藥物分析 第五章 抗菌藥物與抗生素類的分析-3

第五章抗菌藥物與抗生素類的分析第一節(jié)喹諾酮類藥物的分析一、基本結(jié)構(gòu)與典型藥物

吡哌酸諾氟沙星

環(huán)丙沙星氧氟沙星

氟羅沙星依諾沙星

司帕沙星二、理化性質(zhì)1.酸堿兩性2.與丙二酸的反應(yīng)3.含鹵素氟4.紫外紅外光譜二、鑒別試驗(yàn)（一）鹽的鑒別如甲磺酸培氟沙星：取本品約30mg，加氫氧化鈉0.2g，加水?dāng)?shù)滴，溶解后置酒精燈上，小火蒸干至炭化，加水?dāng)?shù)滴與2mol/L鹽酸溶液3~4ml，緩緩加熱，產(chǎn)生二氧化硫氣體，能使?jié)駶櫟牡馑徕浀矸墼嚰堬@藍(lán)色。

（二）與丙二酸的呈色反應(yīng)如鹽酸左氧氟沙星片：

取本品細(xì)粉適量（約相當(dāng)于左氧氟沙星10mg），置干燥具塞試管中，加丙二酸約10mg與醋酐0.5ml，在水浴中加熱5~10分鐘，溶液顯紅棕色。（三）有機(jī)氟化物的反應(yīng)（四）光譜法（五）色譜法三、特殊雜質(zhì)檢查

（一）溶液澄清度與顏色（二）酸度（三）吸光度（四）有關(guān)物質(zhì)（五）光學(xué)異構(gòu)體四、含量測定（一）非水堿量法（二）紫外分光光度法（三）HPLC法第二節(jié)β-內(nèi)酰胺類抗生素

β-內(nèi)酰胺環(huán)一、基本結(jié)構(gòu)與典型藥物青霉素類頭孢菌素類青霉素類頭孢菌素類氫化噻唑環(huán)氫化噻嗪環(huán)-內(nèi)酰胺環(huán)青霉素類6-氨基青霉烷酸（6－APA）***手性C酸性不穩(wěn)定酰胺側(cè)鏈青霉素（芐青霉素）

包括有青霉素鉀、青霉素鈉、普魯卡因青霉素。氨芐西林（氨芐青霉素）.阿莫西林（羥氨芐青霉素）.磺芐西林鈉

（磺芐青霉素鈉）頭孢菌素類7-氨基頭孢菌烷酸（7－ACA）**手性C酸性酰胺側(cè)鏈不穩(wěn)定UV頭孢氨芐.頭孢羥氨芐.頭孢拉定頭孢噻吩鈉二、性質(zhì)1.酸性游離羧基酸性，易與堿成鹽。2.旋光性-手性碳3.紫外吸收特性青霉素母核無吸收，但通常其側(cè)鏈有吸收；頭孢菌素母核O=C-N-C=C，在260nm處強(qiáng)吸收。4.穩(wěn)定性

-內(nèi)酰胺環(huán)為四元環(huán)，張力大，且酰胺鍵易水解，不穩(wěn)定。穩(wěn)定性與含水量和純度相關(guān)。

在水溶液中，易受酸、堿、酶、金屬離子或氧化劑的影響，發(fā)生水解和分子重排。二、鑒別

本類藥物的鑒別試驗(yàn)，國內(nèi)外藥典中主要采用的方法為IR、HPLC、TLC法。（一）色譜法1.TLC

與對照品比較Rf值與斑點(diǎn)顏色2.HPLC

與對照品比較tR值（二）光譜法1.IR法特征官能團(tuán)：酰胺β-內(nèi)酰胺2.UV法青霉素鈉1.羥肟酸鐵反應(yīng)內(nèi)酰胺OH-呈色Fe3+H+（三）呈色反應(yīng)頭孢哌酮

ChP（2015）【鑒別】（1）取本品約10mg，加水2ml與鹽酸羥胺溶液3ml，振搖溶解后，放置5分鐘，加酸性硫酸鐵銨試液1ml，搖勻，顯紅棕色。2.茚三酮反應(yīng)△注射用頭孢拉定ChP（2015）TLC鑒別顯色劑:茚三酮3.三氯化鐵反應(yīng)

酚羥基偶合呈色三氯化鐵頭孢羥氨芐

ChP（2015）【鑒別】（1）取本品適量，加水適量超聲使溶解并稀釋制成每1ml中約含12.5mg的溶液，取溶液1ml，加三氯化鐵試液3滴，即顯棕黃色。4.各種鹽的反應(yīng)

焰色→鮮黃色

+醋酸氧鈾鋅→↓黃

Na+

焰色→紫色

+0.1%四苯硼鈉+Ac—→↓白

K+1.K+、Na+反應(yīng)2.重氮化偶合反應(yīng)普魯卡因青霉素普魯卡因H+水解重氮化偶合反應(yīng)（五）微生物檢定法-對照品對照法

青霉素鈉

Ch.P（2000）【鑒別】（1）取本品與已知含量的青霉素適量，分別加水制成每1ml中約含50g的溶液，各取1ml，加入不少于200單位的青霉素酶溶液1ml，在37℃滅活1小時(shí)后，取滅菌濾紙片，分別用上述溶液浸濕后，用濾紙吸去多余的液體，置攤布金色黃色葡萄球菌CMCC(B)26003的培養(yǎng)基上，在37℃培養(yǎng)約16小時(shí)后均無抑菌作用，而用同一方法檢查未經(jīng)青霉素酶滅活的溶液均有抑菌作用。（一）聚合物高分子雜質(zhì)指抗生素藥品中分子量大于藥物本身的雜質(zhì)的總稱。分為內(nèi)源性和外源性雜質(zhì)。三、檢查外源性雜質(zhì)：包括蛋白、多肽、多糖類雜質(zhì)或其與抗生素的結(jié)合物。主要來于自發(fā)酵工藝。內(nèi)源性雜質(zhì)：自身聚合物。生產(chǎn)或貯藏過程中產(chǎn)生。聚合物檢查方法：

多用分子排阻色譜法。即根據(jù)分子量差異進(jìn)行分離的凝膠色譜法。

凝膠色譜具有分子篩的作用，讓藥物分子自由的進(jìn)入凝膠顆粒表面，而高分子雜質(zhì)被排阻，不能進(jìn)入顆粒內(nèi)部；色譜過程中凝膠對藥物的吸附作用大于對高分子雜質(zhì)的吸附作用，可使高分子雜質(zhì)與藥物分離。頭孢呋辛酯-HPLC

異構(gòu)體規(guī)定峰面積大小比值有關(guān)物質(zhì)主成分自身對照法（二）異構(gòu)體和有關(guān)物質(zhì)青霉素鈉ChP（2015）【檢查】吸光度取本品，加水制成每1ml中含1.80mg的溶液，照紫外-可見分光光度法（通則0401），在280nm的波長處測定吸光度，不得大于0.10；在264nm的波長處有最大吸收，吸光度應(yīng)為0.80-0.88。（三）吸光度頭孢克洛含量測定

ChP（2015）【含量測定】填充劑十八烷基硅烷鍵合硅膠流動相磷酸二氫鉀溶液–乙腈（92︰8）（pH3.4)對照品頭孢克洛（含頭孢克洛δ-3-異構(gòu)體）兩者分離度應(yīng)大于1.5四、含量測定（一）高效液相色譜法（二）紫外-可見分光光度法（三）羥肟酸鐵比色法第三節(jié)氨基糖苷類抗生素

以堿性環(huán)己多元醇為苷元，與氨基糖縮合而成的苷。一、基本結(jié)構(gòu)與典型藥物

主要有鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、新霉素、巴龍霉素、奈替米星等。鏈霉素鏈霉胍鏈霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺鏈霉雙糖胺絳紅糖胺2-脫氧鏈霉胺加洛糖胺慶大霉素慶大霉素C復(fù)合物：

慶大霉素C1

R1、R2=CH3

R3=H

慶大霉素C2

R1=CH3

R2=R3=H

慶大霉素C1a

R1、R2、R3=H

慶大霉素C2a

R1=R2=HR3=CH3二、性質(zhì)1.溶解性多-OH，水溶性。2.堿性多-NH2，堿性，臨床上多用硫酸鹽。3.旋光性手性C。4.穩(wěn)定性O(shè)H-葡萄糖胺鏈霉糖OH-麥芽酚反應(yīng)坂口反應(yīng)5.UV

鏈霉素λmax=230nm。三、鑒別（一）茚三酮反應(yīng)

氨基糖苷藍(lán)紫色茚三酮△硫酸妥布霉素注射液

ChP（2015）【鑒別】（1）取本品lml，加0.2%茚三酮溶液約1ml，直火緩緩加熱約3分鐘，應(yīng)呈紫色。（二）Molisch反應(yīng)蒽酮阿米卡星ChP（2015）【鑒別】（1）取本品約10mg，加水1ml溶解后，加0.1%蒽酮的硫酸溶液4ml，即顯藍(lán)紫色。（三）N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)乙酰丙酮OH-吡咯衍生物對二甲氨基苯甲醛H+櫻桃紅色硫酸新霉素

ChP（2015）【鑒別】（1）取本品約10mg，加水1ml溶解后，加鹽酸溶液（9→100）2ml，在水浴中加熱10分鐘，加8%氫氧化鈉溶液2ml與2%乙酰丙酮水溶液1ml，置水浴中加熱5分鐘，冷卻后，加對二甲氨基苯甲醛試液1ml，即顯櫻桃紅色。（四）麥芽酚反應(yīng)Fe3+H+紫紅色配位化合物

此反應(yīng)為鏈霉素的特征反應(yīng)。硫酸鏈霉素

ChP（2015）【鑒別】（2）取本品約20mg，加水5ml溶解后，加氫氧化鈉試液0.3ml，置水浴上加熱5分鐘，加硫酸鐵銨溶液（取硫酸鐵銨0.1g，加0.5mol/L硫酸溶液5ml使溶解）0.5ml，即顯紫紅色。（五）坂口反應(yīng)鏈霉素鏈霉胍OH-鏈霉胍+NaBrO8-羥基喹啉+NaBrO橙紅色硫酸鏈霉素

ChP（2015）【鑒別】（1）取本品約0.5mg，加水4ml溶解后，加氫氧化鈉試液2.5ml與0.1%8-羥基喹啉的乙醇溶液1ml，放冷至約15℃，加次溴酸鈉試液3滴，即顯橙紅色。（六）硫酸鹽反應(yīng)多為硫酸鹽，顯硫酸鹽的鑒別反應(yīng)。

（七）色譜法TLC、HPLC法（八）光譜法IR、UV法慶大霉素

BP

取硫酸慶大霉素10mg，加水1ml和40%的硫酸溶液5ml，在水浴中加熱100分鐘，冷卻，用水稀釋至25ml。取該溶液進(jìn)行紫外掃描，在240-330nm范圍應(yīng)無最大吸收。四、雜質(zhì)檢查（一）有關(guān)物質(zhì)（二）硫酸鹽測定

EDTA測定法或HPLC法（三）組分測定慶大霉素C組分測定:

慶大霉素為C1，C2，C1a，C2a的混合物，各組分對微生物的活性無明顯差異，但毒副作用和耐藥性不同，因此其相對含量影響產(chǎn)品的質(zhì)量，需做控制（規(guī)定各組分的相對百分含量）。C125%-50%C1a15%-40%C2a

+C220%-50%要求：方法：HPLC

慶大霉素沒有紫外吸收，所以應(yīng)先進(jìn)行衍生化處理。λmax=330nmpH10.4巰基醋酸Ch.P（2000）ChP（2015）

蒸發(fā)光散射檢測器檢測BP

電化學(xué)檢測器檢測硫酸慶大霉素

ChP（2015）【檢查】慶大霉素C組分照高效液相色譜法（通則0512）測定。填充劑十八烷基硅烷鍵合硅膠(pH0.8~8.0)流動相0.2mol/L三氟醋酸-甲醇（92:8）檢測器蒸發(fā)光散射檢測器標(biāo)準(zhǔn)品慶大霉素、小諾霉素

小諾霉素與慶大霉素各組分峰應(yīng)滿足分離度要求。

蒸發(fā)光散射檢測器（EvaporativeLight-scatteringDetector）是質(zhì)量型檢測器，只與待測物質(zhì)的量相關(guān)，無所謂其光學(xué)性質(zhì)或電化學(xué)性質(zhì)。因此對于許多沒有光學(xué)吸收特征的生物性物質(zhì)的檢測，蒸發(fā)光散射檢測器提供了新一代的檢測方法。

一、霧化流動相與氮?dú)饣蚩諝饣旌闲纬伸F狀液體，即稱“液霧”。二、蒸發(fā)“液霧”中的易揮發(fā)的流動相氣化揮發(fā)，不易揮發(fā)的樣品形成微小顆粒。三、檢測流動相完全揮發(fā)，樣品的微小顆粒通過激光束時(shí)，造成光束散射。通過散射的光，產(chǎn)生電信號。ELSD檢測三步曲示意圖霧化蒸發(fā)檢測四、含量測定

主要采用微生物檢定法和HPLC法。

硫酸鏈霉素

ChP（2015）【含量測定】精密稱取本品適量，加滅菌水定量制成每1ml中約含1000單位的溶液，照抗生素微生物檢定法（通則1201）測定，1000鏈霉素單位相當(dāng)于1mgC21H38N7O12。第四節(jié)四環(huán)素類抗生素DCBA氫化四駢苯衍生物一、基本結(jié)構(gòu)與典型藥物弱酸性、UV弱堿性四環(huán)素（TC）金霉素（CTC）-氯四環(huán)素土霉素（OTC）-氧四環(huán)素多西環(huán)素（DOTC）-脫氧土霉素美他環(huán)素（METC）二、性質(zhì)1.為兩性化合物酚羥基、烯醇基：酸性二甲氨基：堿性O(shè)H-難溶于水易溶于有機(jī)溶劑易溶于水難溶于有機(jī)溶劑游離四環(huán)素四環(huán)素鹽臨床上多用鹽酸鹽2.旋光性3.紫外吸收和熒光性質(zhì)4.

與金屬離子絡(luò)合顯色含酚羥基和烯醇基，與金屬離子生成鹽或配位化合物。5.穩(wěn)定性-不同PH下的異構(gòu)化或降解反應(yīng)（1）PH2.0-6.0

差向異構(gòu)化反應(yīng)（可逆反應(yīng)）四環(huán)素差向四環(huán)素土霉素、多西環(huán)素、美他環(huán)素不易反應(yīng)。（2）PH<2.0酸性降解-H2O四環(huán)素脫水四環(huán)素pH＜2pH＜2四環(huán)素脫水四環(huán)素差向脫水四環(huán)素4-差向四環(huán)素（3）堿性下降解三、鑒別（一）HPLC法鹽酸土霉素

ChP（2015）【鑒別】（3）在含量測定項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品溶液主峰的保留時(shí)間應(yīng)與對照品溶液主峰的保留時(shí)間一致（二）TLC法固定相：硅藻土EDTA：克服痕量金屬離子存在引起的拖尾現(xiàn)象。黏合劑：EDTA+甘油流動相：含EDTA

（三）IR法（四）UV法（五）化學(xué)鑒別法1.H2SO4反應(yīng)鹽酸金霉素

ChP（2015）【鑒別】（1）取本品約0.5mg，加硫酸2ml即顯藍(lán)色，漸變?yōu)殚蠙炀G色，加水1ml后，顯金黃色或棕黃色。2.三氯化鐵反應(yīng)酚羥基與三氯化鐵反應(yīng)。鹽酸四環(huán)素

ChP（2015）【鑒別】（1）取本品約0.5mg，加硫酸2ml，即顯深紫色，再加三氯化鐵試液1滴，溶液變?yōu)榧t棕色。四、檢查（一）鹽酸四環(huán)素中有關(guān)物質(zhì)

4-差向四環(huán)素脫水四環(huán)素差向脫水四環(huán)素土霉素鹽酸金霉素檢查方法：HPLC（加校正因子的主成份自身對照法）鹽酸四環(huán)素

ChP（2015）【檢查】有關(guān)物質(zhì)取本品適量，加0.01mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋制成每1ml中含0.5mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取2ml，置100ml量瓶中，加0.01mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。照含量測定項(xiàng)下的色譜條件，取對照溶液10l注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的20%。精密量取供試品溶液和對照溶液各10l，分別注入液相色譜儀。記錄色譜圖至主成份保留時(shí)間的2.5倍。供試品溶液色譜圖中記錄色譜圖至主成分如有雜質(zhì)峰，按校正后的峰面積計(jì)算（土霉素、4-差向四環(huán)素、鹽酸金霉素、脫水四環(huán)素和差向脫水四環(huán)素的校正因子分別為1.0、1.42、1.39、0.48和0.62），分別不得大于對照溶液主峰面積的0.25倍（0.5%）、1.5倍（3.0%）、0.5倍（1.0%）、0.25倍（0.5%）、0.25倍（0.5%）。其他各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積的0.5倍（1.0%）。（二）雜質(zhì)吸收度

四環(huán)素類藥物產(chǎn)生異構(gòu)化和降解反應(yīng)后會發(fā)生顏色改變。檢查方法為規(guī)定一定溶劑、一定濃度、一定波長下雜質(zhì)吸收度的限量鹽酸四環(huán)素

ChP（2015）【檢查】雜質(zhì)吸光度取本品，在20~25℃時(shí)加0.8%氫氧化鈉溶液制成每1ml中含10mg的溶液，照紫外-可見分光光度法（通則0401），置4cm的吸收池中，在530nm的波長處測定，自加0.8%氫氧化鈉溶液起5分鐘時(shí)，其吸光度不得過0.12（供注射用）。五、含量測定—HPLC法鹽酸四環(huán)素

ChP（2015）填充劑：十八烷基硅烷鍵合硅膠流動相：醋酸銨溶液[0.15mol/L醋酸銨溶液-0.01mol/L的EDTA溶液-三乙胺（100:10:1）用醋酸調(diào)節(jié)pH至8.5]-乙腈（83:17）色譜系統(tǒng)適用性：制備四環(huán)素和有關(guān)物質(zhì)的混合溶液，要求能完全分離。

屬于-內(nèi)酰胺類的抗生素藥物有

A.青霉素

B.紅霉素

C.頭孢菌素

D.慶大霉素

E.四環(huán)素

四環(huán)素在堿性條件下的降解產(chǎn)物是

A.差向四環(huán)素

B.脫水四環(huán)素

C.異四環(huán)素

D.去甲四環(huán)素

E.去甲氧四環(huán)素

鏈霉素的