其它的分子診斷檢測(cè)技術(shù)

其它的分子診斷技術(shù)

檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院周蘭分子診斷學(xué)當(dāng)前第1頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)可以檢測(cè)基因突變的方法及其優(yōu)缺點(diǎn)當(dāng)前第2頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)本章內(nèi)容1

基因突變相關(guān)知識(shí)和檢測(cè)技術(shù)的復(fù)習(xí)和總結(jié)2基因變異檢測(cè)技術(shù)3

脈沖電場(chǎng)凝膠電泳4

分子影像當(dāng)前第3頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)1

基因突變相關(guān)知識(shí)和檢測(cè)技術(shù)的復(fù)習(xí)和總結(jié)

1-1染色體突變（chromosomemutation）指染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量的變異（包括：缺失、重復(fù)、倒位和易位），致染色體遺傳病

**涉及的基因較多

**可經(jīng)光學(xué)顯微鏡分析有絲分裂中期染色體來檢出**可在細(xì)胞的有絲分裂間期用標(biāo)記探針檢出（染色體原位雜交）當(dāng)前第4頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)有絲分裂各期特征間期：DNA復(fù)制以及有關(guān)蛋白質(zhì)合成前期：膜仁消失現(xiàn)兩體。即核膜核仁消失，出現(xiàn)紡錘體染色體中期：形數(shù)清晰赤道齊。即染色體形態(tài)、數(shù)目清晰，整齊分布在赤道板附近后期：點(diǎn)裂數(shù)增勻兩極。即著絲點(diǎn)分裂染色體均勻分布在細(xì)胞兩極末期：兩消兩現(xiàn)重開始。

即紡錘體、染色體消失，核膜核仁出現(xiàn)，重新開始分裂當(dāng)前第5頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)細(xì)胞分裂的中期：形數(shù)清晰赤道齊

染色體形態(tài)、數(shù)目清晰，整齊分布在赤道板附近

紡錘體清晰可見。這時(shí)候，每條染色體的著絲點(diǎn)的兩側(cè)，都有紡錘絲附著在上面，紡錘絲牽引著染色體運(yùn)動(dòng)，使每條染色體的著絲點(diǎn)排列在細(xì)胞中央的赤道板上。分裂中期的細(xì)胞，染色體的形態(tài)比較固定，數(shù)目比較清晰，便于觀察清楚當(dāng)前第6頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)Dual-colorFISH檢測(cè)白血病細(xì)胞間期核的費(fèi)城染色體

BCR基因呈紅色，ABL基因呈綠色，融合基因呈黃色

融合基因費(fèi)城染色體（BCR-ABL）的檢測(cè)當(dāng)前第7頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)顯示這段附加的染色體來源于2號(hào)染色體(M-FISH)9號(hào)染色體短臂上的附加段來自？（Rx-FISH)細(xì)胞分裂中期的染色體當(dāng)前第8頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)

1

相關(guān)知識(shí)和檢測(cè)技術(shù)的復(fù)習(xí)和總結(jié)

1-2缺失、重復(fù)和插入（涉及多個(gè)堿基）

引起移碼突變，即DNA片段中某一位點(diǎn)插入或丟失一或幾個(gè)（非3或非3的倍數(shù)）堿基時(shí)，可致其后的全部編碼順序發(fā)生錯(cuò)位的一種突變1-3點(diǎn)突變（pointmutation）

是腫瘤和遺傳病發(fā)生的主要分子機(jī)制(癌基因激活和抗癌基因失活等），是基因突變分析的主要內(nèi)容當(dāng)前第9頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)點(diǎn)突變的類型點(diǎn)突變：即單堿基替換（singlebasesubstitution）指由單個(gè)堿基改變發(fā)生的突變，包括：*轉(zhuǎn)換（transition)：一種嘌呤被另一種嘌呤取代或一種嘧啶被另一種嘧啶取代*顛換（transversion）：嘌呤取代嘧啶或嘧啶取代嘌呤

當(dāng)前第10頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)

1-4點(diǎn)突變的檢測(cè)方法

1）PCR+探針：PCR-ASO等

2）PCR+其它技術(shù)：PCR-SSCP,PCR-RFLP3）連接酶鏈反應(yīng)（LCR）

4）PCR+DNA芯片技術(shù)

5）PCR+DNA測(cè)序:實(shí)行單分子測(cè)序后，勿需PCR

..6)

PCR擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)當(dāng)前第11頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)

鐮貧的ASO探針法檢測(cè)

一對(duì)探針（20bp左右），標(biāo)記后用于雜交檢測(cè)

等位基因特異性寡核苷酸探針雜交

（allele-specific-oligonucleatide,ASO）當(dāng)前第12頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)突變型遺傳病的直接基因診斷產(chǎn)前診斷當(dāng)前第13頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)

SSCP

當(dāng)前第14頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)

RFLP：基因結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致酶切位點(diǎn)數(shù)目變化，因此酶切產(chǎn)生的片段的長度和數(shù)目也隨之改變；通過與正常對(duì)照組比較，即可推斷被分析的目的片段是否有結(jié)構(gòu)改變AG總長10kb酶切后3和7kb當(dāng)前第15頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)

圖8-14LCR反應(yīng)原理示意圖優(yōu)勢(shì)：能夠準(zhǔn)確分析基因序列中單個(gè)堿基突變。因此，在遺傳病、腫瘤診斷、細(xì)菌和病毒的分型及致病力的鑒定中具有重要作用LCR當(dāng)前第16頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)當(dāng)前第17頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)遺傳性耳聾基因檢測(cè)芯片（圖）

乙型肝炎病毒耐多藥基因突變檢測(cè)芯片

耐藥性結(jié)核桿菌基因突變檢測(cè)芯片當(dāng)前第18頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)2

基因變異檢測(cè)技術(shù)2-1PCR擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)2-2寡核苷酸連接實(shí)驗(yàn)2-3溫度梯度凝膠電泳和變性凝膠電泳2-4變性高效液相色譜法(自學(xué)）2-5

錯(cuò)配接合蛋白質(zhì)截短測(cè)試法當(dāng)前第19頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)

1989年在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的、通過PCR和凝膠電泳檢測(cè)DNA中各種已知點(diǎn)突變的新方法

PCRamplificationrefractorymutationsystem

又：PCRamplifcationofspecificalleles,PASA

alleles-specificPCR,ASPCR

2-1PCR擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)(PCR-ARMS)當(dāng)前第20頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)1)基本原理

TaqDNA聚合酶無3’－5’外切酶活性，不能糾正3’端的錯(cuò)配，因此對(duì)于Taq酶的擴(kuò)增，3’端必須完全配對(duì)，以實(shí)現(xiàn)高效擴(kuò)增當(dāng)PCR的引物的3’端與模板之間存在錯(cuò)配時(shí)，PCR的擴(kuò)增效率極差，甚至完全不擴(kuò)增

即“擴(kuò)增阻礙”2-1PCR擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)(PCR-ARMS)

當(dāng)前第21頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)

1-1PCR擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)(PCR-ARMS)

設(shè)計(jì)兩個(gè)5’端引物，突變點(diǎn)位于其3’端A:與正常DNA互補(bǔ)（其3’端與突變基因不匹配)B:與突變DNA互補(bǔ)（其3’端與正?；虿黄ヅ?設(shè)計(jì)一個(gè)公用的3’端引物（C）利用這2對(duì)引物分別擴(kuò)增樣本（A,C/B,C）然后,電泳檢測(cè)當(dāng)前第22頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)當(dāng)前第23頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)當(dāng)前第24頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)

1-1PCR擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)(PCR-ARMS)

結(jié)果：

*突變引物(B,C)擴(kuò)增突變基因，正?；驍U(kuò)增受阻*正常引物(A,C)擴(kuò)增正常基因，突變基因擴(kuò)增受阻當(dāng)前第25頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)

結(jié)果判讀當(dāng)前第26頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)2）應(yīng)用（1）檢測(cè)單個(gè)位點(diǎn)的突變（2）檢測(cè)多個(gè)位點(diǎn)的突變：借鑒多重PCR原理，可同時(shí)檢測(cè)4-6種等位基因突變位點(diǎn)

（3）基因分型（純合突變或雜合突變）

當(dāng)前第27頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)（1）檢測(cè)的特異性依賴于反應(yīng)條件的優(yōu)化，即不允許引物與靶DNA在錯(cuò)配時(shí)出現(xiàn)延伸

可通過提高復(fù)性（退火）時(shí)引物與模板雜交的嚴(yán)格度來提高檢測(cè)的特異性

（2）可借助多重PCR同時(shí)檢測(cè)多個(gè)點(diǎn)突變，不用放射性標(biāo)記，不需要昂貴的試劑及復(fù)雜的檢測(cè)系統(tǒng)，是多點(diǎn)突變檢測(cè)的理想方法

（3）缺點(diǎn)：只能檢測(cè)已知的基因突變（或多態(tài)性）

3)

方法的特點(diǎn)當(dāng)前第28頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)2-2寡核苷酸連接實(shí)驗(yàn)（OLA)1）原理：

設(shè)計(jì)兩個(gè)相鄰的寡核苷酸探針（約20nt），其相鄰的位點(diǎn)正好是已知的突變位點(diǎn)，探針與靶序列雜交后頭尾相接（5’－3’方向）

如果探針和靶序列完全互補(bǔ)，DNA連接酶就會(huì)將兩探針通過磷酸二酯鍵共價(jià)連接起來

如果探針相鄰之處有一個(gè)堿基不匹配，則連接效率大大降低，即連接阻遏當(dāng)前第29頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)2-2寡核苷酸連接實(shí)驗(yàn)1）原理:

需要3個(gè)探針一個(gè)通用探針（它可與靶基因完全互補(bǔ)雜交）一個(gè)針對(duì)正常序列的探針（只與正常序列匹配、結(jié)合）一個(gè)針對(duì)突變序列的探針（只與突變序列匹配、結(jié)合）通用探針+與上述2種探針在連接酶的作用下，頭尾相接，形成長鏈（2個(gè)探針長度之和）當(dāng)前第30頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)野生型等位基因的DNA變性為單鏈DNA，

等位基因特異探針和通用探針分別與之雜交（1）野生型等位基因特異探針和通用探針能夠與正常靶序列完全互補(bǔ)，然后連接酶將它們連接成一條長鏈（2）突變型等位基因探針與正常靶序列無法完全互補(bǔ)，因此連接酶不能將它與通用探針連接，故僅短鏈（3）如果2個(gè)探針的反應(yīng)體系都出現(xiàn)連接反應(yīng)產(chǎn)物（長鏈），說明什么？當(dāng)前第31頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)通用探針（AGAT）野生型等位基因特異探針(ATTGA)突變型等位基因特異探針(ATTGG)20bp40bp通用探針野生型者野生型者雜合子當(dāng)前第32頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)

2-2寡核苷酸連接實(shí)驗(yàn)

1）原理

常用連接酶是T4DNA連接酶和TthDNA連接酶如果采用耐熱的連接酶，則：（1）變性、復(fù)性和連接可以循環(huán)進(jìn)行，連接產(chǎn)物呈線性增長

（2）同時(shí)，雜交的嚴(yán)格度也因雜交溫度提高而提高，檢測(cè)特異性得以提高當(dāng)前第33頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)2-2寡核苷酸連接實(shí)驗(yàn)2）應(yīng)用直接檢測(cè)靶序列欲提高檢測(cè)靈敏度時(shí)，也可先擴(kuò)增靶序列目前OLA被廣泛用于多種遺傳病及常見病的分子檢測(cè)

當(dāng)前第34頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)遺傳病

病因α1－抗胰蛋白酶缺乏癥Aspartylglycosaminuria（AGU）β－地中海貧血癥鐮狀細(xì)胞貧血癥芬蘭型先天性腎病綜合征囊性纖維性病變家族性高膽固醇血癥

遺傳性血色病嬰兒型神經(jīng)元蠟樣質(zhì)脂褐質(zhì)沉積病中鏈脂酰輔酶A脫氫酶缺乏癥甾體21位羥化酶缺乏癥缺乏α1－抗胰蛋白酶活性缺乏糖基天門冬酰胺酶活性β－球蛋白合成減少紅細(xì)胞變形膜蛋白缺乏氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷低密度脂蛋白（LDL）受體功能受損或缺乏載脂蛋白B100鐵代謝缺陷缺乏棕櫚酰蛋白硫酯酶活性脂肪酸氧化功能紊亂氫化可的松和醛固酮合成缺陷應(yīng)用PCR-OLA進(jìn)行分子檢測(cè)的遺傳病

當(dāng)前第35頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn):（1）PCR-OLA檢測(cè)的特異性高，影響因素少，不容易產(chǎn)生假陰性和假陽性

（2）利用耐熱連接酶可循環(huán)進(jìn)行連接反應(yīng)，以使信號(hào)得到放大，進(jìn)一步增強(qiáng)靈敏度

（3）PCR-OLA可一次檢測(cè)多個(gè)變異

（位于一或幾個(gè)等位基因內(nèi)）

3）方法學(xué)評(píng)價(jià)當(dāng)前第36頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)2-2寡核苷酸連接實(shí)驗(yàn)

3）方法學(xué)評(píng)價(jià)

缺點(diǎn)（1）最大缺點(diǎn)就是整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程需要多相參與（2）需要PCR擴(kuò)增以達(dá)到檢測(cè)限，限制了該方法的規(guī)模（3）多重PCR易產(chǎn)生非特異產(chǎn)物，致其重現(xiàn)性不夠當(dāng)前第37頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)

2-3溫度梯度凝膠電泳

(temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE)

1）基本原理

（1）DNA的Tm值有序列依賴性，故在一定溫度時(shí)其解鏈的程度由Tm決定（2）DNA的突變會(huì)改變其Tm值（3）TGGE時(shí)：不同Tm值的分子將在不同溫度的凝膠位置發(fā)生解鏈（4）部分解鏈后呈復(fù)雜分枝構(gòu)象的DNA分子的遷移率明顯降低，終致不同分子在凝膠的不同位置形成條帶

當(dāng)前第38頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)

2）PCR產(chǎn)物突變的檢測(cè)原理

（1）雜合子的PCR產(chǎn)物中含有四種雙鏈分子

兩種同源雙鏈DNA分子：wt1/wt2，mt1/mt2

兩種為異源雙鏈分子：wt1/mt2，mt1/wt2Wt:wildtype;mt:mutanttype當(dāng)前第39頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)wt1:ATTGGCCAGTTACCATT(wt1/wt2)wt2:

TAACCGGTCAATGGTAAmt1:ATTGGCAAGTTACCATT(mt1/mt2)mt2:TAACCGTTCAATGGTAAwt1:ATTGGCCAGTTACCATT(wt1/mt2)mt2:TAACCGTTCAATGGTAAmt1:

ATTGGCAAGTTACCATT

(mt1/wt2)wt2:

TAACCGGTCAATGGTAAC當(dāng)前第40頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)2）PCR產(chǎn)物突變的檢測(cè)原理（2）2個(gè)同源雙鏈分子由于序列不同，分子的Tm值不同，其解鏈速度和遷移率不同，從而形成不同的條帶，但是，其相對(duì)位置不定，取決于變異對(duì)Tm值的影響：上還是下調(diào)（3）異源雙鏈分子由于含有錯(cuò)配堿基和突出結(jié)構(gòu)，致含有該突變的“解鏈區(qū)域”的Tm值顯著降低，電泳時(shí)，其位置總是位于同源分子之上當(dāng)前第41頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)TGGE突變檢測(cè)原理正常人：3和4，只有野生型等位基因（wt/wt,d）突變純合子：2，只有變異等位基因的同源雙鏈帶（mt/mt,c）

雜合子：1、5和6（除d外，還有c及異源雙鏈帶（wt/mt,a

和mt/wt,b）當(dāng)前第42頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)

2-4變性梯度凝膠電泳

(denaturing-gradientgelelectrophoresis,DGGE)1）原理：20世紀(jì)80年代初誕生

雙鏈DNA在變性因素線性增加的梯度凝膠中電泳的一種實(shí)驗(yàn)，其變性方式：加熱（常恒定在60℃）和固定比率的甲酰胺（0－40％）、尿素（0－7M）這些梯度變性的作用相當(dāng)于TGGE中的溫度梯度的作用，使不同DNA在不同的凝膠部位發(fā)生解鏈，引起遷移率下降，從而將不同的DNA分子分離

當(dāng)前第43頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)2）DGGE法分析PCR產(chǎn)物的特點(diǎn)（1）如突變發(fā)生在最先解鏈的DNA區(qū)，檢出率可達(dá)100％

***為提高其檢出率，可人為地加入一個(gè)高熔點(diǎn)區(qū)——GC夾

GCclamp：就是在一側(cè)引物的5′端加上一個(gè)30~40bp的GC結(jié)構(gòu)，這樣在PCR產(chǎn)物的一側(cè)可產(chǎn)生一個(gè)高熔點(diǎn)區(qū)，使突變區(qū)Tm處于相對(duì)低水平而先解鏈，此舉可提高檢出率至近100%

（2）檢測(cè)片段長度可達(dá)1kb，尤其適用于100~500bp的片段（3）不需同位素?fù)饺耄?）操作簡(jiǎn)便、快速（24小時(shí)內(nèi)）（5）重復(fù)性好但是，該方法需要特殊的儀器，而且合成帶GC夾的引物也比較昂貴

當(dāng)前第44頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)DGGE/TGGE的方法學(xué)評(píng)價(jià)

**均有商品化的電泳裝置，該法一經(jīng)建立，操作也較簡(jiǎn)便，適合于大樣本的檢測(cè)篩選

**目前主要用于檢測(cè)基因突變所致疾病，尤其是只有一個(gè)等位基因突變引起的疾病

因?yàn)殡s合子比純合子多3條帶，很容易相互區(qū)分當(dāng)前第45頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)DGGE/TGGE方法學(xué)評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)：

*檢測(cè)已知突變的靈敏度都接近100％*適合于檢測(cè)突變頻率在50％以下的稀有變異缺點(diǎn)：

只能檢測(cè)較低Tm的“解鏈區(qū)域”中的突變。為什么？

基因突變頻率：所觀察到的突變細(xì)胞數(shù)與存活細(xì)胞數(shù)之比值當(dāng)前第46頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)**一個(gè)DNA分子中有幾個(gè)解鏈區(qū)**各個(gè)解鏈區(qū)有不同的Tm值**一旦溫度到達(dá)最低Tm值解鏈區(qū)的Tm，則該分子就形成部分雙鏈的分枝結(jié)構(gòu)，其電泳遷移率急劇降低，致該分子很難“跑”到遠(yuǎn)處的高溫度區(qū)。因此，如果變異在高Tm區(qū)，就難以檢測(cè)**同時(shí)，較高溫度解鏈的區(qū)一旦解鏈，常常導(dǎo)致DNA分子的完全解鏈，成單鏈分子，而小的變異對(duì)單鏈分子之間的電泳遷移率的影響不大當(dāng)前第47頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)2-5變性高效液相色譜法(DHPLC)

是目前最靈敏的檢測(cè)基因變異的方法

&靈敏、自動(dòng)化、高通量，并可檢測(cè)各種類型的突變

&2-5分鐘可以檢測(cè)出1.5kb的分子中的單核苷酸替代、小片段缺失或插入等基因變異

&廣泛用于人類疾病的基因突變檢測(cè)及SNP的篩查

當(dāng)前第48頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)當(dāng)前第49頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)

(1)DHPLC的分離系統(tǒng)

@@固定相：柱填料（電中性、疏水性）

==惰性物（碳-18烷烴鏈）+聚苯乙烯-二乙烯基苯（無孔微球體)

@@橋分子：既有疏水性又帶正電荷的TEAA，是DNA片段與填料之間的橋分子@@流動(dòng)相：不同濃度的有機(jī)溶劑乙腈，逐步洗脫不同的DNA片段；洗脫后的DNA通過紫外檢測(cè)，不需電泳

1）DHPLC的基本原理TEAA:三乙基銨醋酸鹽；離子對(duì)試劑；通過疏水基團(tuán)與填料發(fā)生反應(yīng)；再借其正電荷與DNA反應(yīng)當(dāng)前第50頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)當(dāng)前第51頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)（2）DHPLC工作模式①當(dāng)柱溫<50℃時(shí),為非變性分離：雙鏈分子被洗脫的順序完全取決于其分子鏈的長度（鏈長，帶負(fù)電荷多，與固定相-TEAA的結(jié)合越牢，保留時(shí)間越長）②當(dāng)柱溫>70℃時(shí)，為完全變性分離（為單鏈分子）：順序取決于分子的堿基組成和片段長度③當(dāng)70℃>柱溫>50℃時(shí),為部分變性分離：雜合雙鏈的洗脫順序是AC、GT、AT和GC，純合雙鏈最后下來當(dāng)前第52頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)DHPLC對(duì)單鏈DNA分子的分離順序

對(duì)于只有3’端一個(gè)核苷酸差異的四種可能的同質(zhì)異構(gòu)體的保留時(shí)間的順序?yàn)椋?/p>

C

<G

<A

<T當(dāng)前第53頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)①雜合突變時(shí)，細(xì)胞中有2個(gè)不同的等位基因，野生型和突變型；將其擴(kuò)增、變性后緩慢退火，可產(chǎn)生4種雙鏈分子（2個(gè)同源、2個(gè)異源）；DHPLC在不同的分離條件下可以將這4者進(jìn)行完美的分離（3）檢測(cè)突變的原理：異源雙鏈分子的形成！當(dāng)前第54頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)②異源雙鏈分子熱穩(wěn)定性差（不完全配對(duì)），與固定相的親和力較弱，較同源雙鏈分子先被洗脫下來

異源雙鏈的形成及DHPLC分離當(dāng)前第55頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)③雜合雙鏈分子的出峰時(shí)間：由堿基對(duì)的熱穩(wěn)定性決定

AC<GT<AT<GC④純合雙鏈分子最后出峰

因此，當(dāng)分離條件合適時(shí)，可出現(xiàn)四個(gè)峰當(dāng)前第56頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)（3）DHPLC檢測(cè)突變的原理基于未解鏈和部分解鏈的雙鏈DNA具有不同保留的性質(zhì)錯(cuò)配位點(diǎn)無氫鍵形成，在加熱變性的條件下，異源雙鏈DNA分子就更易于解鏈形成Y形結(jié)構(gòu)，與固定相的結(jié)合能力降低。當(dāng)流動(dòng)相中乙腈濃度梯度增大時(shí)，異源雙鏈將先于同源雙鏈被洗脫出來帶有突變序列的樣品呈現(xiàn)出異源雙鏈和同源雙鏈混合物的峰形特點(diǎn)不含突變序列的樣品則只有同源雙鏈的峰形據(jù)此可檢測(cè)出含有單個(gè)堿基的置換、插入或缺失的異源雙鏈片段當(dāng)前第57頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)當(dāng)前第58頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)（1）與各種電泳法的比較

相對(duì)于SSCP、TGGE/DGGE—*DHPLC的檢測(cè)突變片段較長（150bp～600bp）

*檢出率高，可達(dá)到100％*勿需特殊的樣本處理及繁瑣的設(shè)計(jì)

2）DHPLC的特點(diǎn)當(dāng)前第59頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)2）DHPLC的特點(diǎn)（2）檢測(cè)的靈敏度高于DNA測(cè)序

**頻率>20%的變異：直接測(cè)序的檢出率為80％

DHPLC的檢出率可達(dá)到100％

**頻率<20%的突變，測(cè)序方法很難檢測(cè)，而DHPLC可檢測(cè)到突變率為0.5-5%的變異，且重現(xiàn)性很好（用什么測(cè)序技術(shù)可以例外？）基因突變頻率：所觀察到的突變細(xì)胞數(shù)與存活細(xì)胞數(shù)之比值當(dāng)前第60頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)①乳腺癌相關(guān)基因BRCA1、BRCA2等疾病相關(guān)基因的分子檢測(cè)②腫瘤樣本中雜合性缺失的檢測(cè)

（Lossofheterpzygosity,LOH）③菌株分型（TB等）

……（3）廣泛應(yīng)用于疾病的基因突變檢測(cè)和SNP篩查當(dāng)前第61頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)DHPLC的特點(diǎn)當(dāng)前第62頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)2-6蛋白質(zhì)截短實(shí)驗(yàn)(PTT)

前述方法可檢測(cè)已知突變、未知突變；但是，無從知道這些變異的存在是否與疾病的發(fā)生相關(guān)

本法只檢測(cè)與疾病相關(guān)的突變，即導(dǎo)致蛋白不能全長翻譯的突變

稱：體外蛋白質(zhì)合成檢測(cè)技術(shù)蛋白質(zhì)截短實(shí)驗(yàn)（proteintruncationtest,PTT)

當(dāng)前第63頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，從頭合成蛋白質(zhì)，從而篩尋該基因的終止密碼，包括三個(gè)主要步驟：

(1)提取基因組DNA-PCR或提mRNA,RT－PCR得到靶基因

(2)以PCR產(chǎn)物為模板轉(zhuǎn)錄mRNA，再翻譯成蛋白質(zhì)

(3)采用SDS分析所合成的蛋白質(zhì)，通過比較遷移率的差異，區(qū)分基因變異而產(chǎn)生的截短產(chǎn)物與正常的全長蛋白產(chǎn)物

1）PTT基本原理當(dāng)前第64頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)蛋白質(zhì)截短實(shí)驗(yàn)原理示意圖當(dāng)前第65頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)

①只檢測(cè)出與疾病相關(guān)的蛋白截短突變

②可檢測(cè)出在RNA形成過程中發(fā)生的突變

（剪接突變）

③不受基因多態(tài)性的干擾（多態(tài)性于非編碼區(qū)）

④截短蛋白分子的長度可指明突變的位置3）PTT方法學(xué)評(píng)價(jià)當(dāng)前第66頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)3）PTT方法學(xué)評(píng)價(jià)缺點(diǎn)

①對(duì)于含幾千bp和多個(gè)外顯子的疾病基因，就需要分成N個(gè)1－2kb的片段分別擴(kuò)增，分別進(jìn)行PTT檢測(cè)

②檢測(cè)不出編碼序列中小的插入或缺失或錯(cuò)義突變

（對(duì)長度無明顯影響）

③引起mRNA量改變或不穩(wěn)定的突變可能被漏檢當(dāng)前第67頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)PTT在人類分子疾病檢測(cè)中的應(yīng)用

疾病類型截短變異率％相關(guān)基因家族性腺瘤樣息肉?。‵AP）遺傳性硬纖維瘤病共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張癥（AT）遺傳性乳腺癌/卵巢癌囊性纖維性變?。–F）杜興氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）Emery-Dreifuss肌營養(yǎng)不良癥范柯尼貧血亨特綜合癥遺傳性非息肉病性/結(jié)直腸癌Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤?、蛐蜕窠?jīng)纖維瘤病多囊腎?。≒FD）RubinsteinTaybi綜合征9510090909015958080～

50～80～7050659510APCAPCATMBRCA1BRCA2CFTRDMDEMDFAAIDShMSH2hMSH1NF1NF2PKD1RTS當(dāng)前第68頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)

3脈沖電場(chǎng)凝膠電泳

(pulsed-fieldgelelectrophoresis,PFGE)3-1PFGE的原理3-2PFGE的分類3-3PFGE的應(yīng)用當(dāng)前第69頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)3-1PFGE的原理在正交的交變脈沖電場(chǎng)中進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，其方向、脈沖時(shí)間和電壓可交替改變每次電場(chǎng)方向改變時(shí)，DNA分子就需要一定的時(shí)間改變形狀和遷移方向:此時(shí)，分子越大，分子構(gòu)型轉(zhuǎn)換所需時(shí)間就越長，轉(zhuǎn)變遷移方向的時(shí)間也就越長當(dāng)前第70頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)3-1PFGE的原理對(duì)于不同大小的DNA大分子，其改變泳動(dòng)方向所需的時(shí)間不等，遷移的速度也就不等，因此最終的遷移距離就不同如此，便可按DNA分子量大小使其分離

當(dāng)前第71頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)3-2PFGE的基本步驟當(dāng)前第72頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)3-3PFGE的分類

1）倒轉(zhuǎn)電場(chǎng)凝膠電泳（Field-InversionGel

Electrophoresis,FIGE）

**

即間隔一定時(shí)間后使電場(chǎng)方向呈180°反轉(zhuǎn)

**

驅(qū)動(dòng)DNA分子向前遷移的正向脈沖時(shí)間較反向的長一些，這樣DNA分子的總遷移為向前，其時(shí)間比例為：

向前：向后＝3：1

**

FIGE非常流行于較小片段的分離600kb－750kb，

最大為800kb當(dāng)前第73頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)

在TAFE中，凝膠垂直放置，四個(gè)電極分別位于凝膠的前后而不是凝膠平面上。樣品中的DNA分子由于電場(chǎng)變化的作用以“之”字形穿行于凝膠層中。由于電場(chǎng)相交的角度在電泳過程中不斷變化，分子在整個(gè)電泳過程中的速度是變化的，可得到規(guī)則而銳利的DNA分離條帶

可分離大至1,600kb的片段，在病原生物的基因分析中有特殊的用途，這是以前不能進(jìn)行分析的

2）交流電場(chǎng)凝膠電泳（Transverse-AlternatingFieldGelElectrophoresis,TAFE）當(dāng)前第74頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)3）鉗位均勻電場(chǎng)凝膠電泳（Contour-ClampedHomogeneousElectricFields,CHEF）

由凝膠的周圍沿正方形或正六邊形排列的多個(gè)電極產(chǎn)生電場(chǎng)，目前多采用24個(gè)點(diǎn)電極呈六角形均勻的排列在凝膠周圍的方式這些電極都被鉗制在預(yù)定的電位上，電場(chǎng)與凝膠的各部分以120°角相交，DNA分子在電泳中產(chǎn)生聚焦良好的垂直條帶，可分離達(dá)7,000kb的DNA片段

當(dāng)前第75頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)

4）旋轉(zhuǎn)凝膠電泳

（RotatingGelElectrophoresis,RGE）

采用一個(gè)單獨(dú)的均一電場(chǎng)，只是通過周期性的旋轉(zhuǎn)凝膠而使得電場(chǎng)方向相對(duì)改變，從而使DNA分子在周期性改變的電場(chǎng)中泳動(dòng)，其分離原理與其它的PFGE一樣可分離50kb－6,000kb的DNA分子

當(dāng)前第76頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)四種常用FIGE的脈沖電場(chǎng)示意圖

當(dāng)前第77頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)

3-3PFGE的應(yīng)用1）菌株基因分型

不同菌株的電泳圖譜不同（特異性），通過該法得到的染色體組型稱電泳核型

2）制備染色體物理圖譜

已由此法構(gòu)建了180多種細(xì)菌的基因組物理圖譜

3）大質(zhì)粒的分離和大小測(cè)定

當(dāng)前第78頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)影像（X光、B超、CT）以解剖結(jié)構(gòu)和形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)，可顯示一些分子改變的終效應(yīng),即器官和組織的形態(tài)變化

20世紀(jì)末，基于臨床需要及相關(guān)學(xué)科技術(shù)的飛速發(fā)展，出現(xiàn)了一門能夠觀察到“Before終效應(yīng)”的組織細(xì)胞功能和代謝的變化的醫(yī)學(xué)影像學(xué)，即分子影像學(xué)4分子影像（molecularimaging)當(dāng)前第79頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)*是將分子生物學(xué)技術(shù)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)影像學(xué)相結(jié)合而產(chǎn)生的一門新興的邊緣學(xué)科

*是指在活體狀態(tài)下，通過無創(chuàng)的影像技術(shù)，從細(xì)胞和分子水平對(duì)其生理病理過程進(jìn)行定性、定量和可視化研究*以MRI、PET、光學(xué)成像及小動(dòng)物成像設(shè)備等為主，可用于分子水平成像

*也被稱為分子成像或分子顯像4分子影像（molecularimaging）MRI：核磁共振成像PET：正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像技術(shù)（positronemissiontomography）當(dāng)前第80頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)當(dāng)前第81頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)分子成像的4個(gè)基本條件高親和力的探針探針能夠透過生物屏障，如細(xì)胞膜，BBB有探針信號(hào)放大系統(tǒng)有快速敏感、高分辨率的成像技術(shù)當(dāng)前第82頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)4-1分子影像探針4-2分子影像學(xué)技術(shù)4-3分子影像的應(yīng)用

4分子影像（molecularimaging）當(dāng)前第83頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)4-1分子影像探針

1）定義：是分子影像中最關(guān)鍵的分子，是高特異的、標(biāo)記有示蹤劑（如核素、順磁性物質(zhì)或熒光素等）、能參與體內(nèi)自然的生理生化活動(dòng)的特殊分子探針

將這類特殊分子無創(chuàng)引入體內(nèi)，當(dāng)它到達(dá)靶組織或器官后便能夠與細(xì)胞內(nèi)特定的分子（靶分子）特異性結(jié)合，并產(chǎn)生信號(hào)當(dāng)前第84頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)1）分子影像探針

這些特異信號(hào)再通過成像系統(tǒng)（如PET、MRI或光學(xué)成像技術(shù)），可在體外被探測(cè)并成像

目前已有500多種分子探針，常用的小分子探針有單克隆抗體、受體和酶等

當(dāng)前第85頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)2）分子影像探針的特點(diǎn)（1）探針分子量小、純度高、安全，不影響檢測(cè)對(duì)象的原有生理生化反應(yīng)（2）有良好的生物學(xué)功能，參與人體正常的生理生化活動(dòng)（3）能夠克服人體內(nèi)部的“生理屏障”（如BBB、血管壁、細(xì)胞膜等），順利到達(dá)靶分子所在的器官/組織，同時(shí)又不積聚于其他組織（4）示蹤劑、分子探針和靶分子之間應(yīng)該呈緊密結(jié)合，且有足夠長的半衰期以便于體外檢測(cè)當(dāng)前第86頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)（1）直接成像（Directimaging）：靶特異探針能夠與相應(yīng)的特異靶標(biāo)發(fā)生特異的相互作用，直接對(duì)靶點(diǎn)成像，如用單抗直接對(duì)細(xì)胞膜表面成分的成像（2）間接成像（Indirectimaging）：除需要一個(gè)探針外，還需要一個(gè)報(bào)告基因（酶等）。相對(duì)復(fù)雜

3）分子影像的兩種基本檢測(cè)策略

當(dāng)前第87頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)

4-2分子影像學(xué)技術(shù)1）放射性核素成像2）磁共振成像

（MagneticResonanceImaging，MRI）3）光學(xué)成像

（OpticalImaging）當(dāng)前第88頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)（1）正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像技術(shù)（positronemissiontomography,PET）①原理：可直接成像，也可通過報(bào)告基因間接成像，能對(duì)疾病進(jìn)行定位、定性、定量及定期分析

②優(yōu)缺點(diǎn)：具有“一次檢查，全身顯像”

但PET設(shè)備昂貴，且同位素的半衰期較短，不能同時(shí)檢測(cè)多種探針1）放射性核素成像（RadionuclideImaging）當(dāng)前第89頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)（2）單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)（singlephotonemissioncomputedtomography，SPECT）①原理：通過探測(cè)和處理體內(nèi)的放射性核素自行發(fā)射出的γ光子構(gòu)成斷層圖像，可反映器官結(jié)構(gòu)及功能狀態(tài)，現(xiàn)已用于臨床檢測(cè)②優(yōu)/缺點(diǎn)：可同時(shí)區(qū)分不同放射能量的核素，能夠同時(shí)進(jìn)行多探針成像

相對(duì)PET來說，SPECT價(jià)格便宜，但只能夠進(jìn)行半定量分析1）放射性核素成像當(dāng)前第90頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)（1）原理：主要采用間接成像策略，通過標(biāo)記報(bào)告基因、轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，并在靶細(xì)胞內(nèi)大量擴(kuò)增來放大其信號(hào)成像。常用的報(bào)告基因：

酪氨酸激酶、β－半乳糖苷酶與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（2）優(yōu)缺點(diǎn)：MRI技術(shù)的空間分辨率高（達(dá)到μm級(jí)），且能同時(shí)獲得生理與解剖信息

但是，目前的MRI分子成像需要大量的探針，敏感度較低，掃描和后加工時(shí)間長，且價(jià)格昂貴

2）磁共振成像（MRI）當(dāng)前第91頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)①熒光（fluorescence）：常用報(bào)告基因有GFP、RFP和熒光素，后者為目前熒光成像研究熱點(diǎn)，因其組織穿透能力較強(qiáng)(可達(dá)數(shù)cm)，組織的自發(fā)熒光最小，影像的信噪比較高②生物發(fā)光（bioluminescence）：常用報(bào)告基因是蟲熒光素酶基因和Renilla蟲熒光素酶基因，其優(yōu)點(diǎn)是無自發(fā)熒光，所得影像的信噪比高，因此檢測(cè)的敏感性與特異性均較高，目前被廣泛應(yīng)用于小動(dòng)物全身成像3）光學(xué)成像技術(shù)GFP：綠色熒光蛋白；RFP：紅色熒光蛋白當(dāng)前第92頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)舉例：Bioluminescence-蟲熒光素酶基因通過重組DNA技術(shù)，構(gòu)建含蟲熒光素酶基因（fireflyluciferase）的重組分子將之轉(zhuǎn)入骨肉瘤細(xì)胞143B，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)該酶的人骨肉瘤細(xì)胞株143B-LUC用143B-LUC注入動(dòng)物皮下成瘤觀察前，腹腔注射D-Luciferin，一定時(shí)間后通過micro-CT

觀察

D-Luciferin作為熒光素酶的底物。在ATP和熒光素酶的催化作用下，Luciferin被氧化，產(chǎn)生藍(lán)綠色的光(560nm)，當(dāng)?shù)孜镞^量時(shí)，產(chǎn)生的光量子數(shù)與熒光素酶的濃度呈正相關(guān)。編碼熒光素酶的Luc基因是植物、細(xì)菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞的常用報(bào)告基因。由于沒有背景干擾，因此可以很容易地檢測(cè)出低至0.02pg水平的熒光素酶。

當(dāng)前第93頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)當(dāng)前第94頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)3）光學(xué)成像技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)

&&優(yōu)點(diǎn)：該技術(shù)操作簡(jiǎn)單、無放射性、所得結(jié)果直觀、靈敏度高，目前已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)及醫(yī)藥研究

&&缺點(diǎn)：光學(xué)成像技術(shù)的穿透力有限，為數(shù)毫米-數(shù)厘米，只能用于皮膚淺表成像，因此該技術(shù)目前主要用于小動(dòng)物模型的研究當(dāng)前第95頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)不同成像方法的相關(guān)參數(shù)成像方法探測(cè)光譜空間分辨率檢測(cè)深度時(shí)間分辨率靈敏度（mol/L）探針濃度PET高能γ射線1-2mmNolimit10s-min10-11~10-12ngSPECT低能γ射線0.5-1mmNolimitmin10-10~10-11ng生物發(fā)光成像

可見光3-5mm2-3cmsec-min10-15~10-17g-mg熒光成像可見光或近紅外線2-3mm0-15cmsec-min10-9~10-12g-mgMRI電磁波25-100μmNolimitMin-hrs10-3~10-5g-mg

當(dāng)前第96頁\共有108頁\編于星期二\2點(diǎn)

4-3

分子影像的應(yīng)用1