實(shí)驗(yàn)一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)測(cè)定和沉淀反應(yīng)

實(shí)驗(yàn)一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)測(cè)定和沉淀反應(yīng)第一頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)2、學(xué)習(xí)測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的一種方法3、加深對(duì)蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定因素的認(rèn)識(shí)4、了解沉淀蛋白質(zhì)的幾種方法及其實(shí)用意義5、了解蛋白質(zhì)變性與沉淀的關(guān)系

第二頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二二、實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。在蛋白質(zhì)溶液中存在下列平衡：蛋白質(zhì)分子的解離狀態(tài)和解離程度受溶液的酸堿度影響。第三頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二當(dāng)溶液的pH為一定值時(shí)，蛋白質(zhì)極性基團(tuán)解離的正負(fù)離子數(shù)相等，凈電荷為0，此溶液的pH值為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。不同蛋白質(zhì)具有各自特定的等電點(diǎn)，與該蛋白質(zhì)的組成結(jié)構(gòu)有關(guān)。在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)都有變化，可利用性質(zhì)的變化測(cè)定各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。常用方法：測(cè)其溶解度最低時(shí)的溶液pH值。問題：蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定還有哪些方法?第四頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二本實(shí)驗(yàn)通過觀察不同pH溶液中酪蛋白的溶解度來(lái)測(cè)定其等電點(diǎn)。用醋酸與醋酸鈉（醋酸鈉混合在酪蛋白溶液中）配制各種不同pH值的緩沖液。向各緩沖溶液中加入酪蛋白后，沉淀出現(xiàn)最多的緩沖液的pH值即為酪蛋白的等電點(diǎn)。第五頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二在水溶液中，蛋白質(zhì)分子由于表面生成水化層和雙電層而成為穩(wěn)定的親水膠體。在一定的理化因素影響下，蛋白質(zhì)顆?？梢蚴ル姾珊兔撍恋怼５鞍踪|(zhì)的沉淀反應(yīng)可分為兩類。第六頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二可逆的沉淀反應(yīng)

蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)尚未發(fā)生顯著變化，除去引起沉淀的因素后，蛋白質(zhì)的沉淀仍能溶解于原來(lái)的溶劑中，并保持其天然性質(zhì)而不變性。如：鹽析作用、低溫下用乙醇（丙酮）短時(shí)間作用于蛋白質(zhì)。提純蛋白質(zhì)時(shí)，常利用此類反應(yīng)。問題：提純蛋白質(zhì)時(shí)常用的沉淀方法有哪些?第七頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二不可逆沉淀反應(yīng)蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生重大改變，蛋白質(zhì)常變性而沉淀，不再溶于原來(lái)溶劑中。加熱引起的蛋白質(zhì)沉淀與凝固，蛋白質(zhì)與重金屬離子或某些有機(jī)酸的反應(yīng)都屬于此類。問題：這些不可逆的沉淀反應(yīng)有哪些應(yīng)用?第八頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二蛋白質(zhì)變性后，有時(shí)由于維持溶液穩(wěn)定的條件仍然存在（如電荷），并不析出。因此變性蛋白質(zhì)并不一定都表現(xiàn)為沉淀，而沉淀的蛋白質(zhì)也未必都已變性。第九頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二三、試劑器材1、實(shí)驗(yàn)材料雞蛋清牛奶2、儀器設(shè)備

水浴鍋溫度計(jì)錐形瓶100mL容量瓶吸管試管及試管架

第十頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二0.4%酪蛋白乙酸鈉溶液：取20mL牛奶，加入10mL1mol/LNaAC,用去離子水定容至100mL

1.00mol/L醋酸溶液0.10mol/L醋酸溶液0.01mol/L醋酸溶液3、試劑第十一頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二蛋白質(zhì)溶液：5%卵清蛋白溶液或雞蛋清的水溶液（新鮮雞蛋清:水=1:9）0.2M醋酸-醋酸鈉緩沖液，pH4.73%硝酸銀溶液5%三氯乙酸溶液95%乙醇飽和硫酸銨溶液：25℃，100mL水＋76.7g硫酸銨0.1M鹽酸溶液0.1M氫氧化鈉溶液0.05M碳酸鈉溶液0.1M醋酸溶液甲基紅溶液：pH變色范圍為4.4-6.2，由紅變黃

第十二頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二四、實(shí)驗(yàn)操作（一）酪蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定（1）取4支試管，按下表順序分別加入各試劑，混勻。試管號(hào)蒸餾水mL0.01M醋酸mL0.1M醋酸mL1.0M醋酸mL18.40.6-—28.7-0.3—38.0-1.0—47.4--1.6第十三頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二（2）向以上試管中各加酪蛋白的醋酸鈉溶液1mL，加一管，搖勻一管。此時(shí)1、2、3、4管的pH依次為5.9、5.5、4.7、3.5。觀察其混濁度。靜置10分鐘后，再觀察其混濁度。最混濁（有顆粒沉淀）的一管pH即為酪蛋白的等電點(diǎn)。第十四頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二（二）蛋白質(zhì)沉淀實(shí)驗(yàn)第十五頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二1.蛋白質(zhì)的鹽析加5%卵清蛋白溶液5mL于試管中，再加等量飽和硫酸銨溶液，混勻后靜置數(shù)分鐘則析出球蛋白的沉淀。離心，取沉淀，加少量水，觀察是否溶解。離心后上清液中添加硫酸銨粉末到不再溶解為止，此時(shí)析出的沉淀為清蛋白。離心，取出部分清蛋白，加少量蒸餾水，觀察沉淀能否重新溶解。第十六頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二2.重金屬離子沉淀蛋白質(zhì)取1支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2mL，再加3%硝酸銀溶液1~2滴，振蕩試管，有沉淀產(chǎn)生。離心傾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？為什么？

第十七頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二3．有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)取1支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2mL，再加1mL5%三氯乙酸溶液，振蕩試管，觀察沉淀的生成。離心傾去上清液，向沉淀中加入少量水，觀察沉淀是否溶解。第十八頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二4．有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)取1支試管，加入2mL蛋白質(zhì)溶液，再加入2mL95%乙醇?；靹?，觀察沉淀的生成。第十九頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二5．乙醇引起的變性與沉淀

取3支試管，編號(hào)，依下表順序加入試劑：

試劑

mL

管號(hào)

5%卵清蛋白0.1M氫氧化鈉0.1M鹽酸pH4.7緩沖液

95%乙醇

111121113111第二十頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二振搖混勻后，觀察各管有何變化。放置片刻，向各管內(nèi)加水8mL。在2、3號(hào)管中各加一滴甲基紅，分別用0.1M醋酸溶液及0.05M碳酸鈉溶液中和。觀察顏色的變化和沉淀的生成。每管再加0.1M鹽酸溶液數(shù)滴，觀察沉淀的再溶解。解釋各管發(fā)生的全部現(xiàn)象。提示：卵清蛋白等電點(diǎn)4.7第二十一頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析：按照實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果并分析。研討：通過本次實(shí)驗(yàn)，有否對(duì)該項(xiàng)目改進(jìn)的合理建議。

解釋鹽析、有機(jī)溶劑、等電點(diǎn)、重金屬、有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)的不同機(jī)理。查閱資料，介紹蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定方法。查閱資料，介紹生物大分子制備常用的沉淀方法。蛋白質(zhì)變性有哪些方面的應(yīng)用？大組總結(jié)交流（PPT）：內(nèi)容：實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析，課后研討題，實(shí)驗(yàn)體會(huì)等。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與報(bào)告第二十二頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)結(jié)果管號(hào)pH值混濁度解釋現(xiàn)象1234（一）酪蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定第二十三頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二（二）蛋白質(zhì)沉淀實(shí)驗(yàn)1．蛋白質(zhì)的鹽析現(xiàn)象解釋蛋白質(zhì)溶液中加硫酸銨溶液加水上清液中加硫酸銨粉末加水第二十四頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二2．重金屬離子沉淀蛋白質(zhì)

現(xiàn)

象解

釋蛋白質(zhì)溶液中加硝酸銀

沉淀中加水

第二十五頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二3．有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)

現(xiàn)

象解

釋蛋白質(zhì)溶液中加三氯乙酸

沉淀中加水

第二十六頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于20