用ImageProPlus分析免疫組化圖片課件整理

用Image-ProPlus(IPP分析免疫組化圖片Mediacybernetics1免疫組化圖片分析原理根據(jù)染色染料顏色的深淺(光密度)及分布面積大小來(lái)確定目標(biāo)蛋白的量染色區(qū)域分布面積與目標(biāo)蛋白量成正比染色的顏色深淺(光密度)與目標(biāo)蛋白量的定量關(guān)系符合朗伯-比爾定律,是對(duì)數(shù)關(guān)系11光密度與灰度一迷惑人的不同概念光密度:吸收光的物質(zhì)的光學(xué)密度。(opticaldensity,就是常說(shuō)的OD值)光密度值是直接與染色物質(zhì)的量相關(guān)的?；叶?灰是不夠黑,是反射亮度的單位。電子照片上像素的亮度稱為灰度Gray:betweenwhiteandblackExample1.Thebrightvalueondisplayscreenisgrayvalue2.Thedarkvalueonawhitepaperisalsothegrayvalueblackwhitegray=0gray-256Opticaldensity吸收光線的物質(zhì)的光學(xué)密度■被測(cè)物質(zhì)的量越多,光密度(○D值)越高,透射出的光越少,反映在照片上就越黑■OD值與物質(zhì)的量直接相關(guān),灰度值與○D值成對(duì)數(shù)關(guān)系,符合朗伯-比爾定律理論上○D值是從零到無(wú)窮大。實(shí)際應(yīng)用中,○D值的范圍常用0-2.0或者0-30blackwhiteOD=infinitOD=0用OD值是正確的分光光度計(jì)與酶標(biāo)儀的測(cè)定值是OD值透射的顯微鏡圖象上的光強(qiáng)度要用OD值■蛋白電泳條帶的測(cè)量也是○D值。螢光顯微鏡及螢光分光光度計(jì)的測(cè)量值是螢光強(qiáng)度(Fluorescenceintensity)用EB染色的DNA凝膠電泳條帶也是螢光強(qiáng)度,但處理方法與光密度相同,故也用OD值。這個(gè)OD與前面的OD又有不同的意義。它就是熒光的光密度。反映著熒光物質(zhì)的多少。WesternBlot條帶的測(cè)定也要使用○D值來(lái)進(jìn)行定量處理照片時(shí)用的卻是灰度各種圖象被拍攝成照片進(jìn)行數(shù)字圖象處理時(shí),是對(duì)照片的灰度進(jìn)行測(cè)量和計(jì)算的。但最后得到的結(jié)果還是需要換算回○D值來(lái)表達(dá)。所以對(duì)免疫組化照片的分析結(jié)果應(yīng)該是一個(gè)OD值,光密度。不應(yīng)該是灰度。準(zhǔn)確地說(shuō),是對(duì)免疫組化照片的特定染色區(qū)域的灰度進(jìn)行分析從而測(cè)量出組織切片的光密度值用標(biāo)準(zhǔn)樣品才能把OD值與樣品量關(guān)聯(lián)到一起OD值是一個(gè)沒(méi)有單位的相對(duì)值。使用酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)時(shí)要作標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)電泳條帶進(jìn)行定量分析時(shí)一樣要作標(biāo)準(zhǔn)曲線。電泳條帶照片的灰度值與樣品量的關(guān)系為指數(shù)函數(shù)。在把灰度值轉(zhuǎn)換成OD值時(shí),用一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)進(jìn)行定量分析是不準(zhǔn)確的。多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線亦有很大誤差,因此只能說(shuō)是半定量分析。在實(shí)際應(yīng)用時(shí),可以直接測(cè)量○D值,用以表達(dá)染色物質(zhì)的相對(duì)的量1.2定量分析的指標(biāo):IOD(Integratedoptiondensity)density將圖片上各點(diǎn)的光密度值累加起來(lái),得到|OD。此值與目標(biāo)物質(zhì)的總量成正比。|○D值除以目標(biāo)分布區(qū)域的面積,得到平均density,此值反映了目標(biāo)物質(zhì)的單位面積濃度。對(duì)樣品照片進(jìn)行數(shù)字圖像分析比較時(shí)