建立食蟹猴糖尿病模型的研究

建立食蟹猴糖尿病模型的研究【摘要】【目的】建立食蟹猴糖尿病模型，并確定診斷標(biāo)準(zhǔn)?！痉椒ā窟x用雄性食蟹猴８只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組和模型組；采用一次性靜脈注射鏈脲佐菌素；觀察造模前后各組猴的攝食量、飲水量、尿量、體質(zhì)量變化，檢測(cè)各組尿糖、空腹血糖、糖耐量、甘油三酯、總膽固醇、Ｃ肽、谷氨酸脫羧酶抗體的變化，并進(jìn)行胰腺組織病理學(xué)檢查?！窘Y(jié)果】造模后模型組攝食量、飲水量及尿量顯著增加，體質(zhì)量、Ｃ肽含量顯著下降，甘油三酯和總膽固醇均無(wú)顯著變化；造模后第２周空腹血糖升高，尿糖由陰性變?yōu)椤?+++”；第５周出現(xiàn)糖耐量異常，第７周空腹血糖與正常組比較有顯著性差異，ＧＡＤＡb陽(yáng)性；胰腺組織病理檢查結(jié)果顯示模型組胰島萎縮、纖維化，而正常對(duì)照組胰腺組織無(wú)病理改變?！窘Y(jié)論】成功建立Ⅰ型糖尿病食蟹猴模型。

【關(guān)鍵詞】糖尿病；胰腺／病理學(xué)；疾病模型，動(dòng)物；食蟹猴

糖尿病動(dòng)物模型主要有誘發(fā)性糖尿病動(dòng)物模型、轉(zhuǎn)基因糖尿病動(dòng)物模型、自發(fā)性糖尿病動(dòng)物模型等，目前主要采用鏈脲佐菌素造模，但是造模動(dòng)物多選用大鼠，較少選用大動(dòng)物尤其是靈長(zhǎng)類［1］。國(guó)外有STZ誘導(dǎo)青年恒河猴糖尿病的報(bào)道，國(guó)內(nèi)僅有１例報(bào)道并且也選用青年恒河猴［2-8］。本實(shí)驗(yàn)采用另一種常用靈長(zhǎng)類動(dòng)物——食蟹猴，以STZ化學(xué)損傷建立Ⅰ型糖尿病動(dòng)物模型，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

11動(dòng)物及分組食蟹猴8只，均為雄性，體質(zhì)量分別為913、965、987、992、1023、1035、1065、1123kg。由廣東高要康達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供［合格證號(hào)SCXK(粵)2004-2009］，隨機(jī)分成2組，即模型組和正常對(duì)照組。

12主要試劑與儀器鏈脲佐菌素(STZ)為Sigma公司(美國(guó))產(chǎn)品；500g/L葡萄糖注射液由天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào):060921；尿糖試紙由桂林中輝科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：6C29；測(cè)利得超值型血糖儀(厚美德公司)；PHS2C精密級(jí)數(shù)字式酸度計(jì)；Ex3600全自動(dòng)生化儀(英國(guó))；TDL5000B型低速冷凍多管離心機(jī)；JA2103型電子天平。

13糖尿病模型制作模型組禁食16h后一次性靜脈注射STZ(臨用前用01mmol/L、pH42~45檸檬酸緩沖液配成10mg/L濃度)，劑量為45mg/kg；正常對(duì)照組禁食16h后一次性靜脈注射01mmol/L、pH42~45檸檬酸緩沖液，劑量為45mg/kg。

14檢測(cè)指標(biāo)［9-11］造模后7周內(nèi)每日觀察并記錄攝食量、飲水量、尿量、精神狀況；每3d稱量體質(zhì)量1次。每周檢測(cè)空腹血糖、甘油三酯、總膽固醇；第1、4、5周檢測(cè)糖耐量；第1、7周檢測(cè)C肽、谷氨酸脫羧酶抗體；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)動(dòng)物實(shí)施安樂(lè)死，并取胰腺做組織病理學(xué)檢測(cè)。

15統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS115統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果

21各組造模前后攝食量、飲水量、尿量及體質(zhì)量變化比較表1結(jié)果表明，模型組在造模后均出現(xiàn)了糖尿病的典型癥狀:攝食量、飲水量、尿量顯著增多，體質(zhì)量顯著下降，正常對(duì)照組造模前后上述指標(biāo)無(wú)顯著變化。

22各組造模前與造模后7周C肽、甘油三酯、總膽固醇變化比較表2結(jié)果表明模型組C肽含量顯著下降，而甘油三酯和總膽固醇均無(wú)顯著變化。

23各組造模前后血糖、糖耐量變化比較表3結(jié)果說(shuō)明模型組造模后第2周空腹血糖升高，第7周空腹血糖顯著上升，造模后第5周出現(xiàn)糖耐量異常。

24各組造模前后尿糖、GADAb變化比較表4結(jié)果說(shuō)明模型組造模后尿糖變?yōu)閺?qiáng)陽(yáng)性，GADAb造模后變?yōu)殛?yáng)性。

25各組胰腺組織病理學(xué)檢查結(jié)果圖1結(jié)果顯示模型組胰島萎縮、纖維化，正常對(duì)照組胰腺組織無(wú)變化。表1各組造模前與造模后７周攝食量、飲水量、尿量及體質(zhì)量變化比較

3討論

31所造模型相對(duì)于以往模型的優(yōu)勢(shì)國(guó)內(nèi)研究顯示通過(guò)給7只青年恒河猴靜脈注射不同劑量的鏈脲佐菌素(30、45、60mg/kg)，實(shí)驗(yàn)組的7只猴在給藥1月后攝食量、飲水量、排尿量才明顯增加，低、中劑量組在96h后才成模，高劑量組雖然較早成模,但該組猴逐漸出現(xiàn)行動(dòng)困難，反應(yīng)遲鈍，視力下降，面部浮腫，食欲降低，嗜睡等嚴(yán)重癥狀。雖然給予動(dòng)物胰島素皮下注射50U/d，終于在成模后176d死亡［2-5］。本研究給4只食蟹猴靜脈注射STZ45mg/kg，早在給藥后第4周就出現(xiàn)了攝食量、飲水量、排尿量的明顯增加，給藥后第2天即發(fā)現(xiàn)動(dòng)物尿糖陽(yáng)性，第3天的空腹血糖濃度開(kāi)始呈持續(xù)性升高。

32糖耐量時(shí)間點(diǎn)的選擇從猴糖耐量檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)看，彭芳等［9］在借助糖耐量從獼猴中篩選自發(fā)性糖尿病動(dòng)物模型時(shí)，僅選擇了0、90min2個(gè)時(shí)間點(diǎn)，未能反映動(dòng)物血糖下降的趨勢(shì)。蔣綠芝等［3］利用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)恒河猴糖尿病動(dòng)物模型，檢測(cè)糖耐量時(shí)選擇了0、5、10、20、30、60、90min，漏掉了120min這一重要的時(shí)間點(diǎn)，而120min血糖在人類糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)中是一個(gè)重要的指標(biāo)。本研究的糖耐量檢測(cè)選擇了時(shí)間點(diǎn)0、30、60、90、120min檢測(cè)糖耐量，反映了血糖下降趨勢(shì)，并記錄了重要的120min血糖值，綜合了以上兩種時(shí)間點(diǎn)選擇的優(yōu)勢(shì)。

33猴糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)的制訂根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，GAD是最早出現(xiàn)的自身抗原，在新診斷的Ⅰ型糖尿病病人中，60％～80％可檢出GAD抗體，高者達(dá)96％［10-11］。長(zhǎng)期以來(lái)，動(dòng)物糖尿病的血糖標(biāo)準(zhǔn)各文獻(xiàn)報(bào)道不一致，多為111~167mmol/L之間，尚未見(jiàn)關(guān)于食蟹猴糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)報(bào)道。王濟(jì)等［12］建立中國(guó)地鼠自發(fā)性遺傳性糖尿病，若3次或3次以上非空腹血糖均＞67mmol/L確定為糖尿病地鼠。陳曉麗等［13］用四氧嘧啶注射Wistar大鼠造模，隔夜禁食12h，測(cè)尾靜脈血糖＞78mmol/L確定為糖尿病。李晶等［14］用四氧嘧啶誘發(fā)大白兔糖尿病模型，以注射后48、72h血糖值＞100mmol/L確定為糖尿病。戴自英等［15］認(rèn)為糖尿病模型血糖值標(biāo)準(zhǔn)為:連續(xù)2d血糖值超過(guò)111mmol/L或葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)時(shí)，120min血糖仍未恢復(fù)到注射前水平。賈雪梅等［16］的研究報(bào)道，小鼠血糖升高至145~278mmol/L，高血糖狀態(tài)持續(xù)3周以上者確定為糖尿病小鼠模型。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在空腹血糖維持在高水平的同時(shí)，糖尿病的典型癥狀攝食、飲水和尿量增加即“三多”均表現(xiàn)很明顯，尿糖也一直維持“＋＋＋＋”的水平，靜脈糖耐量實(shí)驗(yàn)中2h空腹血糖≥100mmol/L。故在制訂食蟹猴糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)的時(shí)候，空腹血糖是一個(gè)重要的參考指標(biāo)，同時(shí)通過(guò)對(duì)人類糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)的研究，糖耐量也是一個(gè)重要的指標(biāo)。經(jīng)抽樣調(diào)查，食蟹猴正常空腹血糖為mmol/L。綜上所述，參照猴正?？崭寡?，可以判定動(dòng)物已成模，且猴糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：①空腹血糖≥80mmol/L且持續(xù)3周以上；②葡萄糖耐量試驗(yàn)中，葡萄糖負(fù)荷后2h血糖≥100mmol/L。具有以上2條之一皆可視為動(dòng)物已患有糖尿病，若動(dòng)物C肽下降(檢測(cè)C肽水平能準(zhǔn)確反映出胰島β細(xì)胞的分泌功能［17］）、GADAb變?yōu)殛?yáng)性，則可認(rèn)為此糖尿病為Ⅰ型。當(dāng)然，本試驗(yàn)中也暴露出一些問(wèn)題，在此提出以下解決辦法：①在給動(dòng)物注射STZ后48h內(nèi)每4h檢測(cè)1次血糖，如發(fā)現(xiàn)有異常即視情況注射胰島素或葡萄糖;②作為判斷動(dòng)物成模的重要指標(biāo)，血糖和尿糖的關(guān)系以及何時(shí)出現(xiàn)異常尚未明確，所以建議在今后的試驗(yàn)中增加檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，在給藥后第２天即每日檢測(cè)尿糖，如果出現(xiàn)異常即予當(dāng)天晚上禁食，并于次日檢測(cè)空腹血糖，而且還要在接下來(lái)的２周內(nèi)每３d平行檢測(cè)尿糖和空腹血糖１次；③結(jié)合猴的特殊糖代謝特點(diǎn)，糖耐量實(shí)驗(yàn)應(yīng)改為檢測(cè)以下幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血糖值：0、10、30、60、120min；④動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后將不處死，觀察糖尿病并發(fā)癥的出現(xiàn)種類以及出現(xiàn)時(shí)間。

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