紫外分光光度法的原理

紫外分光光度法的原理第一頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三綠、藍(lán)、青、紫等組成的光譜，稱為發(fā)射光譜。如果在白熾燈光與棱鏡之間放一個(gè)有色溶液的玻璃皿，則通過(guò)棱鏡后的光譜上會(huì)出現(xiàn)一處或幾處暗帶，這種帶有暗帶的光譜稱為該有色溶液的吸收光譜，吸收光譜顯示該溶液對(duì)光的選擇性吸收的特性。溶液所呈現(xiàn)的顏色是它的吸收光譜中透過(guò)最多、吸收最少的那部分波長(zhǎng)光線的顏色，而暗帶部分則是它透過(guò)最少、吸收最多的那部分波長(zhǎng)光線的顏色。不同分子的原子團(tuán)和原子，它的發(fā)射光譜和吸收光譜不同。因此可以根據(jù)其光譜的特征和第二頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三強(qiáng)度研究化合物的結(jié)構(gòu)和測(cè)定其含量，稱為光譜分析法，這也是比色分析的原理。根據(jù)發(fā)射光譜分析的如火焰發(fā)射光譜法（又稱火焰光度法，分析鈉、鉀、鈣），熒光光度和熒光分光光度法（根據(jù)熒光的發(fā)射強(qiáng)度進(jìn)行分析）。根據(jù)吸收光譜分析的方法又稱吸光光度法，如應(yīng)用可見(jiàn)光的吸收光譜進(jìn)行分析的普通的分光光度計(jì)和分光光度法；用紫外光的吸收光譜進(jìn)行分析的叫紫外分光光度計(jì)和紫外分光光度法；用原子的吸收光譜進(jìn)行分析的方法叫原子吸收分光光度計(jì)和原子吸收分光光度法。第三頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三硒-鄰苯二胺絡(luò)合物的吸收光譜特征吸收峰332.5nm

第四頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三氧化鈥的吸收光譜第五頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三二.郎伯-比爾定律：當(dāng)一束單色入射光[I0]通過(guò)厚度為L(zhǎng)、濃度為C的有色溶液后，所透過(guò)光的強(qiáng)度[I1]與溶液厚度L及濃度C成負(fù)指數(shù)乘積的關(guān)系：I1=I0·10－K·L·C

如果物質(zhì)在溶液中的濃度和顯色強(qiáng)度成正比，則可以應(yīng)用郎伯-比爾定律通過(guò)比色方法從顯色強(qiáng)度求濃度，這是比色分析的原理。入射光強(qiáng)度I0透過(guò)光強(qiáng)度I1

溶液厚度L（比色杯直徑）第六頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三I1=I0·10－K·L·C移項(xiàng)成：I1/I0=10－K·L·C

式中K為常數(shù)，可因物質(zhì)的吸光特性和采用單色光的波長(zhǎng)不同而有所不同，與溶液的厚度和濃度無(wú)關(guān)。上式寫成以10為底的對(duì)數(shù)，Iog(I1/I0)=－K·L·C，再以透光度T=I1/I0時(shí)，則上式成為IogT=－K·L·C或者－IogT=K·L·C。I1/I0稱為透光度或透光率，表示透過(guò)光強(qiáng)度是入射光強(qiáng)度的百分之幾，其數(shù)值只能＜1，從0~100%。為了方便起見(jiàn)，經(jīng)常用透光度的負(fù)對(duì)數(shù)－IogT來(lái)表示溶液吸收光線的情況，并稱為吸光度(ABS)、消光度(E)、或光密度(OD或D)，這樣，ABS=K·L·C第七頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三該式說(shuō)明溶液的吸光度和濃度C、厚度L之間皆成正比關(guān)系。當(dāng)厚度一定時(shí)，溶液的濃度增加，則吸光度成正比地增加，這就是比色分析的依據(jù)。實(shí)際使用中，溶液的厚度就是比色杯的厚度，它是相對(duì)固定的，有0.5、1、2、4cm的比色杯，使用最多的是1cm的比色杯。比色分析中有時(shí)也用透光度做單位，根據(jù)透光度的負(fù)對(duì)數(shù)－IogT=吸光度，透光率為100%時(shí)，吸光度=－Iog1=0，而透光率為1%時(shí)，吸光度=－Iog0.01=2，二者間呈對(duì)數(shù)指數(shù)關(guān)系。當(dāng)然，只有溶液的濃度和吸光度之間成直線第八頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三正比關(guān)系時(shí)才能進(jìn)行比色分析，如果溶液的吸光度與濃度不成正比（不符合郎伯-比爾定律），則不能使用比色分析。有時(shí)，溶液的濃度只在一定范圍內(nèi)和顯色成直線正比關(guān)系，而濃度超過(guò)一定限度時(shí)，失去正比關(guān)系，則不能一概地用比色結(jié)果換算，通常都要研究測(cè)定方法中什么濃度范圍內(nèi)二者成直線正比關(guān)系；或者繪制一系列濃度和吸光度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，發(fā)現(xiàn)濃度增加到一定限度，標(biāo)準(zhǔn)曲線發(fā)生彎曲、變折，說(shuō)明超過(guò)該濃度時(shí)，要對(duì)溶液進(jìn)行稀釋才能用來(lái)比色分析。第九頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三可見(jiàn)光、紫外、熒光分析都要求溶液必須透明，否則引起對(duì)光的吸收，影響分析的準(zhǔn)確度。對(duì)特殊的均勻的渾濁液也可以進(jìn)行比色分析,稱為比濁法，比如應(yīng)用于紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)菌計(jì)數(shù)的比濁測(cè)定。光線通過(guò)透明的溶液時(shí)，還有少量的光線在玻璃、溶液的表面被反射或散射，影響到吸光度，所以要用一個(gè)空白管進(jìn)行校正，除去反射、光、散射光、試劑中雜質(zhì)、非反應(yīng)物的影響，即用空白試劑溶液進(jìn)行調(diào)零的原因。普通玻璃對(duì)紫外線也有吸收，所以在普通分光光度計(jì)上第十頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三使用普通玻璃比色杯，而在紫外分光光度計(jì)上必須用對(duì)紫外線無(wú)吸收的石英玻璃比色杯。三.可見(jiàn)—紫外分光光度計(jì)的應(yīng)用（一）光譜分析：有時(shí)候需要研究某物質(zhì)在某溶劑中的光譜特性，如Vc的乙酸溶液在252.0nm和237.5nm處有吸收波峰。大多數(shù)情況下，比色分析都提供了使用光的波長(zhǎng)（一般是最大吸收峰波長(zhǎng)）。如果沒(méi)有提供使用波長(zhǎng)的話，可以用紫外分光光度計(jì)從200～1000nm范圍內(nèi)掃描吸收光譜，搜索到吸收峰，再用吸收峰波長(zhǎng)來(lái)比色分析。第十一頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三咖啡因樣品用紫外光譜定性和定量，上：標(biāo)準(zhǔn)品；下：樣品第十二頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三（二）吸光系數(shù)：郎伯-比爾定律中的K稱為吸光系數(shù)。因比色杯的直徑用cm為單位，因此K的單位決定于濃度c用什么單位，如c以mol/L為單位時(shí)K稱為摩爾吸光系數(shù)，用Emol或εmol表示；如果物質(zhì)的分子量未知，濃度可用%為單位，K稱為百分吸光系數(shù)，用E%表示。

E的定義是：某波長(zhǎng)光通過(guò)1cm杯、1mol/L或1%濃度的某溶液時(shí)，該溶液對(duì)該波長(zhǎng)光的吸光度。E在特定波長(zhǎng)、1mol/L或1%濃度、特定溶劑條件下是該物質(zhì)的一個(gè)特征常數(shù)，反映該物質(zhì)的吸光能力，資料和測(cè)定時(shí)都要標(biāo)明其特征第十三頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三波長(zhǎng)或最大吸收波長(zhǎng)，表示為Emol~nm,max,1cm或E%~nm，max，1cm。許多物質(zhì)的吸光系數(shù)在書(shū)或資料中可以查到，如藥典規(guī)定VB12應(yīng)該有278±1nm、361±1nm、550±2nm3個(gè)吸收峰，其E1%361nm，1cm=207。實(shí)際工作中，1mol/L的濃度太高，可以配成1mmol/L或1μmol/L的濃度，相應(yīng)地寫成Emmol（μmol）~nm，max，1cm。根據(jù)吸光系數(shù)的特性，它有3項(xiàng)用途：

1.可作為物質(zhì)定性的參考：被測(cè)物質(zhì)的光譜特性和標(biāo)準(zhǔn)物如果一致，可粗略定性。如檢查VB12注射液是否變質(zhì)，測(cè)定其光譜，結(jié)果為279第十四頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三±0、361.5±0、550.7±0.3nm3個(gè)吸收峰，完全一致，可以判定該物質(zhì)為VB12（未變質(zhì)）。一些苯衍生物的紫外光譜特征如下：化合物溶劑吸收峰吸收峰吸收峰Emolmax，1cm苯碳?xì)浠衔?54nm2502048800甲苯碳?xì)浠衔?622602087900六甲基苯碳?xì)浠衔?7123022110000氯苯碳?xì)浠衔?672002107400苯酚碳?xì)浠衔?7112602136200.第十五頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三

2.檢查純度：紫外光譜法檢查純度是一種簡(jiǎn)便有效的方法，用于許多化合物檢測(cè)。如阿司匹林在空氣中容易吸收水分產(chǎn)生水楊酸，阿司匹林在280nm處有強(qiáng)吸收峰，而水楊酸的吸收峰遷移到312nm，只要檢測(cè)在312nm處是否有吸收峰，即可判斷有無(wú)水楊酸。再如無(wú)水乙醇精制過(guò)程中要用苯，測(cè)定無(wú)水乙醇中是否殘留苯，測(cè)定其吸收光譜，乙醇在210~600nm之間無(wú)吸收峰，而苯在250、254nm有吸收峰，以純無(wú)水乙醇為參比，對(duì)樣品進(jìn)行光譜分析，如果在250、254nm處出現(xiàn)吸收峰，則說(shuō)明有苯殘留。第十六頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三

3.檢查含量（純度）:如藥典規(guī)定VB12的E1%max，361nm，1cm=207，上述VB12注射液原標(biāo)示濃度為0.05%，求實(shí)際濃度，方法：藥液用重蒸水精確稀釋20倍，水做參比，用361nm測(cè)定的吸光度為0.512，其含量為：1%∶207=x%∶0.512，x%=0.00247%，濃度=0.00247%×20=0.049%4.應(yīng)用摩爾吸光系數(shù)測(cè)定濃度:一般的比色分析中都有標(biāo)準(zhǔn)品，未知樣品都是通過(guò)和標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)比分析含量。某些情況下，沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品，可以用摩爾吸光系數(shù)或百分吸光系數(shù)進(jìn)行測(cè)定，直接測(cè)定溶液的吸光度，通過(guò)和該純物質(zhì)的吸第十七頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三光系數(shù)比較，可以計(jì)算出濃度。這樣的分析需要經(jīng)過(guò)精確校正了波長(zhǎng)的分光光度計(jì)，紫外分光光度計(jì)的波長(zhǎng)一般精確到2nm，可以承擔(dān)這樣的分析。如果知道分子量的話，百分吸光系數(shù)和摩爾吸光系數(shù)之間可以互相換算，換算公式是：百分吸光系數(shù)=10×摩爾吸光系數(shù)÷物質(zhì)的分子量。比如血紅蛋白是4個(gè)亞基組成的蛋白質(zhì)，單個(gè)亞基的平均分子量是16114.5。每個(gè)亞基都在高鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]和氰化鉀[KCN]溶液中形成單體氰化高鐵血紅蛋白（HiCN），它的特征第十八頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三（最大）吸收峰在540nm處，摩爾吸光系數(shù)是11000，表示為Emolmax,540nm,HiCN=11000。測(cè)定樣品在同樣條件下的吸光度，就可以計(jì)算出含量。如：將血液0.02ml加入到5.0ml氰化高鐵試劑中，用540nm測(cè)定的吸光度為0.35，求血液中Hb的含量(g/L)。第一步，計(jì)算血液稀釋倍數(shù)：5.02÷0.02=251（倍）；第二步，計(jì)算：1mol∶11000=xmol∶0.35，x=0.35÷11000mol/L，乘以分子量和稀釋倍數(shù)變?yōu)間，x=0.35÷11000×16114.5×251=128.7（g/L）。如果有些物質(zhì)不知分子量，用它的1%溶液在同第十九頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三樣條件下測(cè)定，用百分吸光系數(shù)同樣可以換算。5.

紫外吸收光譜在某種程度上反映了化合物的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，所以可以用于有機(jī)化合物的定性和結(jié)構(gòu)分析。利用標(biāo)準(zhǔn)樣品或標(biāo)準(zhǔn)圖譜可以對(duì)未知化合物進(jìn)行鑒定，即控制相同的測(cè)量條件，將未知化合物的吸收光譜與標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行對(duì)照，如果兩者吸收光譜的形狀、吸收峰的數(shù)目、位置、最大吸收波長(zhǎng)及吸光強(qiáng)度完全一致，則可說(shuō)明它們分子結(jié)構(gòu)中存在相同的生色基團(tuán)，初步確定它們是同一種物質(zhì)，如咖啡因的定性。第二十頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三由于大多數(shù)有機(jī)化合物的紫外光譜比較簡(jiǎn)單，缺乏精細(xì)的結(jié)構(gòu)特征，而且很多生色團(tuán)的吸收峰幾乎不受分子中其它非吸收基團(tuán)的影響，因此，僅根據(jù)紫外光譜鑒定有機(jī)化合物有很大局限，一般必須與紅外光譜、質(zhì)譜、核磁共振波譜等相配合，才能進(jìn)行精確的鑒定。

6.溶劑對(duì)紫外光譜的影響：在測(cè)定有機(jī)物的紫外可見(jiàn)吸收光譜時(shí)，在溶解度容許范圍內(nèi)，應(yīng)盡量選擇非極性溶劑或極性較小的溶劑（烷、烯烴，如正己烷、正庚烷），以獲得吸收光譜的精細(xì)結(jié)構(gòu)。與標(biāo)準(zhǔn)樣品或標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行對(duì)比第二十一頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三時(shí)，必須用相同的溶劑。所選擇的溶劑在所研究的光譜區(qū)域內(nèi)應(yīng)該沒(méi)有明顯的吸收；并且不含有其它干擾物質(zhì)；與溶質(zhì)沒(méi)有相互作用。否則會(huì)使光譜線產(chǎn)生移動(dòng)，低于此波長(zhǎng)時(shí)，溶劑的吸收不可忽略。第二十二頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三常用溶劑的波長(zhǎng)范圍如下：.

溶劑使用波長(zhǎng)范圍溶劑使用波長(zhǎng)范圍甲醇>210二氯甲烷>235.

乙醇>215氯仿>245.

水>210乙酸乙酯>260.

96%硫酸>210苯>280.

乙醚>215甲苯>285.第二十三頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三（三）作為光度計(jì)使用：有色的反應(yīng)液可以用普通的分光光度計(jì)（721、722、濃度計(jì)），也可以用紫外分光光度計(jì)比色。某些溶液、反應(yīng)液無(wú)色，在200～400nm之間有特征性光吸收,就只能用紫外分光光度計(jì)。

1.單一物質(zhì)測(cè)定：先測(cè)定溶質(zhì)的吸收光譜，一般用最大吸收波長(zhǎng)進(jìn)行比色。常用方法有2種。（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法：用標(biāo)準(zhǔn)液制作一系列標(biāo)準(zhǔn)管的標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品測(cè)定結(jié)果查標(biāo)準(zhǔn)曲線求知。（2）對(duì)照管法：制作標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定管和樣品測(cè)定管，在特征吸收峰（或最大吸收峰）處測(cè)定吸第二十四頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三吸光度進(jìn)行比較，可直接求出樣品含量。如VB12含量測(cè)定：精確吸VB12注射液Vml，加重蒸水稀釋n倍，使每含的標(biāo)示量為30μg/ml，另外配VB12標(biāo)準(zhǔn)液濃度為30μg/ml，蒸餾水調(diào)零，用361nm測(cè)定吸光度A，計(jì)算：測(cè)定液中VB12含量（μg/ml）=（A樣品/A標(biāo)準(zhǔn)品）×30；注射液中VB12含量（μg/ml）=（A樣品/A標(biāo)準(zhǔn)品）×30×n（稀釋倍數(shù)）÷V（取樣量,ml）

2.混合物中兩物質(zhì)同時(shí)測(cè)定（兩物質(zhì)的最大吸收峰有部分重合）例四環(huán)素和金霉素混合物的測(cè)定：四環(huán)素在0.25第二十五頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三

NNaOH中最大吸收峰為380nm，E1%1cm，λmax=372.0；在0.1NHCl中最大吸收峰為355nm，E1%1cm，λmax=303.2；兩吸收峰都可以做為四環(huán)素的測(cè)定波長(zhǎng)。但與金霉素共存時(shí)，因?yàn)榻鹈顾卦?55nm處有吸收（金霉素在0.1NHCl中E1%1cm，λmax=182.6），只能用380nm測(cè)定四環(huán)素?；旌蠘悠吩?55nm處測(cè)定二者的總吸光度,在380nm處測(cè)得四環(huán)素的吸光度，則兩者的濃度都可以求出。測(cè)定方法：

(1)測(cè)定1%混合物在0.1NHCl溶液的吸光度A335(2)測(cè)定1%混合物在0.25NNaOH溶液的吸光度第二十六頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三A380，計(jì)算：四環(huán)素濃度C1（g%）=[AC1380/E1%（C1）1cm，380]=AC1380/372.0金霉素濃度C2（g%）=[AC1+C2335－（E1%（C1）1cm，355×C1）]÷E1%（C2）1cm，355=[AC1+C2335－（303.2×AC1380÷372.0）]÷182.6第二十七頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三四.紫外分光光度法的應(yīng)用：紫外光度法廣泛應(yīng)用在化學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境檢測(cè)、食品衛(wèi)生檢驗(yàn)分析方面。凡在200-1000nm范圍內(nèi)有特征性吸收，或與試劑反應(yīng)后形成特征性吸收,符合郎伯—比爾定律的，都可以分析，如：

1.測(cè)定蛋白質(zhì)：蛋白質(zhì)中含有酪氨酸和色氨酸對(duì)280nm的紫外線有最大吸收，吸收值與其濃度成正比，樣品不必反應(yīng)，稀釋后直接測(cè)定。

2.肌紅蛋白：在576nm附近有吸收峰，不需要標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)摩爾吸光系數(shù)法，可直接測(cè)定。

3.還原性谷胱甘肽：與四氧嘧啶反應(yīng)，生成物第二十八頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三在305nm處有最大吸收峰。

4.過(guò)氧化氫酶：有可見(jiàn)光測(cè)定法，也有紫外法。

5.抗生素：大部分可用紫外法測(cè)定，如青霉素、鏈霉素、氯霉素、四環(huán)素、金霉素、新生霉素。

6.VA用乙醚提取，溶在異丙醇中用328nm測(cè)定。VB1用246nm分析。VB2用267和444nm分析。VB6用291nm分析。VB11用254nm分析。VB12用278、361、550nm分析。VD用乙醚提取，純化后溶在乙醇中用265nm測(cè)定。Vc在乙酸介質(zhì)中與I2反應(yīng)：C6H8O6+I2

乙酸溶液

C6H6O6（脫氫Vc）+2HI；樣品中加入Vc后與I2反應(yīng)，第二十九頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三減少了I2，也減少了I3－生成，在一定范圍內(nèi)Vc與I3－成反比，用350nm測(cè)定I3－的顯色減弱，間接測(cè)定Vc濃度。

7.許多藥物要用紫外光譜測(cè)定，如咖啡因用272.6nm；巴比妥類（安眠藥）用220～240nm測(cè)定；5種氯丙嗪類藥（鎮(zhèn)定藥）全用249～307nm測(cè)定；安眠酮用235和503nm分析；安定（鎮(zhèn)靜藥）用240和285nm分析。

8.食品中硒與鄰苯二胺反應(yīng)，將絡(luò)合物提取到甲苯中，反應(yīng)物在335nm左右有吸收峰，用紫外比色測(cè)定。第三十頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三第八章原子吸收分光光度法的原理由原子結(jié)構(gòu)理論可知，一個(gè)原子可具有多種能態(tài)，其中最低的能態(tài)稱為基態(tài)，其它較高的能態(tài)稱為激發(fā)態(tài)。處于基態(tài)的原子稱為基態(tài)原子。原子吸收分光光度法的原理是：使樣品中化合態(tài)的元素吸收熱能，化合物解離后讓元素變?yōu)榛鶓B(tài)原子?；鶓B(tài)原子的能量最低，最穩(wěn)定，如果基態(tài)原子受外界能量激發(fā)，其最外層電子可能躍遷到不同的能級(jí)，達(dá)到不同的激發(fā)態(tài)。電子從基態(tài)躍遷到能量最低的激發(fā)態(tài)（第一激發(fā)態(tài)）時(shí)要吸收一定波長(zhǎng)的譜線，這一譜線稱為“共振吸收線”。第三十一頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三E6.E5.E4.E3.E2.E1.

最低激發(fā)態(tài)能級(jí)（第一激發(fā)態(tài)）

EE0.

基態(tài)

原子能量的吸收和發(fā)射較高激發(fā)態(tài)能級(jí)第三十二頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三而當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)再躍遷回基態(tài)時(shí)，則輻射出相同波長(zhǎng)的譜線，這一譜線稱為“共振發(fā)射線”，兩線均稱為共振線，波長(zhǎng)是相同的。由于各種元素原子結(jié)構(gòu)和核外電子排列不同，因此從基態(tài)躍遷到第一激發(fā)態(tài)（或由第一激發(fā)態(tài)躍遷回基態(tài)）時(shí)吸收或輻射的能量不同，因而各元素有不同波長(zhǎng)的共振線，所以元素的共振線又稱為元素的特征譜線。因?yàn)閺幕鶓B(tài)到第一激發(fā)態(tài)的躍遷最容易發(fā)生，所以對(duì)大多數(shù)元素來(lái)講，共振吸收線是元素所有譜線中最靈敏的譜線，原子吸收分光光度法就是利用基態(tài)原第三十三頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三

子躍遷到第一激發(fā)態(tài)時(shí)吸收從光源燈（元素?zé)簦┌l(fā)出的同一元素的共振吸收譜線（又叫分析線，相當(dāng)于吸收峰）。但原子的吸收譜線并不是幾何學(xué)上的線條，而是有一定寬度的波長(zhǎng)范圍，通常稱為譜線輪廓。

Ko

IvKo/2半寬度

———Vo——————Vo———

透射光強(qiáng)度Iv與波長(zhǎng)Vo的關(guān)系吸收線輪廓與半寬度第三十四頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三若將吸收系數(shù)Kv隨入射光波長(zhǎng)變化的關(guān)系做圖，則稱吸收線輪廓，吸收線輪廓的特征值是吸收線中心波長(zhǎng)（或頻率）為Vo，在Vo處，吸收系數(shù)Ko最大，在Vo兩側(cè)一定距離后Kv減為零。吸收譜線在Vo兩側(cè)有一定寬度，通常以吸收系數(shù)等于極大值的一半（Ko/2）處吸收線兩點(diǎn)間的輪廓（頻率范圍）表示吸收線的寬度，稱為吸收線的半寬度，以△V表示，其范圍為0.001～0.01nm。同樣發(fā)射譜線也有寬度，不過(guò)實(shí)際使用中都是用吸收譜線中心的最大吸收值Ko來(lái)測(cè)定元素含量，稱為峰值吸收。第三十五頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三入射光強(qiáng)度Iov透過(guò)光強(qiáng)度Iv

研究證明，原子蒸氣對(duì)共振發(fā)射譜線的吸收程度和蒸氣中基態(tài)原子數(shù)成正比，也即同原子濃度成正比。當(dāng)一束強(qiáng)度為Iov、頻率為v的入射光（譜線）通過(guò)原子蒸氣后，有一部分被吸收，其透過(guò)光的強(qiáng)度Iv與原子蒸氣厚度（即火焰的寬度）L、原子蒸氣濃度C的關(guān)系同有色溶液吸收光的情況完全類似，服從郎伯-比爾定律，即Iv=Iove－KvCL，式中e是自然對(duì)數(shù)的底，Kv是原子蒸氣對(duì)頻率為V的入射光的吸收系數(shù)。火焰寬度L第三十六頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三當(dāng)原子蒸氣厚度L一定時(shí)，設(shè)－KvL=－K，Iv=Iove－KC，Iov/Iv=e－KC，將透光度Iv/Iov的的倒數(shù)取對(duì)數(shù)稱為吸光度A，則上式簡(jiǎn)化為A=－Ig（Iv/Iov）=KC，即吸光度A與濃度成線性正比關(guān)系。在確定的實(shí)驗(yàn)條件下，原子蒸氣中的原子濃度與樣品中的元素實(shí)際濃度成正比，這就是原子吸收分光光度法測(cè)定元素的原理。實(shí)際測(cè)定中還有許多注意事項(xiàng)：

1.元素測(cè)定都要先制備工作曲線，每個(gè)工作曲線至少要6～7個(gè)點(diǎn)，而且最好從低濃度—高濃度，范圍盡可能大，而且要符合線性關(guān)系。第三十七頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三

2.處理樣品同時(shí)要制備它的空白對(duì)照管，測(cè)定管吸光度減去空白管吸光度，再通過(guò)工作曲線計(jì)算元素濃度。

3.原子吸收分析的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，絕對(duì)檢出線可達(dá)10－9～10－10g，相對(duì)誤差一般0.1～0.5%,測(cè)定范圍廣，從10－6～10－9g。選擇性好，分析速度快，溶液中多種離子不需要分離直接測(cè)定。但也有缺點(diǎn)，主要是元素在火焰中燃燒過(guò)程中有許多干擾因素。

4.原子吸收分析，樣品溶液的最適濃度在靈敏度的15～100倍范圍內(nèi)。第三十八頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三一些元素的分析譜線鎂：285.2nm；鈣：422.7nm；鐵：248.3nm；銅：324.8nm；錳：279.5nm；鋅：213.9nm；鉻：357.9nm；鎳：232.0nm；鈷：240.7nm鉬：313.3nm鉛：283.3nm；鎘：228.8nm；錫：224.6nm銻：217.6nm；鋁：309.3nm；砷：139.8nm；汞：253.7nm；第三十九頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三第九章火焰光度法某些原子或分子的電子受到熱能或電能的激發(fā)后躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)這些電子再由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)，以光的形式釋放出所吸收的能量，形成發(fā)射光譜。每個(gè)原子或分子的的能量狀態(tài)是一定的，所以它們的發(fā)射光譜線也是特異的；激發(fā)的能量越大，被激發(fā)的電子的能量也越高，呈現(xiàn)的譜線也越多。用火焰作為激發(fā)能量，使某些金屬元素（離子）產(chǎn)生發(fā)射光譜進(jìn)行分析的方法稱為火焰光度分析法。一般火焰屬于熱能，能量不及電弧第四十頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三火花高，因此產(chǎn)生的光譜比較簡(jiǎn)單，有時(shí)僅二、三條譜線。普通煤氣-空氣火焰的溫度不太高，所以能激發(fā)的元素也僅限于堿金屬和堿土金屬，目前用該法測(cè)定的元素為鈉、鉀、鈣。一.火焰光度計(jì)的測(cè)定原理：金屬元素（離子）經(jīng)過(guò)燃燒的火焰激發(fā)出特異的發(fā)射光譜，如鈉的發(fā)射光譜為黃色，鉀的發(fā)射光譜為淡紅色。發(fā)射光譜的強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度在一定范圍內(nèi)成線性關(guān)系，據(jù)此可以測(cè)定含量。將樣品制成溶液，借壓縮空氣吸入到火焰光度計(jì)的霧化器，并在火焰中噴為很細(xì)的微粒。第四十一頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三溶液中含有各種不同的離子，激發(fā)出各自不同的光譜，但通過(guò)特異的濾光鏡可選擇需要的元素的譜線，譜線投射到光電池（管）上，產(chǎn)生電流，電流經(jīng)放大后用電流計(jì)檢測(cè)。二.測(cè)定方法：（一）直接測(cè)定法：1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法：用一系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液在火焰光度計(jì)上測(cè)定，讀數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，同法稀釋樣品后測(cè)定，查標(biāo)準(zhǔn)曲線求含量。2.比較法：用2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液，一個(gè)高濃度，一個(gè)低濃度，使樣品液的濃度介于兩者之間。通常第四十二頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三第四十三頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三第四十四頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三第四十五頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三第十章熒光分光光度法分析的原理一.熒光的發(fā)生：有些物質(zhì)吸收紫外光照射后會(huì)發(fā)射出波長(zhǎng)比照射光波長(zhǎng)還長(zhǎng)的光，稱為熒光和磷光。熒光和磷光有區(qū)別，分子的能量從激發(fā)態(tài)直接降落到基態(tài)發(fā)出的波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光稱為熒光。分子的能量從激發(fā)態(tài)并不直接降落到基態(tài)，而是通過(guò)一個(gè)中間的亞穩(wěn)定狀態(tài)，稍停留后，再放出能量，下降到基態(tài)，發(fā)出的光稱為磷光。第四十六頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三熒光和磷光第二電子激發(fā)態(tài)

吸光無(wú)輻射躍遷第一電子激發(fā)態(tài)吸光

熒光

亞穩(wěn)態(tài)

磷光基態(tài)第四十七頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三磷光的能量比熒光小，波長(zhǎng)較熒光長(zhǎng)。從激發(fā)到發(fā)光，熒光所需的時(shí)間較短，在激發(fā)光照射后10－8～10－14秒之間，磷光所需的時(shí)間較長(zhǎng)，在激發(fā)光照射后10－4～10秒以上。本章主要介紹熒光光度分析法。照射物質(zhì)的紫外光稱為激發(fā)光，物質(zhì)產(chǎn)生的熒光稱為發(fā)射光。同一分子結(jié)構(gòu)物質(zhì)，用同一波長(zhǎng)的激發(fā)光照射，可以產(chǎn)生相同的熒光；同一物質(zhì)濃度高時(shí)，產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度也強(qiáng)，利用這個(gè)性質(zhì)可以進(jìn)行定量測(cè)定，稱為熒光光度分析法。熒光分析不是測(cè)定激發(fā)光的強(qiáng)弱，而是第四十八頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三測(cè)定發(fā)射光的強(qiáng)弱，所以屬于發(fā)射光譜分析法。二.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜（熒光光譜）：如果將激發(fā)光源用單色器分光，讓它發(fā)出一系列波長(zhǎng)連續(xù)變化的光譜（像在紫外光譜分析中，從200～400nm連續(xù)掃描），測(cè)定物質(zhì)吸收每一波長(zhǎng)的激發(fā)光后所發(fā)出的熒光強(qiáng)度，得到的光譜圖稱為激發(fā)光譜（excitationspectrum，簡(jiǎn)寫Ex），激發(fā)光譜實(shí)際是熒光物質(zhì)的吸收光譜。激發(fā)光譜中吸收最高的波長(zhǎng)能使熒光物質(zhì)發(fā)出最強(qiáng)的熒光，故稱為最大激發(fā)波長(zhǎng)，用λex表示，一般要用它激發(fā)熒光。第四十九頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三再使激發(fā)光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度不變，一直照射在熒光物質(zhì)上，把產(chǎn)生的熒光通過(guò)單色器色散，變成連續(xù)變化波長(zhǎng)的熒光，照射在光電接受管上，在一定范圍內(nèi)記錄其熒光強(qiáng)度的變化，以波長(zhǎng)變化和相應(yīng)的熒光強(qiáng)度作圖，稱為熒光發(fā)射光譜或簡(jiǎn)稱發(fā)射光譜（fluorescencespectrum簡(jiǎn)寫：Em）。再以最大激發(fā)波長(zhǎng)照射，測(cè)定熒光發(fā)射光譜，產(chǎn)生最大熒光強(qiáng)度的波長(zhǎng)又稱為最大發(fā)射波長(zhǎng)，用λem表示。一般分子熒光的發(fā)射波長(zhǎng)總是大于激發(fā)波長(zhǎng)。下圖是硫酸奎寧在硫酸中的激發(fā)光譜和熒光光譜。第五十頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三硫酸奎寧的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜第五十一頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期三

三.熒光定量分析的原理：熒光強(qiáng)度（If）和激發(fā)光的強(qiáng)度（I0）、物質(zhì)的熒光效率（φf(shuō)）成正比：If=I0×φf(shuō)

---------------------①對(duì)待測(cè)溶液，設(shè)I0為入射光（激發(fā)光）強(qiáng)度，It為透射光強(qiáng)度，Ia為吸光強(qiáng)度，If為熒光強(qiáng)度，C為熒光物質(zhì)濃度，L