實(shí)驗(yàn)三食品中蠟樣芽孢桿菌的檢驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)三食品中蠟樣芽孢桿菌的檢驗(yàn)第一頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二（一）蠟樣芽胞桿菌生物學(xué)性狀

1、形態(tài)和染色特性該菌為革蘭氏陽(yáng)性的大桿菌，菌體兩端較平整，芽胞呈橢圓形，位于菌體中央稍偏一端,多呈鏈狀排列,無(wú)莢膜，有周鞭毛。第二頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二2、培養(yǎng)特性（1）需氧菌，生長(zhǎng)溫度范圍在10-45℃之間。最適生長(zhǎng)溫度為28-35℃。

（2）在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。本菌在普通瓊脂平板上，生長(zhǎng)的菌落呈乳白色，不透明，直徑4-6mm,邊緣不整齊，表面粗糙，呈毛玻璃狀或白蠟狀。第三頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二（3）在血液瓊脂平板上形成淺灰色、不透明、似毛玻璃狀的菌落。菌落周?chē)醭什菥G色溶血,時(shí)間稍長(zhǎng)即完全透明。（4）蠟狀芽胞桿菌在甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂(MYP)上的菌落為粉紅色(表示不發(fā)酵甘露醇)，周?chē)蟹奂t色的暈（表示產(chǎn)生卵磷脂酶）。第四頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二（5）在普通肉湯內(nèi)生長(zhǎng)迅速，肉湯混濁，常常有菌膜或壁環(huán)，振搖易乳化。第五頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二3、生化性狀：（1）葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)：接種于酚紅葡萄糖肉湯中，厭氧條件下35℃培養(yǎng)24h。培養(yǎng)基應(yīng)由紅色變?yōu)辄S色。（2）硝酸鹽還原試驗(yàn)：陽(yáng)性（紅色）。（表明本菌在厭氧條件下分解葡萄糖產(chǎn)酸）（3）V-P試驗(yàn)：接種于改良V-P培養(yǎng)基中，35℃

培養(yǎng)48h。加V-P試劑及肌酸數(shù)粒，靜止

1h，應(yīng)為陽(yáng)性反應(yīng)（伊紅色）。第六頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二（4）L-酪氨酸分解試驗(yàn)：接種于L-酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基上，35℃培養(yǎng)48h,陽(yáng)性反應(yīng)菌落周?chē)囵B(yǎng)基應(yīng)出現(xiàn)澄清透明區(qū)（表示產(chǎn)生酪蛋白酶）。陰性時(shí)應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)72h再觀察。（5）溶菌酶試驗(yàn)：用直徑2mm接種環(huán)取純菌懸液一環(huán),接種于溶菌酶肉湯中，35℃培養(yǎng)24h。該菌在本培養(yǎng)基（含0.001％的溶菌酶）中能生長(zhǎng)。如出現(xiàn)陰性反應(yīng),應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)24h。第七頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二4、致病性

蠟樣芽胞桿菌引起食物中毒，除必須具有大量的細(xì)菌外，腸毒素也是重要的致病因素。耐熱性腸毒素：100℃30分鐘不能被破壞，為引起嘔吐型中毒的致病因素,常在米飯中形成。不耐熱腸毒素：是引起腹瀉型胃腸炎的病因，能在各種食物中形成。第八頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二5、抵抗力蠟樣芽胞桿菌100℃20分鐘即可被殺死；對(duì)酸堿不敏感，pH6-11對(duì)本菌基本上不受影響，pH5以下，生長(zhǎng)可受到抑制。第九頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二（二）流行病學(xué)特點(diǎn)1、季節(jié)性特點(diǎn)：以夏、秋季，尤其是6～10月為多見(jiàn)。2、食品種類(lèi)－剩飯，特別是大米飯。－乳及乳制品、畜禽肉類(lèi)制品、蔬菜、萊湯、馬鈴薯、豆芽、甜點(diǎn)心、調(diào)味汁、色拉。

國(guó)內(nèi)：與淀粉質(zhì)食品相關(guān)多。第十頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二3、臨床癥狀

嘔吐型中毒：多見(jiàn)于過(guò)剩米飯和油炒飯，由耐熱性腸毒素為致病因素；潛伏期短，一般為2～3小時(shí)，最短為30分鐘，最長(zhǎng)5～6小時(shí)；癥狀以嘔吐，腹痙攣為主，腹瀉則少見(jiàn)，一般經(jīng)過(guò)8～10小時(shí)而治愈。

腹瀉型中毒：由各種食品中不耐熱腸毒素引起，潛伏期在6小時(shí)以上，一般為6～14小時(shí)；癥狀以腹瀉，腹痙攣，而嘔吐卻不常見(jiàn)；病程24～36小時(shí)。第十一頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二1.蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)程序：檢樣25g(ml)+225ml生理鹽水中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)GB/T4789.28-2003做成10-1-10-5的稀釋液選擇性培養(yǎng)基（菌數(shù)測(cè)定）MYP選擇性培養(yǎng)基（分離培養(yǎng)）MYP37℃，18h-24h菌數(shù)計(jì)算營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基36℃

±1℃12h~20h36℃

±1℃12h~20h生長(zhǎng)及菌落觀察染色鏡檢生化試驗(yàn)菌株保存報(bào)告（三）檢測(cè)方法第十二頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二10-1~10-5的稀釋液的制備

每個(gè)稀釋度0.1mL接種于2個(gè)MYP培養(yǎng)基36±1℃

12~20h菌落計(jì)數(shù)36±1℃

12~20h挑取菌落接種肉湯和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（分離培養(yǎng)）證實(shí)試驗(yàn)報(bào)告形態(tài)觀察染色鏡檢培養(yǎng)特性生化特性生化分型第十三頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二

2．菌數(shù)測(cè)定以無(wú)菌操作將檢樣25g或25ml按菌落總數(shù)測(cè)定方式，用滅菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液做成10-1～10-5的稀釋液。取各稀釋液0.1ml，接種在選擇培養(yǎng)基（甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂）平板上，用L形棒涂布于整個(gè)表面，置37℃培養(yǎng)12～20h后，選取菌落數(shù)在30個(gè)左右者進(jìn)行計(jì)數(shù)。蠟樣芽孢桿菌在此培養(yǎng)基上生成的菌落為紅色（表示不發(fā)酵甘露醇）,環(huán)繞有白色至淡粉紅色的暈（表示產(chǎn)生卵磷脂酶）。第十四頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二計(jì)數(shù)后，從中挑取5個(gè)這樣的菌落作證實(shí)試驗(yàn)。根據(jù)試驗(yàn)證實(shí)為蠟樣芽孢桿菌的菌落數(shù)，計(jì)算出該培養(yǎng)皿內(nèi)的蠟樣芽孢桿菌數(shù)，然后乘其稀釋倍數(shù)即得每克或每毫升樣品所含的蠟樣芽孢桿菌數(shù)。第十五頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二計(jì)數(shù)后，從中挑取5個(gè)此種菌落做證實(shí)試驗(yàn)，根據(jù)證實(shí)的蠟樣芽孢桿菌的菌落數(shù)，計(jì)算出該平板上的菌落數(shù)，然后乘其稀釋倍數(shù)，即得每克（毫升）樣品中所含蠟樣芽胞桿菌數(shù)。例如將0.1mL10-4樣品稀釋液涂布于MYP平板上，其可疑菌落為25個(gè)，取5個(gè)鑒定，證實(shí)四個(gè)菌落為蠟樣芽孢桿菌，則1g（mL）檢樣中所含蠟樣芽孢桿菌數(shù)為：選取具有15-150個(gè)典型或可疑蠟樣芽孢桿菌菌落的平板,進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)算同一稀釋度兩個(gè)平板的平均菌落數(shù)。25×4/5×104×10＝2×106第十六頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二

3．分離培養(yǎng)將檢樣或其稀釋液劃線(xiàn)于上述選擇性培養(yǎng)基平板上，置37℃培養(yǎng)12～20h，挑取可疑蠟樣芽孢桿菌的菌落接種于肉湯和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上做純培養(yǎng)，然后做證實(shí)試驗(yàn)。

第十七頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二4．證實(shí)試驗(yàn)（1）形態(tài)觀察本菌應(yīng)為G＋桿菌，寬度在1μm或1μm以上，芽孢呈卵圓形，不突出菌體，多位于菌體中央或稍偏于一端。（2）培養(yǎng)特性本菌在肉湯中生長(zhǎng)混濁，常有菌膜或壁環(huán)，振搖易乳化。瓊脂平板上形成的菌落不透明，表面粗糙，似毛玻璃狀或融蠟狀且邊緣不齊。第十八頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二

（3）生化特性本菌有動(dòng)力；產(chǎn)生卵磷脂酶和酪蛋白酶；過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陽(yáng)性；溶血；不發(fā)酵甘露醇和木糖；能液化明膠和還原硝酸鹽；在厭氧條件下能發(fā)酵葡萄糖。第十九頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二(4)生化分型根據(jù)蠟樣芽孢桿菌對(duì)檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原、淀粉水解、V-P反應(yīng)、明膠液化的試驗(yàn)，分成不同型別，見(jiàn)表1。第二十頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二表1蠟樣芽孢桿菌生化分型型別生化試驗(yàn)檸檬酸鹽利用硝酸鹽還原淀粉水解V-P反應(yīng)明膠液化123456789101112131415＋－＋－－＋＋－－－＋＋－＋＋＋＋＋－－－－＋＋＋＋＋－－－＋＋－＋－－＋－－＋＋－＋－＋＋＋＋＋＋＋＋＋－－－－－－－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋－＋＋第二十一頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二（4）與類(lèi)似菌鑒別本菌與其他類(lèi)似菌的鑒別見(jiàn)表2。第二十二頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二

5.結(jié)果報(bào)告報(bào)告1g（mL）檢樣中所含蠟樣芽孢桿菌數(shù)量[個(gè)/g(mL)]。

第二十三頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)三、食品中蠟樣芽孢桿菌的檢驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?．學(xué)習(xí)蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)的原理和方法。2．了解蠟樣芽孢桿菌形態(tài)特征、培養(yǎng)特性和生化特性。第二十四頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二蠟樣芽孢桿菌為需氧、能產(chǎn)生芽孢的革蘭氏陽(yáng)性桿菌，在自然界分布較廣，食品在正常情況下就可能有此菌存在，因而易從各種食品中檢出。蠟樣芽孢桿菌能發(fā)酵麥芽糖、蔗糖和水楊苷，不發(fā)酵乳糖、甘露醇、木糖、阿拉伯糖、山梨醇和側(cè)金盞花醇,卵磷脂酶和酪蛋白酶，過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陽(yáng)性，溶血，能在24h內(nèi)液化明膠和還原硝酸鹽，在厭氧條件下能發(fā)酵葡萄糖。二、實(shí)驗(yàn)原理第二十五頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二三、實(shí)驗(yàn)方法與步驟1．蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)程序

第二十六頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二2．菌數(shù)測(cè)定以無(wú)菌操作將檢樣25g或25ml按菌落總數(shù)測(cè)定方式，用滅菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液做成10-1～10-5的稀釋液。取各稀釋液0.1ml，接種在選擇培養(yǎng)基（甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂）平板上，用L形棒涂布于整個(gè)表面，置37℃培養(yǎng)12～20h后，選取菌落數(shù)在30個(gè)左右者進(jìn)行計(jì)數(shù)。蠟樣芽孢桿菌在此培養(yǎng)基上生成的菌落為紅色（表示不發(fā)酵甘露醇）,環(huán)繞有白色至淡粉紅色的暈（表示產(chǎn)生卵磷脂酶）。計(jì)數(shù)后，從中挑取5個(gè)這樣的菌落作證實(shí)試驗(yàn)。根據(jù)試驗(yàn)證實(shí)為蠟樣芽孢桿菌的菌落數(shù)，計(jì)算出該培養(yǎng)皿內(nèi)的蠟樣芽孢桿菌數(shù)，然后乘其稀釋倍數(shù)即得每克或每毫升樣品所含的蠟樣芽孢桿菌數(shù)。第二十七頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二將檢樣或其稀釋液劃線(xiàn)于上述選擇性培養(yǎng)基平板上，置37℃培養(yǎng)12～20h，挑取可疑蠟樣芽孢桿菌的菌落接種于肉湯和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上做純培養(yǎng)，然后做證實(shí)試驗(yàn)。3．分離培養(yǎng)第二十八頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二（1）形態(tài)觀察本菌應(yīng)為G＋桿菌，寬度在1μm或1μm以上，芽孢呈卵圓形，不突出菌體，多位于菌體中央或稍偏于一端。（2）培養(yǎng)特性本菌在肉湯