氨基酸對(duì)胰島素纖維形成及細(xì)胞毒性的影響

氨基酸對(duì)胰島素纖維形成及細(xì)胞毒性的影響【摘要】目的:研究氨基酸對(duì)牛胰島素淀粉樣纖維的生成、形態(tài)和細(xì)胞毒性的影響.方法:采用硫黃素?zé)晒鈾z測(cè)牛胰島素形成淀粉樣纖維的動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)，透射電鏡觀察纖維形態(tài)；以淀粉樣纖維誘導(dǎo)人紅細(xì)胞的聚集和溶血為指標(biāo)評(píng)估纖維對(duì)細(xì)胞膜的損害作用.結(jié)果:牛胰島素在pH，57℃的條件下，可在h開(kāi)始形成淀粉樣纖維，5種氨基酸即組氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺和精氨酸具有延遲胰島素纖維化的作用，同時(shí)改變了淀粉樣纖維的形態(tài).胰島素在形成淀粉樣纖維后可在較低的濃度范圍內(nèi)誘導(dǎo)人紅細(xì)胞溶血和聚集，該作用隨著纖維的生長(zhǎng)逐漸增強(qiáng).雖然在氨基酸作用下延遲生長(zhǎng)的纖維具有不同的纖維形態(tài)，但并不能改變纖維對(duì)細(xì)胞膜的損害作用.結(jié)論:牛胰島素在形成淀粉樣纖維后具有破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的作用.氨基酸可以抑制胰島素的纖維化作用.胰島素纖維對(duì)紅細(xì)胞膜的損害作用與其形態(tài)和生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)無(wú)關(guān).

【關(guān)鍵詞】淀粉樣纖維；牛胰島素；氨基酸；紅細(xì)胞；淀粉樣變性

0引言

許多蛋白質(zhì)在一定條件下由于錯(cuò)誤折疊而形成淀粉樣纖維沉積，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)至少20多種人類(lèi)疾病與因蛋白的錯(cuò)誤折疊而導(dǎo)致淀粉樣纖維沉積有關(guān)［1-4］.胰島素蛋白在特定條件下容易形成淀粉樣纖維從而可能導(dǎo)致對(duì)患者的免疫原性［5］.研究［6-8］表明，精氨酸(Arg)能夠促進(jìn)錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)重新折疊而恢復(fù)天然活性,并且發(fā)現(xiàn)其有穩(wěn)定蛋白構(gòu)象的作用.根據(jù)我們近期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所有20種常見(jiàn)氨基酸對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象均具有一定的穩(wěn)定作用.我們選取包括Arg在內(nèi)的5種氨基酸，研究其對(duì)牛胰島素纖維生長(zhǎng)的抑制作用，并以人紅細(xì)胞聚集和溶血為指標(biāo)，探索不同條件下生成的胰島素纖維對(duì)細(xì)胞膜的損害作用.

1材料和方法

材料新鮮全血來(lái)自志愿者捐獻(xiàn)，用枸醛酸抗凝；牛胰島素、硫黃素；其他均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?H600型透射電鏡，VarianCaryEclipse型熒光光度計(jì)，3k30型冷凍離心機(jī)；1240型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司).

方法

胰島素淀粉樣纖維在含有100mmol/LNaCl的鹽酸中配制1g/L牛胰島素水溶液，加入50mmol/L氨基酸，于57℃水浴中孵育，按一定的時(shí)間間隔取樣，加入到20mmol/LTrisHCl中，加10μmol/LThT，混勻后檢測(cè)ThT熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)440nm，發(fā)射波長(zhǎng)482nm.制作纖維生長(zhǎng)曲線(xiàn).并同時(shí)檢測(cè)胰島素纖維生長(zhǎng)過(guò)程中各級(jí)聚集體對(duì)紅細(xì)胞的損害作用.所有的氨基酸都是相同條件.

纖維形態(tài)觀察取成熟胰島素纖維5μL，用二次蒸餾水5倍稀釋?zhuān)c(diǎn)樣10μL于鍍膜的銅網(wǎng)上，10min后用濾紙吸干，再滴加10μL雙氧鈾溶液染色，3min后吸干，在透射電子顯微鏡下觀察并拍照.

溶血檢測(cè)取新鮮全血于4℃，750g離心10min，吸去上層血漿和白細(xì)胞，用等滲PBS洗滌3次.分離的紅細(xì)胞用等滲PBS稀釋?zhuān)尤胍葝u素纖維，使紅細(xì)胞濃度為20mL/L，纖維濃度為g/L.細(xì)胞懸液于37℃水浴30min后，4℃，750g離心10min，取上清液于540nm處測(cè)A值.

紅細(xì)胞聚集取新鮮配制的40mL/L紅細(xì)胞加入胰島素纖維，紅細(xì)胞終濃度為20mL/L，37℃孵育30min，取15μL滴片觀察并照相.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用方差分析.

2結(jié)果

2．1纖維生長(zhǎng)曲線(xiàn)隨著纖維的生長(zhǎng)，ThT的熒光強(qiáng)度在經(jīng)過(guò)一個(gè)快速上升階段后達(dá)到平臺(tái)期，表明纖維已達(dá)到成熟階段，氨基酸的加入延遲了胰島素纖維的生長(zhǎng).其中，Arg的作用最強(qiáng)，在監(jiān)測(cè)的12h內(nèi)，熒光值無(wú)升高.連續(xù)監(jiān)測(cè)至第3日熒光值未見(jiàn)升高.

His：組氨酸；Pro：脯氨酸；Thr：蘇氨酸；Gln：谷氨酰胺；Arg：精氨酸.

圖1胰島素纖維的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

2．2胰島素的纖維形態(tài)加入His的纖維為長(zhǎng)絲狀，纖維的半徑較??；加入脯氨酸，蘇氨酸和谷氨酰胺處理的纖維形態(tài)相似，均聚集呈網(wǎng)束狀，其中Pro處理的纖維比其他纖維更短，半徑也較大.加入Arg的體系在后孵育12h后，蛋白僅以無(wú)定形聚集體的形式存在，直至孵育60h后才能觀察到有極少量的纖維.

A:胰島素對(duì)照;B:組氨酸;C:脯氨酸;D:蘇氨酸;E:谷氨酰胺;F:精氨酸.

圖2不同生長(zhǎng)條件下胰島素纖維20g/L雙氧鈾溶液染色×50000

2．3胰島素纖維的溶血活性和誘導(dǎo)紅細(xì)胞聚集的作用溶血作用隨纖維的生長(zhǎng)而增強(qiáng)，但在纖維進(jìn)入成熟階段時(shí)其作用有所減弱.對(duì)不同條件下生長(zhǎng)的纖維的細(xì)胞毒性作用進(jìn)行比較，結(jié)果表明胰島素纖維和加入氨基酸后生長(zhǎng)的胰島素纖維都具有溶血作用，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.加入Arg處理的胰島素在12h時(shí)無(wú)纖維生長(zhǎng)，也不具有溶血活性，72h時(shí)仍無(wú)明顯溶血作用.較低濃度的胰島素纖維無(wú)溶血活性，但有聚集紅細(xì)胞的作用，此聚集作用與纖維生長(zhǎng)的進(jìn)程呈正相關(guān).除His以外，這種作用的大小與纖維的形態(tài)無(wú)關(guān).加入Arg處理的胰島素在72h內(nèi)無(wú)誘導(dǎo)細(xì)胞聚集的作用.

3討論

蛋白質(zhì)由于錯(cuò)誤折疊而形成淀粉樣纖維沉積，是很多人類(lèi)疾病的誘因之一.蛋白質(zhì)聚集后會(huì)失去部分A:胰島素蛋白;B:胰島素纖維;C:組氨酸;D:脯氨酸;E:蘇氨酸;F:谷氨酰胺;G:精氨酸.

圖3氨基酸處理后牛胰島素纖維誘導(dǎo)的紅細(xì)胞聚集×40

或全部活性，溶解性降低，免疫原性也會(huì)發(fā)生改變［4-5，7］.ThT可特異地與淀粉樣纖維結(jié)合，在特定的波長(zhǎng)下熒光強(qiáng)度的大小與淀粉樣纖維形成的含量成正比［9］.我們的結(jié)果表明，加入氨基酸能有效地延遲了纖維的生長(zhǎng).不同氨基酸的延遲作用各有不同，在所選取的5種氨基酸中，Arg作用最強(qiáng).所以，Arg可以作為一種有效的抑制劑，防止蛋白質(zhì)制劑的變性和纖維化.在加入氨基酸的體系中，纖維的形態(tài)也有一定程度的改變，加His后形成的纖維為長(zhǎng)絲狀，與不加任何氨基酸處理的胰島素纖維形態(tài)部分相似，都是中空結(jié)構(gòu)，只不過(guò)后者的纖維較短并聚集成束狀.加Pro，Thr和Gln后形成的纖維無(wú)中空結(jié)構(gòu)，呈不同程度的束狀聚集.在Arg存在下，胰島素很難形成淀粉樣纖維.紅細(xì)胞溶血和聚集實(shí)驗(yàn)表明，不同纖維的細(xì)胞毒性?xún)H有很小的差別.即淀粉樣纖維形態(tài)上的差別并沒(méi)有改變其生物毒性，這與目前普遍認(rèn)為的淀粉樣纖維的細(xì)胞毒性主要取決于其中的β折疊結(jié)構(gòu)是一致的.我們的結(jié)果表明，小分子氨基酸可以在較小的濃度范圍內(nèi)抑制胰島素的纖維化.因此由一些較強(qiáng)作用的氨基酸組成的寡肽可能會(huì)成為蛋白質(zhì)變性的強(qiáng)力抑制劑.這類(lèi)抑制劑與合成有機(jī)物相比，將具有更好的生物相容性.此外，我們報(bào)道了非病原性蛋白胰島素在形成淀粉樣纖維后，與β淀粉樣肽一樣［10］具有誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)容物大量滲透的作用.這種作用與淀粉樣纖維在細(xì)胞膜聚集，通過(guò)插膜作用破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)并形成非專(zhuān)一性離子通道密切相關(guān).

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