第二章基因操作主要技術(shù)原理

第二章基因操作的主要技術(shù)原理密度梯度超速離心、電子顯微鏡技術(shù)、DNA分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、DNA序列結(jié)構(gòu)分析、基因的人工合成、基因的定點突變、PCR擴(kuò)增等重組DNA技術(shù)歷史上的主要事件年份事件1869F

Miescher首次從萊茵河鮭魚精子中分離DNA。1944O.T.Avery證實DNA是遺傳物質(zhì)。1952A.D.Hershey和M.Chase再次證實和噬菌體的遺傳物質(zhì)是DNA。1953J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型。

M.Wilkins用X-射線衍射法證實了這一結(jié)構(gòu)。1957A.Kornberg從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶I。1958M.

Meselson和F.W.Stahl提出了DNA的半保留復(fù)制模型。1959-1960S.Ochoa發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶和信使RNA，并證明mRNA決定了蛋白質(zhì)分子中的氨基酸序列。1961Nirenberg破譯了第一相遺傳密碼；F.Jacob和J.

Monod提出了調(diào)節(jié)基因表達(dá)的操縱子模型。1964C.

Yanofsky和S.Brenner等人證明，多肽鏈上的氨基酸序列與該基因中的核苷酸序列存在著共線性關(guān)系。1965196619701972-19731975-1977197819801981S.

W.Holley完成了酵母丙氨酸t(yī)RNA的全序列測定；科學(xué)家證明細(xì)菌的抗藥性通常由"質(zhì)粒"DNA所決定。M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破譯了全部遺傳密碼。H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分離了第一種限制性核酸內(nèi)切酶。H.M.Temin和D.Baltimore從RNA腫瘤病毒中發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶。H.Boyer，P.Berg等人發(fā)展了DNA重組技術(shù)，于72年獲得第一個重組DNA分子，73年完成第一例細(xì)菌基因克隆。F.Sanger與A.Maxam、W.Gilbert等人發(fā)明了DNA序列測定技術(shù)。

1977年完成了全長5387bp的噬菌體φ174基因組測定。首次在大腸桿菌中生產(chǎn)由人工合成基因表達(dá)的人腦激素和人胰島素。美國聯(lián)邦最高法院裁定微生物基因工程可以專利化。R.

D.

Palmiter和R.

L.

Brinster獲得轉(zhuǎn)基因小鼠；A.

C.

Spradling和G.

M.

Rubin得到轉(zhuǎn)基因果蠅。1982美、英批準(zhǔn)使用第一例基因工程藥物--胰島素；Sanger等人完成了入噬菌體48,502bp全序列測定。1983獲得第一例轉(zhuǎn)基因植物。1984斯坦福大學(xué)獲得關(guān)于重組DNA的專利。1986GMO首次在環(huán)境中釋放。1988J.

D.

Watson出任"人類基因組計劃"首席科學(xué)家。1989DuPont公司獲得轉(zhuǎn)腫瘤基因小鼠--"Oncomouse"。1992歐共體35個實驗室聯(lián)合完成酵母第三染色體全序列測定。1994第一批基因工程西紅柿在美國上市。1996完成了酵母基因組(1.25×107bp)全序列測定。1996英國愛丁堡羅斯林研究所獲得克隆羊。2000完成第一個高等植物擬南芥的全序列測定。2001完成第一個人類基因組全序列測定。2004中國科學(xué)家完成家蠶基因組全序列測定。2005中、美、日科學(xué)家聯(lián)合完成基因組全序列測定。它是一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實驗手段，同時也是分子生物學(xué)研究方法的技術(shù)基礎(chǔ)。第一節(jié)核酸的凝膠電泳1.

種類

按凝膠材料分:聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠電泳(普通瓊脂糖和低熔點瓊脂糖)按電泳裝置分:水平式/瓊脂糖凝膠;豎式/聚丙烯酰胺凝膠兩種方法比較：分離效果和分離范圍;操作難易用途瓊脂糖凝膠用于DNA和RNA的常規(guī)分析；聚丙烯酰胺凝膠常用于小分子核酸分析。凝膠電泳的一般程序制膠

點樣

電泳

染色

觀察DNA電泳DNA分子種類

線狀DNA—單鏈與雙鏈，ss-DNA電泳時要注意局部區(qū)域形成ds-DNA，造成遷移距離不確定環(huán)狀DNA—單鏈（如M13mp）和雙鏈（質(zhì)粒DNA）線狀ds-DNA電泳—使用頻率最高的一種電泳4)

環(huán)狀ds-DNA電泳:常用于質(zhì)粒DNA的初步鑒定5)

線狀ss-DNA電泳鏈分離凝膠：化學(xué)定序時，用于單鏈分離。DNA雙鏈互補(bǔ)，但組成不一樣，仍可分離（機(jī)理不詳），電泳時形成三條帶：變性雙鏈，兩條單鏈。核酸定序凝膠(染料指示劑)：為避免局部區(qū)域產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu)，可采用各種變性措施，如煮沸樣品，提高電泳溫度，凝膠中加

入變性劑（尿素、甲醛、

甲胺等）帶電荷的分子在電場中會以一定的速率 向與其電荷性質(zhì)相反的電極移動，速度 稱為電泳遷移率。電泳遷移率同電場的強(qiáng)度和分子本身所 帶的凈電荷數(shù)目成正比。電泳遷移率同分子與介質(zhì)的摩擦系數(shù)成 反比。一、電泳的基本原理摩擦系數(shù)主要與分子的大小、形狀以及介質(zhì)的粘度有關(guān)。如果電場強(qiáng)度一定（電壓和電極距離）、電泳介質(zhì)相同（電泳液和凝膠）：分子在電場中遷移的速度主要取決于分子本身的大小和構(gòu)型。形狀相似的分子的遷移速度主要與分子量相關(guān):分子量越大，移動越慢。同等分子量的不同構(gòu)型的核酸分子，構(gòu)型緊密的比松散型的開環(huán)DNA分子或線性

DNA分子遷移率要快在電泳過程中遷移的距離受以下幾個因素的影響：分子量的大小:遷移距離與分子量的常用對數(shù)成反比凝膠濃度:濃度越高，移動距離越短，適合分離低分子量DNA濃度越低，移動距離越長，適合分離高分子量DNA電壓:低電壓時，遷移率與 電壓成正比；電壓增高時， 不同大小DNA片段遷移率 增大是不同的。堿基組成與溫度:不受影響,溫度高可導(dǎo)致DNA帶變形或解鏈。RelaxedsupercoiledIncreasing

degree

of

supercoiling相同分子量的DNA:閉合環(huán)狀卷曲超螺旋遷移最快，線性分子次之，伸展開環(huán)狀最慢。二、瓊脂糖凝膠電泳1.

瓊脂糖2.

瓊脂糖凝膠瓊脂糖在水里（或電泳液）中加熱到沸點后溶解，冷卻后又凝固成均勻的的膠體“胨”。是一種線性多糖聚合物，從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來。分為常熔點的瓊脂糖和低熔點（LMP）瓊脂糖。瓊脂糖的濃度決定凝膠的空隙（密度）。濃度高 空隙小LMP瓊脂糖熔點：62～65℃熔解后，在37℃可保持液態(tài)數(shù)小時；在25℃可保持液態(tài)約10min瓊脂糖的濃度（%）分離DNA的片斷大小（bp）0.350000—10000.720000—10001.46000—300空隙小，分辨率高：小分子較易通過，而大分子難通過；空隙大，分辨率低：大小分子幾乎以同等速率通過。3.瓊脂糖凝膠的分辨力空隙大小決定其分辨分子大小的能力。瓊脂糖凝膠電泳的參數(shù)：緩沖液：1×

TAE（TBE

TPE）凝膠的含量：根據(jù)檢測的DNA大小加DNA樣品：<1μg，指示劑電泳條件：大片斷低電壓長時間，小片段高電壓短時間染色和觀察：溴化乙錠（ethidiumbromide，EB）染色，在300nm波長的紫外下觀察（凝膠成像

儀）。能看到0.05μg的微量DNA,DNA的片斷大小與熒光強(qiáng)度成正比Separation

Range

Vs.

%

AgaroseLow

Geling

Agarose

4-60.02-0.4四、凝膠染色1.

染料溴化乙錠。Ethidiumbromide（EB）EB是扁平分子，能插入DNA堿基之間，但不與瓊脂糖結(jié)合。EB在300nm紫外光照射下能發(fā)紅色熒光，即可顯示DNA泳帶在凝膠中所處的位置。熒光強(qiáng)度與DNA含量及大小成正比。2.

原理瓊脂糖電泳瓊脂糖凝膠電泳的基本操作步驟稱取瓊脂糖(根據(jù)檢測對象不同而定）加入量取緩沖液（TAE或TBE）總體積100mL→在微波爐內(nèi)加熱攪→降溫至大約60℃時，立即倒入靠近一端梳子的凝膠電泳槽→待凝膠完全凝結(jié)后，小心拔去梳子→倒入堿性磷酸緩沖液（超出膠面0．5cm）→加上DNA樣品→40V恒壓泳動→凝膠成像儀上觀察、照相→進(jìn)一步分析。用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA對DNA片斷大小的估算Sample

Well25

ng

1

kb

ladder0.8%

Agarose112kb108Agarose

GelElectrophoresisEtBr Detection

Limit:

~5-10 ng

DNA642根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DNA相對遷移距離推測待測定的DNA片段的大小Agarose

gel

electrophoresisAgarose

gel

electrophoresis回收DNA分子切出含需要DNA分子大小的凝膠在65℃下將LMP瓊脂糖凝膠熔化；加入過量的酚抽提DNA；離心獲得含DNA分子的上清液；直接酶切UVP全自動凝膠成像分析系統(tǒng)OMEGA8-LOGO全自動凝膠成像分析系統(tǒng)優(yōu)點是比瓊脂糖凝膠的分辨率高的多。聚丙烯酰胺凝膠濃度（%）分離DNA片斷大?。╞p）4.01000—10010.0500—2520.050—1三、聚丙烯酰胺凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳：1000——50000bp聚丙烯酰胺凝膠電泳：1——1000bp緩沖液：TBE凝膠聚丙烯酰胺：丙稀酰胺/亞甲雙丙稀酰胺（29：1）；TEMED和過硫酸銨（

10％）。PolyAcrylamide

Gels聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟1、組裝凝膠灌制裝置3、注入聚丙烯酰胺凝膠2、配膠點樣處加電壓-+去除鯊魚齒梳用1xTBE洗滌膠頂H21

Mo17622bp527bp404bp309bp242bp238bp217bp201bp190bp180bp160bp147bp123bp1984年，D.R.Cantor發(fā)明的，分離超大分子量的DNA分子在脈沖電泳中，電場方向是周期變化的，頭一個脈沖電場方向與核酸的移動方向成45℃角，下一個脈沖的電場方向與核酸移動方向在另一側(cè)成45℃角，由于加在瓊脂糖凝膠電泳上的電場方向、電流大小、以及作用時間都在交替地變換

著，這就使得DNA分子必須隨時調(diào)整其泳動的方向，來適

應(yīng)凝膠孔隙的無規(guī)則變化。

與分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要較多的次數(shù)來更換其構(gòu)型和方位，使之能夠按新的方向游動，所以遷移率就慢，從而達(dá)到了

分離大分子量DNA分子的目的。分離分子量高達(dá)107bp的DNA大分子四、脈沖電場凝膠電泳（PFGE）PFGE

can

resolve

large

DNA

fragments(molecule

hybridization)分子雜交是指在分子克隆中的一類核酸和蛋白質(zhì)分析方法，用已知標(biāo)記的核酸分子或蛋白質(zhì)分子檢測混合樣品中未知核酸分子或蛋白質(zhì)分子，以及其相對分子量大小。根據(jù)其檢測對象的不同可分為Southern

雜交、

Northern

雜交和Western雜交，及由此簡化的斑點雜交、狹線雜交和菌落雜交。第二節(jié)分子雜交分子雜交可在DNA與DNA、RNA與RNA或RNA與DNA的二條單鏈之間進(jìn)行，也可能在蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間進(jìn)行。核酸分子雜交是指核酸分子(DNA或RNA)在變性以后，在復(fù)性的過程中兩個不同來源的且同源的核酸分子形成雜合雙鏈的過程。通過各種方法將核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性標(biāo)記的探針與被固定的分子雜交，經(jīng)顯影后顯示出目的DNA或RNA分子所處的位置。DNA-DNA或DNA-RNA鏈雜交。用放射性同位素（32P或125I）標(biāo)記的DNA或RNA探針。核酸的分子雜交一、Southern

blot這種方法是E.M.Southern1975年建立,是進(jìn)行基因組DNA特定

序列定位的通用方法。用DNA（或RNA）探針檢測DNA樣品。（一）Southern雜交的操作步驟1.預(yù)處理：（1）用限制性內(nèi)切酶將基因組DNA進(jìn)行酶切。（2）將酶切后的DNA片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。（3）將電流出來的那塊凝膠泡在強(qiáng)堿溶液中，此時雙鏈的DNA樣品變成單鏈DNA結(jié)構(gòu)。（4）用酸中和，使單鏈DNA維持其單鏈狀態(tài)2.原位轉(zhuǎn)移：將凝膠上的單鏈DNA轉(zhuǎn)移到濾膜上。3.固定：在真空烤箱里，80℃下烤1-3h。將核酸樣品進(jìn)一步固定在濾膜上4.雜交：將濾膜移在含有放射性同位素標(biāo)記的探

針分子溶液中，溶液上的單鏈DNA分子與探針分子通過互補(bǔ)配對進(jìn)行雜交，形成雜種分子。5.漂洗：將濾膜上沒有和單鏈DNA樣品結(jié)合的游離的探針分子漂洗下來，此后濾膜上只有雜交分子。6.放射自顯影：在X光曝射下進(jìn)行放射自顯影形成自顯影圖片。7.比較鑒定：將放射自顯影圖片上的譜帶與凝膠上的譜帶進(jìn)行比較。確定與探針分子結(jié)合的DNA分子是凝膠上DNA鏈的那個片段。放射自顯影DNA印跡轉(zhuǎn)移探針雜交—＋Southern

Blotting的過程

1.堿變性的瓊脂糖凝膠電泳分離的DNA2.通過電泳液的移動轉(zhuǎn)移膠中的DNA3.固定膠中的DNA4.預(yù)雜交和雜交(放射性和熒光檢測)5.結(jié)果檢測Southern印跡雜交方法操作簡單，結(jié)果十分靈敏，在理想的條件下，應(yīng)用放射性同位素標(biāo)記的特異性探針和放射自顯影技術(shù)，即使每帶電泳條帶僅含有

2ng的DNA也能被清晰地檢測出來。Southernblot

篩選結(jié)果1.硝酸纖維素濾膜在印跡技術(shù)中，硝酸纖維素濾膜是目前應(yīng)用最廣的一種固相支持物，但它存在一些不足之處:（1）硝酸纖維素濾膜是依賴疏水性相互作用結(jié)合DNA的，這種結(jié)合并不十分牢固，隨著雜交及洗膜進(jìn)程，DNA會慢慢脫離硝酸纖維素濾膜，從而使雜交效率下降。（二）Southern雜交的雜交濾膜硝酸纖維素濾膜質(zhì)地較脆弱，容易碎裂，因此操作須小心謹(jǐn)慎(特別是經(jīng)烘烤后)。硝酸纖維素濾膜與核酸的結(jié)合有賴于高鹽濃度，在低鹽濃度時結(jié)合DNA效果不佳，不適宜于電轉(zhuǎn)印跡法。硝酸纖維素濾膜對于小分子質(zhì)量的

DNA片段(特別是小于200bp的DNA片段)結(jié)合能力不強(qiáng)。尼龍膜優(yōu)點：結(jié)合DNA和RNA的能力強(qiáng)于硝酸纖維素濾膜，對小分子質(zhì)量的核酸也能較好地結(jié)合。尼龍膜韌性強(qiáng)，操作較方便，對離子濃度要求不高，可重復(fù)用于雜交。缺點：雜交信號本底較硝酸纖維素濾膜高。二、Northern

blot將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實驗方法。用DNA（或RNA）探針檢測RNA樣品。Northern雜交的過程①提取總RNA。②分離mRNA。利用親和層析的原理純化

mRNA。③制備RNA探針。根據(jù)mRNA序列合成同源

DNA探針，或以cDNA為探針。④Northern雜交。Northern雜交的方法包括點雜交和印跡雜交，兩者都能鑒定外源基因是否得到轉(zhuǎn)錄，但后者還能確定mRNA分子質(zhì)量大小及豐度。三 菌落原位雜交（colony

in

situ

hybridization）1975年，M.Grunstein和D.Hosnese根據(jù)檢測重組子DNA分子的核酸雜交技術(shù)原理,對

Southern印跡技術(shù)作了一些修改,提出了菌落原位雜交技術(shù)。該項技術(shù)是直接把菌落印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上,經(jīng)溶菌和變性處理后使DNA暴露出來并與濾膜原位結(jié)合,再與特異性DNA探針雜交,篩選出含有插入序列的菌落。對應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽性菌落。需要目的基因的探針。菌落原位雜交的操作步驟ABC法四Western雜交是將蛋白質(zhì)電泳、印跡和免疫測定結(jié)合在一起的檢測方法，具有很高的靈敏度，可從總蛋白中檢測出50ng的特異性表達(dá)蛋白。蛋白質(zhì)混合樣本經(jīng)過SDS-PAGE電泳后，分離為不同的條帶，其中含有能與特異性抗血清或單克隆抗體相應(yīng)的待檢測蛋白質(zhì)（抗原蛋白）。Step

1.

Antibody

Recognitionof

target

protein/antigenStep

2. Secondary

Antibodyrecognition

of

primary

AbStep

3. Color

DevelopmentWestern雜交的操作步驟Wes