株。結(jié)果檢測出了所有耐利福平的15株MTB的rpoB突變基因。

芯片檢測技術評價快速---從樣品制備到檢測結(jié)果只需4小時靈敏---微克、微微克特異---可鑒定結(jié)核、非結(jié)核分枝桿菌信息量大---一次檢測可獲得大量信息所需樣品量少--1ul

芯片技術存在的問題檢測成本較高；需要昂貴的儀器設備；操作復雜，要求高；

8.焦磷酸測序技術(pyrosequencing）依靠生物發(fā)光進行的實時DNA測序分析技術操作簡單、無需電泳、無需熒光標記、能提供堿基序列信息，其可重復性和精確性能與Sanger法相媲美，而速度卻大大的提高。適用于對已知的短序列的測序分析上海市結(jié)核（肺）重點實驗室上海市結(jié)核（肺）重點實驗室

本法優(yōu)點：運用其他的分子檢測方法很可能因為探針未覆蓋或者反應特異性不夠而被漏檢，焦磷酸測序技術在這種多位點多類型散在分布的突變檢測中具有獨特的優(yōu)勢。本方法具有快速、高通量、高自動化、實驗結(jié)果判斷客觀準確的特點耐藥性快速檢測展望

結(jié)核病耐藥性快速檢測研究是結(jié)核病研究的熱點和難點之一。雖然經(jīng)過數(shù)十年的努力，已取得了顯著進展，但仍不能滿足臨床診治的需要。這主要與下述因素有關：

首先是這些方法基本都是生長依賴性的，即

只能對分離的菌株進行檢測，因而仍需

較長時間；其次是藥敏結(jié)果的臨床含義即細菌學耐藥

與臨床耐藥結(jié)果的一致性不確切；

再者由于方法、原理及藥物濃度上的差

異，各方法間缺乏良好的可比性。另外快速測定大多需特殊的儀器設備，且

費用很多，難以普及應用。再者分子生物學檢測方法在國內(nèi)尚屬研究

階段，許多問題還沒得到解決，因此

短期內(nèi)難以用于臨床。上海市結(jié)核（肺）重點實驗室

結(jié)語盡管結(jié)核病實驗室診斷和耐藥性測定研究已取得很大進展，但各種測定方法仍有諸多不足。因此，我們要對存在的問題予以足夠重視，