第七章酶制劑生產(chǎn)課件

第八章酶制劑生產(chǎn)前言20世紀(jì)20年代，法國(guó)人Biondin與Effront

在德國(guó)建廠生產(chǎn)枯草桿菌淀粉酶來代替麥芽淀粉酶，用于棉布褪漿，為微生物酶的工業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。40年代，抗生素工業(yè)興起，深層培養(yǎng)技術(shù)不久就被用于淀粉酶的制造，使酶制劑工業(yè)跨進(jìn)了工業(yè)化生產(chǎn)的時(shí)代。50年代末，糖化酶成功用于葡萄糖生產(chǎn)，革除了沿用上百年的酸水解工藝。60年代中期，加酶洗滌劑大流行，進(jìn)一步促進(jìn)了酶制劑工業(yè)的發(fā)展。70年代初固定化葡萄糖異構(gòu)酶用于生產(chǎn)果脯糖漿，大大推動(dòng)了食品工業(yè)與酶制劑工業(yè)的發(fā)展。隨著酶制劑的普遍應(yīng)用與固定化酶的廣泛研究，促進(jìn)了生物催化技術(shù)與化學(xué)工程密切結(jié)合，誕生了一門新學(xué)科酶工程1971年在美國(guó)召開第一次國(guó)際酶工程會(huì)議，把大規(guī)模生產(chǎn)、分離提純、固定化技術(shù)、酶反應(yīng)器設(shè)計(jì)，以及酶的工業(yè)應(yīng)用都納入了酶工程的范圍，并成為當(dāng)時(shí)（20世紀(jì)70年代至80年代中期）初生物技術(shù)五大技術(shù)體系中最活躍、發(fā)展最快、成效最大的一個(gè)體系。第一節(jié)酶制劑的工業(yè)化生產(chǎn)一、工業(yè)化酶制劑生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)自1894年米曲霉高峰淀粉酶問世，1923年枯草桿菌а-淀粉酶工業(yè)化應(yīng)用以來，微生物酶制劑工業(yè)逐漸發(fā)展成為一個(gè)新興的產(chǎn)業(yè)部門，發(fā)展勢(shì)頭方興未艾。目前的800多種商品酶中，大多數(shù)是利用微生物生產(chǎn)的。利用微生物發(fā)酵法大規(guī)模生產(chǎn)酶制劑，具有以下幾個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)。優(yōu)點(diǎn)（一）酶的品種多，新酶種易得微生物種類繁多，凡是動(dòng)植物體內(nèi)存在的酶，幾乎都能從微生物中得到；倒是有許多酶目前還只在微生物中發(fā)現(xiàn)，而未能從動(dòng)植物中找到。（二）菌種易誘變，代謝易調(diào)控微生物代謝方式各種各樣，又極易受外界因素的影響，很容易通過誘變等簡(jiǎn)便的育種方法改變?cè)瓉淼拇x途徑，得到預(yù)想的代謝途徑，實(shí)現(xiàn)代謝的人為調(diào)控。（三）生產(chǎn)周期短，酶的產(chǎn)量大微生物細(xì)胞構(gòu)造簡(jiǎn)單，沒有分化的營(yíng)養(yǎng)器官，而是以細(xì)胞表面直接與環(huán)境接觸，所以代謝速度比高等生物快得多，其繁殖速度快，生產(chǎn)效率高，生產(chǎn)周期短，培養(yǎng)簡(jiǎn)便，并可通過控制培養(yǎng)條件提高酶的產(chǎn)量。相比動(dòng)植物組織酶提取，不受動(dòng)植物原料量和來源的約束，周期短，產(chǎn)酶量大（四）基因易操縱，優(yōu)質(zhì)種易得基因工程技術(shù)中，以微生物為對(duì)象的研究水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)領(lǐng)先于動(dòng)植物，進(jìn)行微生物的基因改造要比動(dòng)植物方便得多，技術(shù)水平也成熟得多。生物技術(shù)在酶工程中的應(yīng)用（如多拷貝酶基因的菌種）遠(yuǎn)遠(yuǎn)領(lǐng)先于其他工程體系，早已產(chǎn)業(yè)化，并產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。二、酶制劑生產(chǎn)的基本工藝流程（一）基本工藝流程圖微生物發(fā)酵法生產(chǎn)酶制劑，分固態(tài)發(fā)酵法、液態(tài)發(fā)酵法和載體發(fā)酵法三大類。由于載體發(fā)酵法還沒有用于大規(guī)模生產(chǎn)，以介紹固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵為主。雖然因?yàn)榫唧w的生產(chǎn)菌不同、目的酶不同、生產(chǎn)設(shè)備不同、生產(chǎn)條件不同，采用的工藝有所不同，但酶制劑生產(chǎn)基本工藝流程大致如圖8-1工藝要點(diǎn)固態(tài)發(fā)酵法（1)原料處理碳源,淀粉質(zhì);氮源,麩皮(2)菌種培育與接種：液體、固體等(3)無菌要求相對(duì)較低(4)發(fā)酵工藝控制好溫度和濕度，不需要調(diào)節(jié)PH(5)提取純化成熟曲烘干、粉碎、過篩，得到粗酶粉。精制則加水抽提，分離去除固形物，濃縮，鹽析或有機(jī)溶劑沉淀，離子交換層析進(jìn)一步純化。2.液體發(fā)酵法（1)原料處理：葡萄糖等單糖為碳源(2)菌種培育與接種：液體培養(yǎng)，幾級(jí)罐(3)無菌要求要求較高(4)發(fā)酵工藝控制PH、溫度、通風(fēng)量(5)提取純化真空濃縮得酶液。精制則加水抽提，分離去除固形物，濃縮，鹽析或有機(jī)溶劑沉淀，離子交換層析進(jìn)一步純化第二節(jié)淀粉酶

淀粉酶是水解淀粉物質(zhì)的一類酶的總稱，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中。它是最早實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)并且至今為止應(yīng)用最廣、產(chǎn)量最大的一類酶制劑。按照水解淀粉方式不同，可將淀粉酶分為四大類：а淀粉酶、β淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和解枝酶（異淀粉酶）。此外，還有一些與工業(yè)有關(guān)的淀粉酶如環(huán)化糊精生成酶（這種酶可使6、7個(gè)葡萄糖構(gòu)成環(huán)化糊精）、G4、G6生成酶（可從淀粉非還原端切割下4-6個(gè)葡萄糖分子構(gòu)成寡糖），還有а-葡萄糖苷酶，又稱葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶（可將游離葡萄糖轉(zhuǎn)移到其他葡萄糖基的а-1,6

位上，生成含а-1,6糖苷鍵的寡糖）。一、а-淀粉酶工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用的а-淀粉酶主要來自細(xì)菌和曲霉，特別是枯草桿菌，我國(guó)淀粉糖化工業(yè)使用的液化酶BF-7658、美國(guó)的enase

等屬于這一種。由微生物制備酶制劑，產(chǎn)酶量高，易于分離和精制，適于大量生產(chǎn)。當(dāng)然亦能從植物和動(dòng)物中提取а-淀粉酶，滿足特殊的需要，但由于成本高，產(chǎn)量低，目前還不能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。具有實(shí)用價(jià)值的а-淀粉酶生產(chǎn)菌列于表8-1由于菌種不斷的選育改良，現(xiàn)在工業(yè)生產(chǎn)上用的菌種產(chǎn)生а-淀粉酶的能力已是原始菌株的數(shù)倍乃至數(shù)十倍霉菌а-淀粉酶大多采用固體曲法生產(chǎn):麩皮為主要原料，米糠或豆餅的堿水浸出液，以補(bǔ)充氮源;32-35℃培養(yǎng)36-48h,40℃烘干或風(fēng)干,粗酶細(xì)菌淀粉酶則以液體深層發(fā)酵為主:以麩皮、玉米粉、豆餅粉、米糠、玉米漿等為原料，補(bǔ)充無機(jī)氮源,此外還需添加少量鎂鹽、磷酸鹽、鈣鹽等。37℃通風(fēng)攪拌培養(yǎng)24-28h,離心或以硅藻土作助濾劑除去菌體及不溶物。在鈣離子存在下低溫真空濃縮后，加入防腐劑、穩(wěn)定劑以及緩沖劑后就成為成品。這種液體的細(xì)菌а-淀粉酶呈暗褐色，帶不愉快的臭味，在室溫下放置數(shù)月而不失活。為制備高活性的а-淀粉酶，并使貯運(yùn)方便，可把發(fā)酵濾液用硫酸銨鹽析或有機(jī)溶劑沉淀制成粉狀酶制劑，最好貯存在25℃以下，較干燥、避光的地方枯草桿菌BF-7658是我國(guó)產(chǎn)量最大、用途最廣的一種液化型а-淀粉酶，其最適pH6.5左右，最適溫度65℃多次物理、化學(xué)誘變后獲得一株11-12菌株，酶活力比原菌株提高50%，在馬鈴薯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好孢子斜面培養(yǎng)：馬鈴薯培養(yǎng)基50mL，37℃,72h種子培養(yǎng)：標(biāo)準(zhǔn)夾套罐（500L，直徑70cm,高160cm)，37±1℃，罐壓0.5-0.8大氣壓，通風(fēng)量0-10h，13.5m3/h;10-14h,17.5m3/h.培養(yǎng)12-14h大罐：3000L標(biāo)準(zhǔn)罐，低濃度發(fā)酵，高濃度補(bǔ)料，基礎(chǔ)料：補(bǔ)料體檢：3:1工業(yè)上回收а-

淀粉酶常用鹽析、有機(jī)溶劑沉淀和淀粉吸附三種方法。其中鹽析法在工業(yè)中用得比較普遍用于鹽析а-

淀粉酶的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉等。其中以硫酸銨最為常用，因?yàn)榇他}的溶解度較大。二、β-淀粉酶β-淀粉酶過去主要是從麥芽、大麥、甘薯、大豆等高等植物中提取。近幾年來，發(fā)現(xiàn)不少微生物能產(chǎn)β-

淀粉酶，微生物的β-淀粉酶從其對(duì)淀粉的作用上來看，與高等植物的β-淀粉酶是一致的，而在耐熱性等方面都比高等植物更適合于工業(yè)化應(yīng)用。目前，對(duì)產(chǎn)β-淀粉酶菌種研究較多的是多黏芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌和鏈霉菌等。它們有可能發(fā)展成為微生物β-淀粉酶的生產(chǎn)菌種。由于異淀粉酶和β-淀粉酶可以相互配合使用，可以篩選同時(shí)具有這兩種酶的菌種。據(jù)報(bào)道，日本從土壤中分離到蠟狀芽孢桿菌蕈狀變種，在所培養(yǎng)的條件下，可以同時(shí)產(chǎn)生β-淀粉酶和異淀粉酶。β-淀粉酶生產(chǎn)過程菌種：巨大芽孢桿菌，耐熱性發(fā)酵培養(yǎng)基：淀粉3%，葡萄糖0.5%，蛋白胨1%，玉米漿1%，磷酸氫二鉀0.5%34℃攪拌培養(yǎng)48h，酶活：25.5U/mL發(fā)酵液8000r/min離心20min,除菌體，加硫酸銨沉淀得粗酶，0.01moL/L醋酸鹽溶解，自來水透析3d,加25%醋酸鉛溶液，離心除去沉淀雜質(zhì)，硫酸銨鹽析較純?chǔ)?淀粉酶，酶活：100U/mL總收率50%近十幾年來，國(guó)內(nèi)外的微生物工作者在菌種的誘變和發(fā)酵條件等方面都做了大量的研究工作。例如，日本人新家龍把蠟狀芽孢桿菌Bg10

用紫外線處理后，獲得的變異株產(chǎn)β-淀粉酶的能力比親株提高約25-30倍。此菌株不需要淀粉誘導(dǎo)物，在不含碳源而含0.5%牛肉膏的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，也可以生成β-

淀粉酶；鉀離子可提高酶的生成量，麥芽糖反而抑制β-淀粉酶的生成。日本天野制藥公司采用多黏芽孢桿菌ATCC8523生產(chǎn)β-淀粉酶時(shí)，使用高濃度碳源的培養(yǎng)液，最初溫度為36-40℃，等到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，降溫至30-34℃，繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵，60h后,β淀粉酶的生成量為105U/mL高濃度碳源培養(yǎng)液的配方為：薯淀粉10%、硫酸銨0.75%、玉米漿0.5%、酵母膏0.2%、磷酸氫二鉀0.1%、硫酸鎂0.75%、水0.05%三糖化酶糖化酶的生產(chǎn)菌種各國(guó)不一。美國(guó)主要采用臭曲霉，丹麥主要采用黑曲霉，日本主要采用擬內(nèi)孢霉和根霉，前蘇聯(lián)則主要偏向研究擬內(nèi)孢霉。我國(guó)糖化酶的生產(chǎn)也主要采用黑曲霉作為菌種黑曲霉液體深層通風(fēng)培養(yǎng)法生產(chǎn)糖化酶在用黑曲霉生產(chǎn)糖化酶的初期，產(chǎn)品主要應(yīng)用于由淀粉制取葡萄糖。糖化酶的工業(yè)生產(chǎn)雖始于1965年，但當(dāng)時(shí)菌種活性較低，發(fā)酵單位不高，因而成本過高，不易開發(fā)應(yīng)用。1977年中國(guó)科學(xué)研究所選育出黑曲霉變異株UV-11，但其深層發(fā)酵要求高速攪拌及需用玉米漿等條件，因而當(dāng)時(shí)在生產(chǎn)中全面推廣還有很大的困難。1978年無錫輕工業(yè)學(xué)院進(jìn)一步選育菌種和研究培養(yǎng)條件，以提高糖化酶發(fā)酵的活性。經(jīng)多年的努力，完成中試并通過鑒定。1981年起組織推廣并開發(fā)應(yīng)用于酒精、白酒工業(yè)生產(chǎn)中。由于該成果的經(jīng)濟(jì)效益顯著，年獲國(guó)家科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)。斜面培養(yǎng)：查式培養(yǎng)基，31℃培養(yǎng)6-7d,種子罐：2m3不銹鋼，配方：玉米漿4%，豆餅粉3%，麩皮1%，轉(zhuǎn)速320r/min,31-32℃培養(yǎng)，罐壓0.5大氣壓，通風(fēng)量0.5/min（v/v),培養(yǎng)30-40h,酶活：300-500U/mL發(fā)酵罐：20m3，配方：玉米粉10%，豆餅粉4%，麩皮1%，糠油5L，PH4.0，轉(zhuǎn)速180r/min，30-32℃培養(yǎng)，罐壓0.5大氣壓，通風(fēng)量:0-12h,0.5/min（v/v),12-14h,0.8/min,24-84h,1/min,84h后,0.8/min,發(fā)酵工藝控制PH:控制4.0，方法：

磷酸鹽、碳酸鹽、醋酸鹽、氫氧化銨，含氮有機(jī)物、碳水化合物等的比例來調(diào)節(jié)溶氧：中間補(bǔ)料，基礎(chǔ)料：補(bǔ)料體積：3:1,2-3次補(bǔ)料，改善發(fā)酵通風(fēng)比，需氧滿足，酶活增長(zhǎng)發(fā)酵工程（大生產(chǎn)）操作是控制罐內(nèi)培養(yǎng)液的體積（以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基配比）以及總殘?zhí)?、PH、鏡檢等一些關(guān)鍵項(xiàng)目，所得結(jié)果如表8-6四、異淀粉酶異淀粉酶也稱為淀粉-1,6-葡萄糖苷酶、R-酶、茁霉多糖酶等。異淀粉酶可以分解支鏈淀粉中的а-1,6葡萄糖苷鍵，生成直鏈淀粉。此酶最早由日本的西村資治于1930年在酵母抽出液中發(fā)現(xiàn)。此后又在茁霉和產(chǎn)氣桿菌中發(fā)現(xiàn)。另外，此酶在馬鈴薯、蠶豆、麥芽、稻米等高等植物中也有發(fā)現(xiàn)，但是不穩(wěn)定，活性弱，不適于工業(yè)應(yīng)用。此酶的碘反應(yīng)是由赤變藍(lán)。不同來源的異淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)有一定的差異，如表8-7所示：20世紀(jì)70年代以后，美國(guó)Staley對(duì)產(chǎn)氣桿菌生成異淀粉酶的培養(yǎng)條件做了深入地研究。他們認(rèn)為，培養(yǎng)基的PH應(yīng)維持在6.0-8.1，若在6以下或8.1以上，則酶產(chǎn)量下降，即使調(diào)回PH，此酶也不能產(chǎn)生；必須用麥芽糖、麥芽三糖或茁酶多糖誘導(dǎo)；誘導(dǎo)的細(xì)胞可培養(yǎng)在含有適當(dāng)碳水化合物和植酸鹽濾物或玉米漿培養(yǎng)基中。只有保證以上3個(gè)條件才能生成異淀粉酶。日本的宮本武明等除用10%可溶性淀粉外，還添加0.5%谷氨酸鈉使酶活力提高。再添加硫酸銨0.5%、磷酸氫二鉀0.05%、七水硫酸鎂0.05%、七水硫酸亞鐵0.001%等無機(jī)鹽，酶活力可達(dá)772U/Ml.

另外，據(jù)Harwath等報(bào)道,麥芽糖醇可以促進(jìn)微生物形成異淀粉酶。我國(guó)異淀粉酶的研究工作開始于1973年。異淀粉酶生產(chǎn)舉例菌種：產(chǎn)氣氣桿菌斜面培養(yǎng)基：葡萄糖1%、牛肉膏1%、蛋白胨1%、氯化鈉0.05%、瓊脂2%，pH7.0-7.2搖瓶培養(yǎng)基：甘薯淀粉，豆餅粉