藥物設(shè)計-第五章-案例分析課件

第五章

案例分析藥物設(shè)計案例分析一：波西匹韋的發(fā)現(xiàn)

案例分析二：抗瘧藥物靶點PlasmepsinⅡ

抑制劑的篩選

案例分析三：基于靶點結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計在

HIV蛋白酶先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)的

應(yīng)用案例分析一：波西匹韋的發(fā)現(xiàn)

一、研究背景丙型肝炎由丙型肝炎病毒（HCV）感染所致，主要經(jīng)血液/體液傳播。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球HCV的感染率約為3%，約1.8億人感染HCV，60%~70%的感染人群發(fā)病，可導(dǎo)致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化，部分患者可發(fā)展為肝硬化甚至肝癌。HCV是一種高度易變異性病毒，根據(jù)其基因序列的差異，可以分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等6種基因型和12種基因亞型，各基因型間沒有免疫力，相互之間可以重復(fù)感染，這使得研制預(yù)防性和治療性疫苗存在很大困難。近5年抗丙型肝炎藥物取得重大突破，下面以NS3/4A蛋白酶抑制劑（NS3/4Aproteaseinhibitor）波西匹韋（baceprevir）為例，說明基于酶蛋白結(jié)構(gòu)的合理設(shè)計過程。NS3/4A蛋白酶對HCV的生長和增殖具有重要作用，是研究抗HCV藥物的理想靶標(biāo)。NS3/4A蛋白酶的單晶X射線分析提示，其活性中心是處于酶的表面，呈平坦?fàn)钫归_，沒有明顯特征的疏水性結(jié)構(gòu)域，而且被水分子覆蓋。催化核心是由N端的His57和Asp81、C端的Ser139三元體構(gòu)成。底物P1位置為Cys或The，P1'為疏水性、小體積氨基酸Ala或Ser，P2、P3和P4為疏水性氨基酸，P5和P6為Asp或Glu等酸性氨基酸殘基。二、苗頭化合物的發(fā)現(xiàn)由于酶與底物的結(jié)合以在較大范圍發(fā)生、多位點的弱結(jié)合力為特征，研究篩選小分子化合物以其達(dá)到抑制NS3/4A蛋白酶的目的并不成功，而模擬天然底物的長鏈肽，進(jìn)行設(shè)計與修飾成為有效途徑?；衔铮?-50）與NS3/4A蛋白酶活性中心的結(jié)構(gòu)相匹配，且酮基酰胺處于合適的位置，可與Ser139發(fā)生親核性進(jìn)攻，形成穩(wěn)定的共價鍵，成為不可逆性抑制劑，如下圖所示。α-酮基酰胺片段與絲氨酸的羥基發(fā)生親核進(jìn)攻形成共價結(jié)合的示意圖三、先導(dǎo)化合物的確定及優(yōu)化1.減少氨基酸殘基，由十一肽減為五肽2.改變側(cè)鏈基團(tuán)，再減少氨基酸殘基四、上市藥物波西匹韋的確定在臨床前研究中，化合物（4-53）表現(xiàn)出良好的開發(fā)價值，被命名為波西匹韋（baceprevir），最終在2011年5月上市。波西匹韋與NS3/4A復(fù)合物的單晶X射線衍射圖顯示，兩個叔丁基分別與S4和S3疏水腔發(fā)生疏水相互作用，P2的二甲基環(huán)丙并脯氨酸片段呈彎曲構(gòu)象，與酶的Ala156、His57和Arg155側(cè)鏈發(fā)生最大限度的疏水性交蓋，環(huán)丁基占據(jù)了S1腔，α-酮基酰胺的羰基與Ser139形成可逆的共價結(jié)合，整個化合物骨架與酶發(fā)生多處的氫鍵結(jié)合。波西匹韋與NS3/4A復(fù)合物單晶X射線衍射圖索非布韋片（Sovaldi）索非布韋片（Sovaldi，通用名：Sofosbuvir）是由Pharmasset公司研制后被吉利德（Gilead）2011年以110億美元收購的丙型肝炎藥物，是一種NS5B聚合酶抑制劑。2013年12月6日獲得FDA批準(zhǔn)用于基因1型，2型，3型和4型慢性丙型肝炎（Hepatitis

C）成人患者的治療。2014年9月14日吉列德和印度7家仿制藥廠達(dá)成的非排他自愿授權(quán)協(xié)議，后來又陸續(xù)有其他藥廠加入該協(xié)議。索非布韋片（Sovaldi）2017.09.21，中國人終于迎來了吉利德第一代丙肝藥即Sovaldi(sofosbuvir)的上市，11月27日吉利德公布丙肝藥索非布韋在華售價，最終定價為19660元/瓶，銷售規(guī)格為28片/瓶的索非布韋片。按照每三個月為一個療程來計算，則一個療程的價格為58980元。案例分析二：

抗瘧藥物靶點PlasmepsinⅡ

抑制劑的篩選瘧疾是一種由寄生蟲引起的疾病，每年都有高達(dá)300百萬～500百萬的人飽受其折磨，而其中1百萬～2百萬的患者會因無法治愈而導(dǎo)致死亡。據(jù)WHO統(tǒng)計，2009年全球有2.25億人感染瘧疾，并有781

000人死于該疾病。據(jù)估算，將近40%的世界人口所居住的地區(qū)，瘧疾都是區(qū)域性疾病。由于治療條件及藥物的濫用，一些傳統(tǒng)的抗瘧藥物如氯喹和青蒿素也逐漸出現(xiàn)了使用耐藥性，感染瘧疾和死亡的人數(shù)又進(jìn)一步增加。Plasmodiumfalciparum（惡性瘧原蟲）是四種瘧原蟲中最危險的一種，也是感染人類以及引起死亡率達(dá)95%的主要原因。隨著P.falciparum抗藥性對現(xiàn)有醫(yī)療手段阻力的增加，瘧疾逐漸引起國際健康協(xié)會對其的高度重視。瘧原蟲能夠降解宿主紅細(xì)胞內(nèi)的大部分血紅蛋白，并且利用這一機制得到的氨基酸合成自身的蛋白質(zhì)。幾種不同類型的酶一次參與催化降解血紅蛋白的過程，分別是天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶和胞質(zhì)氨肽酶。Plasmepsins屬于天冬氨酸蛋白酶家族，惡性瘧原蟲編碼10個天冬氨酸蛋白酶，其中四個蛋白酶能降解血紅蛋白，分別是Plm

I、Plm

II、HAP和Plm

IV。PM

I和PM

II能夠催化血紅蛋白α鏈Phe33和Leu34實現(xiàn)最初降解，隨著對其功能研究的深入，PM

II現(xiàn)已成為一個抗瘧藥物研發(fā)最具吸引力的靶標(biāo)之一。Hague等報道了利用幾個重復(fù)的數(shù)據(jù)庫，采用組合化學(xué)和基于結(jié)構(gòu)設(shè)計的方法相結(jié)合的方式，來辨別幾個具有潛在活性（Ki＝2～10nmol/L）和具有選擇性（相對于組織蛋白酶高達(dá)15倍）、低分子量的抑制劑。羥基乙胺核心結(jié)構(gòu)Haque等對PlmⅡ的潛在抑制劑研究，從對比PlmⅡ和組織蛋白酶D（Cathepsin

D,

CatD）與基于肽的天然產(chǎn)物抑肽素(pepstatin)共聚晶體結(jié)構(gòu)出發(fā)。PlmⅡ和CatD具有明顯的序列同源性（35%），而在活性位點區(qū)域，其序列同源性更高。之前，他們采用設(shè)計、合成和虛篩一個含有1039個化合物的抑制劑數(shù)據(jù)庫，已成功驗證了潛在CatD抑制劑，研究發(fā)現(xiàn)具有羥基乙胺核心結(jié)構(gòu)的化合物對PlmⅡ和CatD均有很好的抑制活性。由于PlmⅡ和CatD的相似性，他們通過虛篩該數(shù)據(jù)庫為得到先導(dǎo)化合物?；诮Y(jié)構(gòu)設(shè)計的策略案例分析三：

基于靶點結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計在HIV蛋白酶先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)的應(yīng)用美國1981年報告首例AIDS病例。AZT是首次經(jīng)FDA批準(zhǔn)用于臨床的抗AIDS藥物，它與隨后批準(zhǔn)的DDI、DDC、D4T和3TC同屬核苷類HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。AIDS主要由HIV-1引起，有多種酶發(fā)揮作用，其中逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)、蛋白酶(PR)和整合酶(IN)受到現(xiàn)代藥物開發(fā)關(guān)注。HIV-1蛋白酶是天門冬氨酸屬蛋白水解酶，是由兩條肽鏈組成的同質(zhì)二聚體(homodimer)，每一條肽鏈由99個氨基酸組成。Peal等測定了HIV-1蛋白酶晶體的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)有C2對稱軸，其活性中心由兩部分組成。一、研發(fā)背景一、研發(fā)背景當(dāng)前以HIV-1蛋白酶為靶點尋找蛋白酶抑制劑可歸納為3個研究方向：（1）根據(jù)HIV-1蛋白酶具有C2對稱軸，設(shè)計能夠阻止兩個單體聚合或?qū)⒁丫酆系亩垠w解聚的化合物。（2）大部分抑制劑是根據(jù)HIV的gag和gag-pol基因產(chǎn)物中至少存在7個裂解鍵而設(shè)計的，用不易裂解的化學(xué)鍵替代肽底物中的酰胺鍵，以合成肽底物的類似物。（3）通過大規(guī)模普篩及借助于晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)和計算機分子圖形學(xué)的計算機輔助藥物設(shè)計（CADD）尋找生物活性較強的小分子非肽類抑制劑，再進(jìn)一步結(jié)構(gòu)優(yōu)化。這個研究方向已成為研制新型的抗艾滋病藥物的一個新熱點。二、先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)研究表明，每個HIV-1蛋白酶亞基由99個氨基酸殘基組成，該酶抑制劑必須具有滲透細(xì)胞膜的能力。通過對HIV-1蛋白酶與天門冬氨酸蛋白酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，并借助X-衍射波譜的結(jié)果，人們獲得了高精確度（1.8nm）的HIV-1蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)，并建立起該酶的結(jié)構(gòu)模型。

隨后，Kuntz等人于1990年根據(jù)其晶體結(jié)構(gòu)中的酶活性部位，利用DOCK程序?qū)蚓w數(shù)據(jù)庫中的10000個分子與之進(jìn)行分子對接虛擬篩選，并按照打分?jǐn)?shù)值的高低排列。然后對打分值最高的200個化合物進(jìn)行嚴(yán)格篩選，選擇那些帶有羥基或氨基且易于合成的化合物，并評價這些分子能否與酶的Asp25發(fā)生相互作用。最后發(fā)現(xiàn)其中一個化合物bromoperidol（11-60）具有較好的結(jié)合作用。通過肽底物的酶活性檢定法進(jìn)行藥理篩選，結(jié)果表明haloperidol（11-61）有抑制HIV-1蛋白酶的活性（Ki＝100μmol/L，IC50＝0.25mmol/L，IC90＝2.0mmol/L）。另外，此化合物對HIV-1蛋白酶同屬天冬氨酸蛋白酶的人血管緊張肽原酶（humanrenin）無抑制作用，對胃蛋白酶（pepsin）的抑制作用較弱，其選擇性較高。

隨后他們對此化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾與改造，得到硫縮酮衍生物thioketal（11-62），此化合物對HIV-1蛋白酶的抑制活性為15μmol/L，其活性得到進(jìn)一步的提高。隨后他們對化合物thioketal（11-62）與HIV-l蛋白酶復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其結(jié)合模式與分子對接得到的結(jié)果略有不同。進(jìn)一步閱讀Brik

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