組織培養(yǎng)技術

組織培養(yǎng)技術第一頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三一、組織培養(yǎng)的定義組織培養(yǎng)：細胞、組織或器官→離體→合適的培養(yǎng)液、溫度、無菌→使之生存和生長

根據(jù)培養(yǎng)物的不同，組織培養(yǎng)又可分：細胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和器官培養(yǎng)。第二頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三二、組織培養(yǎng)的應用1.優(yōu)點：（1）研究對象是活細胞，可長時間動態(tài)觀察細胞的形態(tài)結構和生命活動。（2）研究對象廣泛，包括各種組織細胞。（3）可研究各種理化因素（溫度、藥物、毒素等）對細胞代謝、增殖、分化的影響。（4）研究方法多樣，如倒置、熒光、電子顯微鏡、組織化學、同位素標記等，研究結果便于觀察記錄。第三頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三應用：病毒學：細胞培養(yǎng)是分離培養(yǎng)病毒的重要手段，用于病毒感染的診斷，生產(chǎn)病毒疫苗。免疫學：雜交瘤-單克隆抗體技術。遺傳學：從子宮取得胎兒細胞做染色體分析，進行遺傳學診斷，試管嬰兒等。腫瘤學：抗腫瘤藥物篩選。第四頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三2.不足之處：體外與體內培養(yǎng)條件不完全相同，失去神經(jīng)內分泌系統(tǒng)的調節(jié)作用，培養(yǎng)的細胞存在一定的差異，故對結果的判斷應慎重。二、組織培養(yǎng)的應用第五頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三三、培養(yǎng)細胞的特性1.培養(yǎng)細胞的分型（按生長方式分）（1）貼附型：（2）懸浮型：

第六頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三1.培養(yǎng)細胞的分型（按生長方式分）（1）貼附型：大部分細胞附著于支持物表面生長，分化不明顯，形態(tài)單一，常反映其胚層起源。如上皮細胞型，成纖維細胞型，多形細胞型。上皮細胞型成纖維細胞型第七頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三（2）懸浮型：不貼附于支持物上，而呈懸浮狀態(tài)生長，細胞呈圓形，單個或細胞團排列；見于血、脾、骨髓細胞、部分腫瘤細胞。懸浮型細胞第八頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三三、培養(yǎng)細胞的特性2.培養(yǎng)細胞的生長和增殖原代培養(yǎng)（PrimaryCulture）：從體內取出組織開始在體外培養(yǎng)，在其傳代之前。傳代培養(yǎng)（Subculture）:將細胞分離成兩部分獲更多至新的培養(yǎng)器皿中，并補充更新培養(yǎng)液。細胞系（Cellline）：原代培養(yǎng)細胞一經(jīng)傳代后便稱為細胞系。

第九頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三細胞系的生長過程有限細胞系無限細胞系二倍體細胞大多可傳30-50代，相當于150-300個細胞周期，維待一年左右的生存時間。第十頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三細胞系的生長過程原代培養(yǎng)期：1-4周，與體內細胞相似，但分裂不旺盛，含細胞類型較多。傳代期：持續(xù)時間最長，細胞分裂增殖旺盛，保留原組織細胞的很多特征，一般傳代30-50次后，細胞增殖逐漸緩慢。衰退期：細胞增殖緩慢，并逐漸停止，細胞形態(tài)輪廓增強，最后衰退、死亡。

實驗研究的最佳時期：傳代期（10代以內）第十一頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三三、培養(yǎng)細胞的特性1.營養(yǎng)需要：

碳水化合物、氨基酸、維生素、無機離子、促生長因子和激素2.生存環(huán)境：溫度：PH值：氣相：滲透壓：3.無污染及無毒：35℃-37℃

耐低溫不耐高溫7.2-7.4寧酸勿堿O2、CO2（5%）NaHCO3-CO2260-320mmol/L3.培養(yǎng)細胞的生長條件第十二頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三防止污染要注意防止微生物（細菌、病毒、真菌、支原體等）的污染、不同細胞類型的交叉污染。出現(xiàn)以下情況時培養(yǎng)細胞可能有污染：1)培養(yǎng)液的酸堿度異常改變，如短期內顏色變黃；2)培養(yǎng)液出現(xiàn)混濁；3)光鏡觀察到大量顆粒或菌絲；4)細胞生長停止或出現(xiàn)死亡。第十三頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三四、組織培養(yǎng)的常用設備

1.儀器包括各種無菌操作、消毒滅菌、細胞培養(yǎng)和保存的設備，如無菌室、超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌器、濾器、水純化裝置、倒置顯微鏡、離心機、液氮容器等。第十四頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三超凈工作臺第十五頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三CO2培養(yǎng)箱第十六頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三四、組織培養(yǎng)的常用設備2.器皿培養(yǎng)瓶培養(yǎng)皿培養(yǎng)板第十七頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三四、組織培養(yǎng)的常用設備3.試劑（1）天然培養(yǎng)基：動物血清（如胎牛血清、小牛血清）。（2）合成培養(yǎng)基：如RPMI1640、DMEM、199等。多采用合成培養(yǎng)基+天然培養(yǎng)基（5-20%）。（3）平衡鹽溶液：由無機鹽和葡萄糖組成，用于洗滌、配液、維持滲透壓，調節(jié)PH值等，如PBS、Hank’s等。（4）消化液：用于消化解離組織塊，使貼壁細胞從附著物脫離。如胰酶、EDTA、膠原酶等。

第十八頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三五、基本培養(yǎng)技術

1.無菌操作

2.取材3.組織分離4.原代培養(yǎng)5.傳代培養(yǎng)6.細胞凍存與復蘇第十九頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三五、基本培養(yǎng)技術

1.無菌操作：防止污染是決定組織培養(yǎng)成敗的關鍵，必須無菌操作！（1）培養(yǎng)前的消毒滅菌待用物品：洗滌、消毒滅菌。無菌室：紫外線照射30-50min，新潔爾滅拖地。超凈臺：75%酒精擦洗，紫外線滅菌等照射30min。（2）洗手和著裝徹底洗手，著清潔工作服，酒精消毒手。（3）無菌培養(yǎng)操作超凈臺內操作，點燃酒精燈，火焰附近操作，在安裝吸頭、打開或封閉瓶口時均應過火燒灼。不直接用手觸及器皿的無菌部分，如瓶口、瓶塞內側，必要時借助鑷子。吸取培養(yǎng)液、平衡鹽溶液、細胞懸液的吸管不能混用。轉移液體時，吸管口不能觸及瓶口，以防交叉污染。飯盒、瓶子不要過早打開，使用后及時蓋好，瓶塞倒置在桌面。面向操作臺時勿大聲講話、咳嗽，以免噴出唾沫，污染工作臺面。操作完畢，整理臺面，酒精擦拭。第二十頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三五、基本培養(yǎng)技術

2.取材：

新鮮、無菌、避免有害因素損傷。第二十一頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三五、基本培養(yǎng)技術

3.組織分離（1）離心分離：用于血液、羊水、胸水、腹水等懸液，500-1000rpm低速離心5-10min。（2）機械分離：用剪刀將組織剪切成小塊，也可再擠壓通過篩網(wǎng)，用于纖維成分少的組織，如腦、胚胎、一些腫瘤組織。（3）消化分離：用消化液使組織松散、細胞分開，獲得細胞懸液。常用消化液胰酶、EDTA、膠原酶。第二十二頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三六、基本培養(yǎng)技術

4.原代培養(yǎng)：（1）組織塊法：將組織剪切成小塊后，接種于培養(yǎng)瓶底部，培養(yǎng)后細胞從組織塊邊沿移出生長。簡便易行，適用于組織量少培養(yǎng)。（2）消化法：將消化分離法獲得的細胞懸液，接種培養(yǎng)瓶。在短時間內生長成片，適用于大量組織的培養(yǎng)，但步驟繁瑣、易污染、成本高。第二十三頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三五、基本培養(yǎng)技術

5.傳代培養(yǎng)：貼附型細胞：加入消化液，鏡下觀察，見胞質回縮、細胞間隙增大，終止消化，吹打為單細胞懸液，計數(shù)后接種新的培養(yǎng)瓶。懸浮型細胞：直接吹打或離心沉淀后再分離傳代。注意：1）貼壁細胞覆蓋瓶底大部分（＞80%）方可傳代，不要急于傳代；

2）傳代時不同細胞有不同的消化時間，要根據(jù)需要注意觀察及時處理。第二十四頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三六、基本培養(yǎng)技術

6.細胞凍存和復蘇目的：保存和利用細胞。短期保存：-70℃低溫冰箱，長期保存：-196℃液氮罐。為保證細胞最大存活率，采用慢凍快融的原則。凍存：收集對數(shù)生長細胞，加入保護劑和培養(yǎng)液，調細胞密度5-10×106/ml，分裝入凍存管，逐漸降溫，-1～-2℃/min，到-25℃時，下降率增至-5～-10℃/min，到-100℃迅速浸入液氮罐。（4℃30min→-70℃24h→-196℃液氮）。

復蘇：取出凍存管，直接投入37℃水浴中，快速搖動，直至完全融化，吸出細胞，加入10倍以上培養(yǎng)液，離心，調整細胞密度5×105/ml，接種培養(yǎng)瓶。細胞凍存于液氮中（-196℃）理論上儲存時間是無限的。一般凍存一年后，應復蘇一次，繼續(xù)凍存。

第二十五頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三低溫冰箱液氮罐第二十六頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三凍存管凍存管第二十七頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三實驗操作：小鼠肝組織培養(yǎng)（一）實驗材料1.器材：手術剪、手術鑷（大）——剪鼠開皮膚、肌肉層眼科鑷、眼科剪（?。羲槭蟾闻K培養(yǎng)皿——蓋和底分別用于清洗、剪碎鼠肝臟培養(yǎng)瓶——培養(yǎng)肝組織2.試劑：洗液PBS、小牛血清、培養(yǎng)液16403.儀器：超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱4.動物：小白鼠1只/2人第二十八頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三實驗操作：小鼠肝組織培養(yǎng)（二）實驗方法1.處死消毒小鼠：引頸法處死小鼠，在75%酒精缸中浸泡數(shù)秒取出，滴去酒精，腹部向上放進白瓷盤，拿入超凈臺。2.準備工作：點燃酒精燈，酒精棉球擦手，取3支滴管分別放入洗液、血清、培養(yǎng)液中。

（第一組放，最后一組收）3.取肝臟：用手術剪、鑷剪開腹部皮膚、肌肉層，暴露腹腔，從腹腔右側取一小塊肝組織，放入培養(yǎng)皿中。4.洗滌：加入洗液，用眼科鑷夾住肝組織清洗，共洗2遍。第二十九頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三實驗操作：小鼠肝組織培養(yǎng)（二）實驗方法5.剪碎：在培養(yǎng)皿中加入1滴小牛血清，將肝組織放入其中，用眼科剪剪碎成1mm3左右小塊。6.準備培養(yǎng)瓶：吸1滴血清，滴在培養(yǎng)瓶底面，來回涂抹。7.接種肝組織：用滴管吸取肝組織，貼于培養(yǎng)瓶底面中，

3-4塊即可，分開排列。8.加培養(yǎng)液：翻轉培養(yǎng)瓶，加入培養(yǎng)液2滴管，輕旋瓶蓋。9.培養(yǎng)：將培養(yǎng)瓶放入CO2培養(yǎng)箱，2h后翻轉。10.整理臺面，清洗器材。第三十頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三實驗操作：小鼠肝組織培養(yǎng)注意事項：無菌操作試劑中的滴管第一組放，最后一組收加培養(yǎng)液時，要翻轉培養(yǎng)瓶2人一組，相互配合實驗結束后：器材——

C409清洗小鼠——C409垃圾桶第三十一頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三實驗操作：小鼠肝組織培養(yǎng)（三）實驗結果培養(yǎng)一周左右，倒置顯微鏡下，可見肝細胞貼壁，以組織塊為中心，向四周放射狀分布。肝細胞呈多邊形，胞體飽滿，折光性強，中央