陳其軍CRISPR-Cas-basedtoolk教學講解課件

A

CRISPR/Cas-basedToolkitforPlantMultiplexGenomeEditing,MultigeneInterference,andMultigeneActivation陳其軍中國農(nóng)業(yè)大學生物學院植物科學系植物生理學與生物化學國家重點實驗室研究技術交流與分享基因組編輯工具發(fā)展歷史與現(xiàn)狀基因組編輯（Genomeediting）或基因組工程（genomeengineering）或基因打靶（Genetargeting）歷史1993年前ZFN就已開始出現(xiàn)，迄今已發(fā)展了20多年才有今天的成就；2009年底出現(xiàn)的TALEN似乎一夜之間呈現(xiàn)出取代ZFN的架勢；2012年底CRISPR/Cas已顯現(xiàn)出取代TALEN的巨大潛力，在2013年成為現(xiàn)實。榮譽2011年：ZFN，TALEN和Meganuclease—2011年度方法（NatureMethods）2012年：TALEN—2012年十大突破（Science）2013年～：CRISPR/Cas被認為是諾貝爾獎級別的成果，華人科學家張峰已因此獲得生物醫(yī)學大獎?；蚪M編輯工具的應用基因組巡航導彈，分子剪刀，DNA外科醫(yī)生定點突變，定點修飾（包括得到轉(zhuǎn)基因），轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因治療（如遺傳病）

2013年CRISPR/Cas研究論文Science：2篇（同時發(fā)表）NatureBiotech：

8篇【其中5篇（包括植物方面3篇）同時發(fā)表】；Cell：4篇NatureMethods：3篇CellResearch：4篇【其中植物方面2篇】PNAS：1篇

2013年植物CRISPR/Cas研究論文Shan,

Q.,

Wang,

Y.,

Li,

J.,

Zhang,

Y.,

Chen,

K.,

Liang,

Z.,

Zhang,

K.,

Liu,

J.,

Xi,

J.

J.,

Qiu,

J.

L.,

and

Gao,

C.

(2013)

Targeted

genome

modification

of

crop

plants

using

a

CRISPR-Cas

system.

Nat.Biotechnol.

31:686-688.【水稻/小麥；非雙元載體】Li,

J.

F.,

Norville,

J.

E.,

Aach,

J.,

McCormack,

M.,

Zhang,

D.,

Bush,

J.,

Church,

G.

M.,

and

Sheen,

J.

(2013)

Multiplex

and

homologous

recombination-mediated

genome

editing

in

Arabidopsis

and

Nicotiana

benthamiana

using

guide

RNA

and

Cas9.

Nat.Biotechnol.

31:688-691.【擬南芥/煙草】Nekrasov,

V.,

Staskawicz,

B.,

Weigel,

D.,

Jones,

J.

D.,

and

Kamoun,

S.

(2013)

Targeted

mutagenesis

in

the

model

plant

Nicotiana

benthamiana

using

Cas9

RNA-guided

endonuclease.

Nat.Biotechnol.

31:691-693.【煙草】【上述3篇文章同時發(fā)表】Feng,

Z.,

Zhang,

B.,

Ding,

W.,

Liu,

X.,

Yang,

D.

L.,

Wei,

P.,

Cao,

F.,

Zhu,

S.,

Zhang,

F.,

Mao,

Y.,

and

Zhu,

J.

K.

(2013)

Efficient

genome

editing

in

plants

using

a

CRISPR/Cas

system.

Cell

Res.【擬南芥/水稻】

2013年植物CRISPR/Cas研究論文Xie,

K.

and

Yang,

Y.

(2013)

RNA-guided

Genome

Editing

in

Plants

Using

A

CRISPR-Cas

System.

Mol.Plant.【水稻】Mao,

Y.,

Zhang,

H.,

Xu,

N.,

Zhang,

B.,

Gao,

F.,

and

Zhu,

J.

K.

(2013)

Application

of

the

CRISPR-Cas

System

for

Efficient

Genome

Engineering

in

Plants.

Mol.Plant.

【擬南芥/水稻】Miao,

J.,

Guo,

D.,

Zhang,

J.,

Huang,

Q.,

Qin,

G.,

Zhang,

X.,

Wan,

J.,

Gu,

H.,

and

Qu,

L.J.

(2013).

Targeted

mutagenesis

in

rice

using

CRISPR-Cas

system.

Cell

Res.

23:

1233-1236.【水稻】Jiang,

W.,

Zhou,

H.,

Bi,

H.,

Fromm,

M.,

Yang,

B.,

and

Weeks,

D.P.

(2013).

Demonstration

of

CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated

targeted

gene

modification

in

Arabidopsis,

tobacco,

sorghum

and

rice.

Nucleic

Acids

Res.

PMID:

23999092.【擬南芥/煙草/高粱/水稻】/news/show/6268.html完美基因編輯：新方法可消除CRISPR-Cas的脫靶效應http:///news/show/6342.htmlCRISPR-Cas助力大規(guī)?；蚪M研究高彩霞等首次將CRISPR-Cas用于植物基因組編輯/news/show/6624.htmlScience：革命性基因編輯技術CRISPR狂潮來勢洶洶/news/show/6826.html基因組工程學里的三大利器——ZFN、TALEN和CRISPR/Cas/news/show/6897.htmlCell：張鋒揭示增加基因組編輯特異性的新方法http:///news/show/6944.htmlPNAS：清華大學開發(fā)基因組編輯新技術http:///news/show/7740.html/news/show/6236.html華人青年科學家張峰獲美國生物醫(yī)學大獎國內(nèi)專業(yè)網(wǎng)站有關CRISPR/Cas技術的報道生物360（郵件列表）Science：革命性基因編輯技術CRISPR狂潮來勢洶洶/news/show/6826.html生物谷（郵件列表）革命性基因編輯技術CRISPR漸成科學家新寵

http:///trends/news/580602.shtml生命奧秘雜志（郵件列表）CRISPR熱潮http:///?p=32833國內(nèi)專業(yè)網(wǎng)站有關CRISPR/Cas技術的報道Nucl.AcidsRes.-2013-DiCarlo-nar_gkt135原理Cas9gRNAgDNA20ntElizabethPennisi.

TheCRISPRCraze.Science23August2013;DOI:

10.1126/science.341.6148.833基因組編輯（基于DSB）NHEJHDR基因干擾基因激活原理設想一下：一個人（Cas9）拿著一把鑰匙（gRNA）去開一棟大樓中的某個房間。CRISPR/Cas技術在植物中應用存在的問題在斑馬魚、大鼠和小鼠中，通過向單細胞時期胚胎同時注射體外轉(zhuǎn)錄的Cas9

mRNA和gRNA，可以獲得雙位點突變的純合突變體動物。但在植物中不可行。在植物中需要獲得Cas9和gRNA的轉(zhuǎn)基因株系。農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化是植物轉(zhuǎn)基因的常規(guī)方法，但在已經(jīng)發(fā)表的8篇文章中，需要兩個克隆步驟才能完成農(nóng)桿菌雙元載體的構建：第一步構建gRNA表達框；第二步將gRNA表達框插入到雙元載體上。缺乏組裝3個以上gRNA表達框的方法；CRISPR/Cas工具不夠齊全，因而需要進一步完善以便用于基因表達調(diào)控等方面。2×35Sp-zCas9U6-26p-gRNAUbi1p-zCas9OsU3p-gRNACRISPR/Cas雙元載體結(jié)構VectornameCas9aPolIIIpromoterapHSN/BUN4013×FLAG-NLS-zCas9-NLS(4)AtU6-26(01)pHSN/BUN4113×FLAG-NLS-zCas9-NLS(4)OsU3p(11)pHSN/BUN501zCas9D10A(5)AtU6-26(01)pHSN/BUN601dCas9(6)AtU6-26(01)pHSN/BUN6A01dCas9-VP64(6A)AtU6-26(01)pHSN/BUN6B01dCas9-VP16-ER(6B)AtU6-26(01)pHSN/BUN6C01dCas9-VP64-ER(6C)AtU6-26(01)pHSN/BUN6D01dCas9-VP64-ER2(6D)AtU6-26(01)pHSN/BUN6E01dCas9-VP16-GR(6E)AtU6-26(01)pHSN/BUN6F01dCas9-KRAB(6F)AtU6-26(01)表1各種各樣的CRISPR/Cas雙元載體構建含1個gRNA的CRISPR/Cas雙元載體構建含2個gRNA的CRISPR/Cas雙元載體構建含4個gRNA的CRISPR/Cas雙元載體靶點選擇要點：N20NGG（正向或反向鏈）【必要】序列特異性檢查【必要】切割點應位于外顯子【必要】切割點最好位于酶切位點中央【可選】靶點最好是GN19NGG【可選】單基因選雙靶點可提高突變效率【可選】我們構建的CRISPR/Cas雙元載體使用極其簡單，用戶只需要1對各23-nt的oligo插入gRNA前面即可！真正做到規(guī)?；透咄?！對于模式植物擬南芥等而言，研究人員自己創(chuàng)制靶基因突變體的時代已經(jīng)來臨！使用CRISPR/Cas技術敲除玉米靶基因流程選擇靶點；構建CRISPR/Cas雙元表達載體；在玉米原生質(zhì)體中驗證靶點；轉(zhuǎn)化玉米幼胚；提取抗性愈傷基因組DNA；PCR或巢式PCR擴增含靶點DNA片段，酶切鑒定PCR片段，測序PCR片段確認突變類型；PCR及酶切鑒定再生植株，獲得雙位點突變體。若突變體為嵌合體，可以在下一代篩選分離的突變體。鑒定T2代種子，得到純合突變體。CACCTGGTGCTGTTCCATGTGCACCCGTTCTGGATCCAAGTCCTGTACTTCCTTTTGATCTCCGTTTTGGGTTTCTTGATGCTGAGAGTCCTGCCCATGAAGTCCAGCTCCGTGCCTAGGCCCTCGGCTCTGGACCTACTCTTCACGTCGGTGTCGGCGACGACAGTCTCCAGCATGATCGCCGTCGAGATGGAATCCTTCTCTAACGCGCAGCTCCTCCTCATGACCCTCCTTATGCTCCTCGGGGGCGAGGTGTTCACAAGCATGCTTGGTCTCCACTTCACCTGCACCAAGCTCAGAAACAAGAGAGAAACACCTCATAATAATCTCCATGGTAATAGCTTAGAGCAGAGTCGTCGTCGTCACCGTCCCATGGAGATGGAAGCCCAGGCCGCCGCCGTCCAAATGGAGCTTGCAGGGTTCAACAAGGACGGCCATGGCGATTTCGCATCCATGGCTAGgttgctaatgtttatcgtgctgggctacatcttggtcgtgcacatcgccggctacgcgctcattctaatctaccttagCGTGGTCGGCAGCGCGAGAGCAGTGCTTGTTAGGAAGAGGATCAGCCTGAGCACCTTCTCCGTCTTCACGGTCGTCTCGTCGTTCGCAAACTGTGGCTTCGTGCCAACCAA^CGAGGGGATGGTGTCCTTCAAGTCCTTCCCGGGC^ATGCTCCTCCTGGTCATGCCACACATCCTGCTCGGGAACACGCTCTTCCCCATCTTCCTCAGGCTCTCCATTACGGCGCTCGAGAGGGTCACAAGGTGGCGAGACCTCTGCGAGCTGCTGAGAGACAGAGGACCCGGCGGCGGGCCAGCTGCGGCTGCCGCCGCCGCCGCTATAGGCTACGACCACCTGCTCCCGGGACCGCGCACATGGTTCCTTGCTCTCACCGTGGCGGTGTTCCTGGCGGTGCAGCTGGTGCTCTACTGCGCCATGGAGTGGGGCTCCGGTGGCCTTGGAGGGCTCAACGCGTTCCAGAAGCTCGTTGCAGCGGTCTTCATGTCCGTCAACTCCAGGCACTCCGGCGAGATGGTCGTCGACCTCGCCACCGTCTCCTCCGCCGTCGTCGTGCTGTATGTGCTCATGATgtaagtacatacctgcacacatccatcgatccatctatcagaagatcatcggtagtgttaatttggatcagatcagaagtttgtgcactacatttatcatatacttatatatgtcatgcatgcacacagaaactatcattagttttttttctttaaataattttactcggttgctcatatgcttatttctcctcttcagGTATCTACCGCCTTACACTACATTTTTACCGGTAGCAGTGGAAGACGACCAGCAGCAGCAAAATGAGGCACAACCCCACGACAATAGCACGAGCAAGAGCAGCACAAGTATTAGCATCTGGCACAATCTGCTCATGTCGCCGCTCTCGTGCCTAACCATCTTCATCGTCGTCATCTGCATCACCGAGAGGCGGCAGATTGCTCGTGACCCAATCAACTTCAGCGTCCTCAACATCGTCGTCGAGGTCATCAGgtgtttatatatcactcctattatttaattaactgccggcgcgcgcaatagatctctcgcattgcagtggactgcgccattgaagcaataatccaacgtgctgatatgcatgcagTGCGTATGGCAACGTGGGATTCAGCACCGGGTACAGCTGCAGCAGGCAGGTGACGCCCGGCGGCGGCTGCTGCAAGGACGCGTGGGTTAGCTTGTCCGGCAAGTGGAGTGTGGAAGGGAAGCTCACGCTCATGGCCATCATGTTCTATGGCAGGCTCAAGAAGTTCAGCATGCTTGGGGGTCAGGCATGGAGGCTGAACTGAACCGAAGTACTATTTCGAAACTCGCTCGATCAACCTGATCTCCAGGACTCCAAGACTAGTACTTGAATTCTCAGTCTATTCAGACGGAACCGGATCATATGACAAATCCATCTGCGAGGAGTTTGGCTGCATTCTGTAAAGTCGGTAGGGGCAAGGGGTTGTTCATATCCTTTTTATTTAAAAATAAAAAATAGTTTTATZmHKT1genomicDNA(IDF0+IDR0=732bp/IDF+IDR=569bp)IDF0IDFIDR0IDRPAMXcmI20bptarget20bptargetSphIPAM5’-UTR3’-UTRExonhighlightedbyyellowintron玉米原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化實驗CRISPR/Cas雙元載體轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體，提取基因組DNA；巢式PCR擴增，酶切分析PCR產(chǎn)物；測序確認靶位點突變方式。ZmHKT1第1個靶點突變分析hCas9-1hCas9-2zCas9U6-26pOsU3pT7E1assay/SurveyorassayZmHKT1第1個靶點各種各樣的突變ZmHKT1第2個靶點突變分析使用兩個gRNA同時敲除3個擬南芥靶基因：載體1：p2gR-TRI-1TRI-T1-1-gRNA+TRI-T2-gRNA+zCas9載體2：p2gR-TRI-2TRI-T1-2-gRNA+TRI-T2-gRNA+zCas9測序分析轉(zhuǎn)基因株系3個靶位點突變（體細胞突變形成嵌合體）：PlantCRISPR/CastoolkitbasedonpCambiabinaryvectors(underway)2×35Sp-zCas9U6-26p-gRNApCambia1300–derived[Hyg(R)]2×35Sp-zCas9U6-26p-gRNApCambia3300–derived[Bar]2×35Sp-zCas9U6-26p-gRNApCambia2300–derived[Kan(R)]雙子葉轉(zhuǎn)化TypeIISAraIBbsI(BpiI)