霍奇金淋巴瘤實驗設計課件

研究背景霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’slymphoma，HL，Hodgkin’sdisease，）是惡性淋巴瘤的一個獨特類型。

研究背景其特點為：①臨床上病變往往從一個或一組淋巴結開始，逐漸由鄰近的淋巴結向遠處擴散。原發(fā)于結外淋巴組織的少見。研究背景②瘤組織成分多樣，但HL特異性的病理改變?yōu)椤罅糠磻栽錾谋尘傲馨图毎锌梢娚儆?%Reed-Sternberg細胞（R-S細胞）。這種特殊的瘤巨細胞來源于B淋巴細胞(鏡影細胞)研究背景p53和bcl-2基因突變EB病毒感染但證據均不足，HL的發(fā)病機制尚未明確腫瘤細胞研究背景有研究發(fā)現NF-κB(RelA/P50)的組成性激活是霍奇金淋巴瘤細胞的特點。[1]IκBα作為重要的NF-κB通路抑制因子，在多種瘤細胞中表達量均減少。研究背景將對IκBα激酶（IκBαkinase,IKK）無反應的IκBα突變體導入HRS細胞中可阻斷NF-κB的活化，導致細胞凋亡，說明IκBα在HL發(fā)病機制中有重要作用。[2]研究背景Emmerich等人的研究表明HRS細胞中IκBαmRNA高表達，但在蛋白水平檢測的陽性強度弱，可能與HL中泛素化降解活性增強有關，也可能由IκBα蛋白結構改變導致。[3]用已知IκBα外顯子PCR擴增陽性的標本為模板作陽性對照，用雙蒸水作為陰性對照。但證據均不足，HL的發(fā)病機制RegulationofNF-kappaBactivitybyIkappaB-relatedproteinsinadenocarcinomacells[J].擴增第二外顯子時加引物0．3μl，補所需ddH2O使反應體系達到50μI。巢式聚合酶鏈反應(nestedpolymearsechainreaction,nPCR)也稱套式PCR。為了經濟節(jié)約，可在第2輪擴增時采用半巢式，設計單條引物，另一條引物與第1輪擴增共用，。（藍色-C,紅色-T，綠色-A，黑色-G）EnVision兩步法電泳條帶在同一水平線上。Thankyou！這種特殊的瘤巨細胞來源于B淋巴細胞(鏡影細胞)CD30單抗（Dako公司，克隆號Ber—H2，效價1：20）加相應的二抗，DAB顯色，蘇木精復染，鹽酸乙醇分化，充分水洗。[2]DejardinE,etal.如果片段在800以內，那么隨便進行一個方向就能測出你全部的序列了DAKOEnVision顯色系統(tǒng)是將二抗和酶通過一個多聚葡聚糖骨架聯(lián)接成一個多聚體（即

EnVision）直接放大信號40-50倍，把傳統(tǒng)的二抗、三抗分別孵育合為一次孵育?；羝娼鹆馨土觯℉odgkin’slymphoma，HL，Hodgkin’sdisease，）是惡性淋巴瘤的一個獨特類型。擴增IκBα第三到第六外顯子反應體系：Blood,1999,94(9):3129-34.PCR引物（北京賽百勝公司）研究目的本實驗意在：①了解IκBα基因在HL中突變的情況；②分析經典型HLHRS中IκBα突變的特點、可能造成的蛋白結構異常；③以及這些異常的病理意義，即其與HL發(fā)病的相關性。實驗材料與試劑霍奇金淋巴瘤組織樣本CD30單抗（Dako公司，克隆號Ber—H2，效價1：20）LeicaASLMD激光顯微系統(tǒng)PCR引物（北京賽百勝公司）PCR儀（包括反應體系）DNA測序儀實驗流程CD30免疫組化激光顯微切割和DNA提取IκBα基因擴增PCR產物檢測待測基因外含子測序CD30免疫組化采用EnVision兩步法。將冰凍組織切成6μm厚連續(xù)切片，貼于LeicaPEN膜空白切片上，用含0．05％NP40的丙酮(v／v)固定10min，室溫下自然干燥；CD30免疫組化6％H2O2-甲醇，37℃10min，消除內源性過氧化物酶；加1：20稀釋的一抗；加相應的二抗，DAB顯色，蘇木精復染，鹽酸乙醇分化，充分水洗。激光顯微切割和DNA提取用LeicaASLMD系統(tǒng)逐個切割組織切片上的CD30陽性細胞（切割參數：激光強度37，波長377，速度5，光束直徑8）。將目的細胞從切片上分離，在光壓強作用下被收集到離心管蓋內，每例標本3～6組，每組約25～70個細胞。切割周圍的正常淋巴細胞每例2管，每管約50個細胞。擴增目的基因，上游引物：5’-CACACTGTGCCCATCTACG-3’，下游引物：5’一GGTc1-ITI’GCGGATGTCCAC一3’。

（緩沖體系：10X反應緩沖液2．5μl，MgCL2(25mmol／L)1．5μl，dNTP(10mmoL／L)1．0μl，上游引物(10~μmoL／L)0．5μl，下游引物(10μmol／L)0．5μl，Taq酶(5U／μL)0．3μl，

模板2．0μl，總體積25μl。反應條件：94℃預變性5min，94℃變性1min，55％退火1min，72oC延伸1min，共40個循環(huán)，72℃延伸7min，至4℃結束。

以雙蒸水代替DNA模板作為陰性對照。）IκBα基因擴增對HRS細胞、背景中反應性增生細胞的IκBα6個外顯子進行半巢式PCR擴增。用已知IκBα外顯子PCR擴增陽性的標本為模板作陽性對照，用雙蒸水作為陰性對照。PCR擴增反應體系擴增IκBα第一和第二外顯子反應體系：10XPCR緩沖液5．0μ1，MgC1：(25mmoi／L)5．0μIxl，dNTPs(10mmol／μL)2．0μl，DMSO2．0μl，TaqDNA聚合酶(5U／pJ)1．0μl，DNA模板(0．5g／IL1)2．0μl，擴增第一外顯子時加引物1μIxl；擴增第二外顯子時加引物0．3μl，補所需ddH2O使反應體系達到50μI。反應條件：預變性95℃，5min，繼而95℃變性50s，65℃退火30s，72℃延伸90S，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。第二輪，反應體系50μl，擴增第一和第二外顯子時加引物1．25μl。擴增第一外顯子時另加2μlDMSO(擴增第二外顯子時不加DMSO)。反應條件同第一輪。擴增IκBα第三到第六外顯子反應體系：

第一輪，l0×PCR緩沖液5．0μIxl，MgCL2(25mmol／L)4．0l，dNTPs(10mmol／L)2．0l，TaqDNA聚合酶(5U／μL)1．0μl，DNA模板(0．5μg／

μL)2．0μl，引物1μl。反應條件同擴增一、二外顯子者，但退火溫度為63℃。第二輪，反應體系同第一輪，但擴增引物為1．25μL。反應條件為預變性95℃，5min，繼而95℃變性50S，65℃退火30S，72oC延伸90S，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。）PCR產物檢測取5μlPCR產物，用2％瓊脂糖凝膠電泳分析，穩(wěn)流120mA，20min。紫外燈下觀察。IκBα的6個外顯子陽性擴增產物大小分別為exon1(476bp)、exon2(433bp)、exon3(399bp)、exon4(184bp)、exon5(381bp)和exon6(441bp)。預期結果——電泳電泳條帶不在同一水平線上——基因明顯突變。預期結果——電泳電泳條帶在同一水平線上。沒有突變點突變或分子量很小的堿基序列突變待測基因外含子測序每管DNA樣品都要擴增2次，使用上海博亞公司ABI377DNA測序儀對PCR陽性產物進行直接測序。擴增第一外顯子時另加2μlDMSO(擴增第二外顯子時不加DMSO)。第二輪，反應體系同第一輪，但擴增引物為1．25μL。IκBα基因沒有參與霍奇金淋巴瘤的發(fā)生和惡化其特點為：①臨床上病變往往從一個或一組淋巴結開始，逐漸由鄰近的淋巴結向遠處擴散。OverexpressionofIkappaBalphawithoutinhibitionofNF-kappaBactivityandmutationsintheIkappaBalphageneinReed-Sternbergcells[J].巢式聚合酶鏈反應(nestedpolymearsechainreaction,nPCR)也稱套式PCR。6％H2O2-甲醇，37℃10min，消除內源性過氧化物酶；LeicaASLMD激光顯微系統(tǒng)電泳條帶在同一水平線上。第二輪，反應體系同第一輪，但擴增引物為1．25μL。點突變或分子量很小的堿基序列突變[2]DejardinE,etal.EnVision兩步法Thankyou！擴增第一外顯子時另加2μlDMSO(擴增第二外顯子時不加DMSO)。每管DNA樣品都要擴增2次，使用上海博亞公司ABI377DNA測序儀對PCR陽性產物進行直接測序。Blood,1999,94(9):3129-34.C、D分別為沒有突變的正、反向測序Emmerich等人的研究表明HRS細胞中IκBαmRNA高表達，但在蛋白水平檢測的陽性強度弱，可能與HL中泛素化降解活性增強有關，也可能由IκBα蛋白結構改變導致。電泳條帶不在同一水平線上——基因明顯突變。一個是正向引物（上游引物），用它來測序就是正向測序(從上游往下測序)，也就是5'到3'預期結果——測序堿基序列出現改變圖A-箭頭處為T-A突變（TGA為終止密碼）圖B-反向測序證實（藍色-C,紅色-T，綠色-A，黑色-G）預期結果堿基序列沒有突變C、D分別為沒有突變的正、反向測序預期結果腫瘤細胞IκBα基因突變率高，而反應性增生的淋巴細胞IκBα基因沒有突變。腫瘤細胞和反應性增生的淋巴細胞的IκBα基因都沒有突變。腫瘤細胞和反應性增生的淋巴細胞的IκBα的突變率都增加IκBα基因參與霍奇金淋巴瘤的發(fā)生和惡化有關IκBα基因沒有參與霍奇金淋巴瘤的發(fā)生和惡化估計不會發(fā)生這種情況，如若發(fā)生則需要進一步研究參考文獻[1]BargouR.C,etal.Constitutivenuclearfactor-kappaB-RelAactivationisrequiredforproliferationandsurvivalofHodgkin’sdiseasetumorcells[J].JClinInvest,1997,100(12):2961-9.[2]DejardinE,etal.RegulationofNF-kappaBactivitybyIkappaB-relatedproteinsinadenocarcinomacells[J].Oncogene,1999,18(16):2567-77.[3]EmmerichF,etal.OverexpressionofIkappaBalphawithoutinhibitionofNF-kappaBactivityandmutationsintheIkappaBalphageneinReed-Sternbergcells[J].Blood,1999,94(9):3129-34.……Thankyou！巢式PCR巢式聚合酶鏈反應(nestedpolymearsechainreaction,nPCR)也稱套式PCR。在這種技術中，首先用一對外引物進行第1輪PCR，然后再使用第1對引物擴增的DNA序列內部的一對引物再次擴增，所以稱為巢式PCR。為了經濟節(jié)約，可在第2輪擴增時采用半巢式，設計單條引物，另一條引物與第1輪擴增共用，。反向測序一個是正向引物（上游引物），用它來測序就是正向測序(從上游往下測序)，也就是5'到3'另外一個就是反向引物（下游引物），用它來測序就是反向測序（從下游往上測序），也就是3'到5'如果片段在800以內，那么隨便進行一個方向就能測出你全部的序列了如果在800-1600之間，那么就要同時進行正反向測序才能測出你的片段（因為一個方向上的測序結果最好也只能保證800bp以內是可信的）10XPCR緩沖液5．0μ1，MgC1：(25mmoi／L)5．0μIxl，dNTPs(10mmol／μL)2．0μl，DMSO2．0μl，TaqDNA聚合酶(5U／pJ)1．0μl，DNA模板(0．5g／IL1)2．0μl，擴增第一外顯子時加引物1μIxl；擴增第二外顯子時加引物0．3μl，補所需ddH2O使反應體系達到50μI。（緩沖體系：10X反應緩沖液2．5μl，MgCL2(25mmol／L)1．5μl，dNTP(10mmoL／L)1．0μl，上游引物(10~μmoL／L)0．5μl，下游引物(10μmol／L)0．5μl，Taq酶(5U／μL)0．3μl，Constitutivenuclearfactor-kappaB-RelAactivationisrequiredforproliferationandsurvivalofHodgkin’sdiseasetumorcells[J].用已知IκBα外顯子PCR擴增陽性的標本為模板作陽性對照，用雙蒸水作為陰性對照。IκBα作為重要的NF-κB通路抑制因子，在多種瘤細胞中表達量均減少。為了經濟節(jié)約，可在第2輪擴增時采用半巢式，設計單條引物，另一條引物與第1輪擴增共用，。電泳條帶在同一水平線上。6％H2O2-甲醇，37℃10min，消除內源性過氧化物酶；Blood,1999,94(9):3129-34.霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’slymphoma，HL，Hodgkin’sdisease，）是惡性淋巴瘤的一個獨特類型。模板2．0μl，總體積25μl。有研究發(fā)現NF-κB(RelA/P50)的組成性激活是霍奇金淋巴瘤細胞的特點。這種特殊的瘤巨細胞來源于B淋巴細胞(鏡影細胞)擴增IκBα第三到第六外顯子反應體系：（緩沖體系：10X反應緩沖液2．5μl，MgCL2(25mmol／L)1．5μl，dNTP(10mmoL／L)1．0μl，上游引物(10~μmoL／L)0．5μl，下游引物(10μmol／L)0．5μl，Taq酶(5U／μL)0．3μl，C、D分別為沒有突變的正、反向測序但證據均不足，HL的發(fā)病機制Blood,1999,94(9):3129-34.[3]EmmerichF,etal.

EnVision兩步法DAKOEnVision顯色系統(tǒng)是將二抗和酶通過一個多聚葡聚糖骨架聯(lián)接成一個多聚體（即

EnVision）直接放大信號40-50倍，把傳統(tǒng)的二抗、三抗分別孵育合為一次孵育。特點：敏感、省時、方便、背景低（避免了內源性生物素干擾）。

CD30免疫組化采用EnVision兩步法。將冰凍組織切成6μm厚連續(xù)切片，貼于LeicaPEN膜空白切片上，用含0．05％NP40的丙酮(v／v)固定10min，室溫下自然干燥；CD30免疫組化6％H2O2-甲醇，37℃10min，消除內源性過氧化物酶；加1：20稀釋的一抗；加相應的二抗，DAB顯色，蘇木精復染，鹽酸乙醇分化，充分水洗。預期結果——電泳電泳條帶在同一水平線上。沒有突變點突變或分子量很小的堿基序列突變參考文獻[1]BargouR.C,etal.Constitutivenuclearfactor-kappaB-RelAactivationisrequiredforproliferationandsurvivalofHodgkin’sdiseasetumorcells[J].JClinInvest,1997,100(12):2961-9.[2]DejardinE,etal.RegulationofNF-kappaBactivitybyIkappaB-relatedproteinsinadenocarcinomacells[J].Oncogene,1999,18(16):2567-77.[3]EmmerichF,etal.OverexpressionofIkappaBalphawithoutinhibitionofNF-kappaBactivityandmutationsintheIkappaBalphageneinReed-Sternbergcells[J].Blood,1999,94(9):3129-34.……Thankyou！Constitutivenuclearfactor-kappaB-RelAactivationisrequiredforproliferationandsurvivalofHodgkin’sdiseasetumorcells[J].CD30單抗（Dako公司，克隆號Ber—H2，效價1：20）PCR引物（北京賽百勝公司）6％H2O2-甲醇，37℃10min，消除內源性過氧化物酶；如果在800-1600之間，那么就要同時進行正反向測序才能測出你的片段（因為一個方向上的測序結果最好也只能保證800bp以內是可信的）電泳條帶在同一水平線上。加相應的二抗，DAB顯色，蘇木精復染，鹽酸乙醇分化，充分水洗。第二輪，反應體系同第一輪，但擴增引物為1．25μL。6％H2O2-甲醇，37℃10min，消除內源性過氧化物酶；IκBα作為重要的NF-κB通路抑制因子，在多種瘤細胞中表達量均減少。電泳條帶在同一水平線上。為了經濟節(jié)約，可在第2輪擴增時采用半巢式，設計單條引物，另一條引物與第1輪擴增共用，。DAKOEnVision顯色系統(tǒng)是將二抗和酶通過一個多聚葡聚糖骨架聯(lián)接成一個多聚體（即

EnVision）直接放大信號40-50倍，把傳統(tǒng)的二抗、三抗分別孵育合為一次孵育。腫瘤細胞IκBα基因突變率高，而反應性增生的淋巴細胞IκBα基因沒有突變。其特點為：①臨床上病變往往從一個或一組淋巴結開始，逐漸由鄰近的淋巴結向遠處擴散。[1]BargouR.以雙蒸水代替DNA模板作為陰性對照。擴增IκBα第三到第六外顯子反應體系：第一輪，l0×PCR緩沖液5．0μIxl，MgCL2(25mmol／L)4．0l，dNTPs(10mmol／L)2．0l，TaqDNA聚合酶(5U／μL)1．0μl，DNA模板(0．5μg／μL)2．0μl，引物1μl。Thankyou！為了經濟節(jié)約，可在第2輪擴增時采用半巢式，設計單條引物，另一條引物與第1輪擴增共用，。點突變或分子量很小的堿基序列突變IκBα的6個外顯子陽性擴增產物大小分別為exon1(476bp)、exon2(433bp)、exon3(399bp)、exon4(184bp)、exon5(381bp)和exon6(441bp)。[3]EmmerichF,etal.C、D分別為沒有突變的正、反向測序擴增目的基因，上游引物：5’-CACACTGTGCCCATCTACG-3’，下游引物：5’一GGTc1-ITI’GCGGATGTCCAC一3’。但證據均不足，HL的發(fā)病機制加相應的二抗，DAB顯色，蘇木精復染，鹽酸乙醇分化，充分水洗。霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’slymphoma，HL，Hodgkin’sdisease，）是惡性淋巴瘤的一個獨特類型。6％H2O2-甲醇，37℃10min，消除內源性過氧化物酶；①了解IκBα基因在HL中突變的情況；RegulationofNF-kappaBactivitybyIkappaB-relatedproteinsinadenocarcinomacells[J].為了經濟節(jié)約，可在第2輪擴增時采用半巢式，設計單條引物，另一條引物與第1輪擴增共用，。擴增第一外顯子時另加2μlDMSO(擴增第二外顯子時不加DMSO)。DAKOEnVision顯色系統(tǒng)是將二抗和酶通過一個多聚葡聚糖骨架聯(lián)接成一個多聚體（即

EnVision）直接放大信號40-50倍，把傳統(tǒng)的二抗、三抗分別孵育合為一次孵育。腫瘤細胞IκBα基因突變率高，而反應性增生的淋巴細胞IκBα基因沒有突變。Constitutivenuclearfactor-kappaB-RelAactivationisrequiredforproliferationandsurvivalofHodgkin’sdiseasetumorcells[J].IκBα基因沒有參與霍奇金淋巴瘤的發(fā)生和惡化第二輪，反應體系50μl，擴增第一和第二外顯子時加引物1．25μl。為了經濟節(jié)約，可在第2輪擴增時采用半巢式，設計單條引物，另一條引物與第