高效液相色譜儀的原理及應(yīng)用

高效液相色譜儀的原理及應(yīng)用第一頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜

highperformanceliquidchromatograph，HPLC第二頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二第三頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二Agilent1100第四頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二氣相色譜法：較易揮發(fā)、且熱穩(wěn)定的有機化合物。～20%液相色譜法：用氣相色譜法難以分析的物質(zhì)，如難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定、分子量大、具有生物活性的物質(zhì)?！?0%第一節(jié)

高效液相色譜法的原理一、高效液相色譜法的特點第五頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法經(jīng)典液相色譜法高效液相色譜儀經(jīng)典液相色譜HPLC固定相粒徑150-200μm3-10μm流動相驅(qū)動方式重力或低壓泵高壓泵流動相流速很慢快(1-10mL/min)例：分離20種氨基酸柱長：170cm柱徑：0.9cmF：30mL/ht

:>20h經(jīng)典柱色譜HPLCt

：1h高壓、高效、高速第六頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二吸附色譜

分配色譜

離子交換色譜

排阻色譜二、高效液相色譜法的分類正相色譜

反相色譜1、按分離原理分類2、按極性分類第七頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二1)吸附色譜（液-固）固定相：固體吸附劑，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑；流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑?；驹恚航M分在固定相上的吸附與解吸。適用于分離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣。1、按分離原理分類第八頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二2)分配色譜（液-液）

固定相與流動相均為液體（互不相溶）；基本原理：組分在固定相和流動相上的分配；固定相：由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體表面涂漬固定液，固定液易流失，較少采用；

化學鍵合固定相：將各種不同基團通過化學反應(yīng)鍵合到硅膠（擔體）表面。C-18柱:第九頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二3)離子交換色譜固定相：陰離子離子交換樹脂

或陽離子離子交換樹脂；流動相：酸性或堿性水溶液；基本原理：利用不同離子對樹脂的離子交換能力不同來實現(xiàn)分離。應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。第十頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二4)排阻色譜（又稱凝膠色譜）

固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小分離。小分子可以擴散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快?？蓪ο鄬Ψ肿淤|(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離。第十一頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二1)正相色譜：

是由極性固定相和非極性（或弱極性）流動相所組成的色譜體系。其代表性的固定相是改性硅膠、氰基柱等，代表性的流動相是正己烷。2)反相色譜：

由非極性固定相和極性流動相所組成的色譜體系，與正相色譜體系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基鍵合硅膠(ODS柱），代表性的流動相是甲醇和乙腈。是當今HPLC最主要的分離模式。2、按極性分類:第十二頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二第十三頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二第二節(jié)高效液相色譜儀的組成輸液系統(tǒng)進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)第十四頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二一、輸液系統(tǒng)

高壓輸液泵脫氣裝置梯度淋洗系統(tǒng)第十五頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二1、高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150～350×105

Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。μL/min~幾千mL/min應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性第十六頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二2、脫氣裝置用于脫去流動相中的溶解氣體，流動相先經(jīng)過脫氣裝置再輸送到色譜柱。脫氣機、超聲脫氣、真空脫氣等。

第十七頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二3、梯度淋洗裝置第十八頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二等度洗脫輸液泵進樣器色譜柱柱溫箱檢測器單一或混合溶劑第十九頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二分析時間長分離度差

MeOH/H2O=6/4MeOH/H2O=8/2等度洗脫怎樣解決呢？第二十頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二梯度洗脫

A泵進樣器色譜柱柱溫箱檢測器

B泵AB時間B濃度第二十一頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二95%30%MeOH梯度洗脫優(yōu)點：可提高分離度、縮短分離時間、降低最小檢測量和提高分離精度。第二十二頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二

氣相色譜的程序升溫第二十三頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二程序升溫50~250℃，8℃/min恒溫150℃正構(gòu)烷烴恒溫和程序升溫色譜圖比較程序升溫不僅可以改善分離，而且可以縮短分析時間。

氣相色譜：第二十四頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置：二、進樣系統(tǒng)第二十五頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二色譜柱：填料：C18色譜柱十八烷基硅基化學鍵合到多孔硅膠或陶瓷微粒SIL多孔硅膠微粒XDB-C8辛基硅烷化學鍵合到多孔硅膠微粒上三、分離系統(tǒng)第二十六頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相。

a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—C

b.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—

Cc.硅碳鍵型：≡Si—C

d.硅氮鍵型：≡Si—N化學鍵合固定相:第二十七頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二

1、紫外檢測器應(yīng)用最廣，對大部分有機化合物有響應(yīng)。

參考二極管UV燈光柵樣品池采樣二極管濾光片狹縫鏡2鏡1四、檢測系統(tǒng)第二十八頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二2、光電二極管陣列檢測器DAD紫外檢測器的重要進展；光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖。第二十九頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二3、熒光檢測器高靈敏度、高選擇性；對多環(huán)芳烴、維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)。第三十頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二4、質(zhì)譜檢測器

第三十一頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二一、定性分析(1)保留值定性(2)相對保留值定性(3)與其他儀器聯(lián)用標準品：A-甲醇；B-乙醇；C-正丙醇；D-正丁醇；E-正戊醇第三節(jié)高效液相色譜法的應(yīng)用第三十二頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二組分的峰面積越大,在樣品中所占比例越大?1、校正因子定量：fi

稱為校正因子。fi

＝0？同一檢測器，對不同組分的敏感度不同。Wi=fiAiWi=fiAi二、定量分析方法：第三十三頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二校正因子fi分為絕對和相對校正因子兩種。絕對校正因子：由于受到儀器及操作條件的影響程度很大，實際定量分析時，基本上不使用。第三十四頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二

相對校正因子fi

：

某物質(zhì)i

與一選擇的標準物質(zhì)S

的絕對校正因子之比:

相對校正因子只與檢測器類型有關(guān)，而與色譜條件無關(guān)。

常用于作為標準物質(zhì)S的有苯（熱導(dǎo)檢測器）和庚烷（氫火焰離子化檢測器）等。選擇的標準物質(zhì)S一起加入試樣中——內(nèi)標法：第三十五頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二2、內(nèi)標法

——標準物質(zhì)在未知樣內(nèi)部內(nèi)標物應(yīng)滿足的要求（p55)：準確稱取一定量的未知樣Wi，加入已準確定量的內(nèi)標物WS。SampleStandardsi校正曲線：Ai/As～Ciis第三十六頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二內(nèi)標法的優(yōu)點：氯霉素測定：

1.用外標法：

①先做氯霉素標準品，C=1ug/uL，進樣量10uL,測得A=1000,

則W=1ug/uL×10uL=10ug,

f=W/A=10ug/1000=0.01ug;

②

再做未知樣(含氯霉素?ug/uL)，進樣量10uL,測得Ax=500,

則Wx=f×Ax=0.01ug×500=5ug,

Cx=5ug/10uL=0.5ug/uL;

③

假若由于某種原因，未知樣實際進樣量只有9.90uL,但計算時仍按10uL算：

則可測得Ax變?yōu)?95，Wx=fi×Ax=0.01ug×495=4.95ug,

Cx

=4.95ug/10uL=0.495ug/uL。

第三十七頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二2.用內(nèi)標法：

①先做氯霉素(i)+對硝基苯酚(s)標準品，

標準品中，氯霉素Ci=1ug/uL，對硝基苯酚Cs=2ug/uL；

進樣量10uL,測得氯霉素Ai=1000,對硝基苯酚As=100。

則氯霉素Wi=1ug/uL×10uL=10ug,fi=Wi/Ai=10ug/1000=0.01ug;

對硝基苯酚Ws=2ug/uL×10uL=20ug,fs=Ws/As=20ug/100=0.2ug;

相對校正因子f′=fi/fs=0.01ug/0.2ug=0.05;

②再做未知樣(氯霉素?ug/uL+對硝基苯酚0.5ug/uL)，進樣量10uL,可測得氯霉素Ai=500,對硝基苯酚As=25,

f′=fi/fs=(Wi/Ai)/(Ws/As)=0.05;Ws=0.5ug/uL×10uL=5ug，

Wi=f′×(Ws/As)×Ai=0.05×(5/25)×500=5ug,

Cx=5ug/10uL=0.5ug/uL;

第三十八頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二③假若由于某種原因，導(dǎo)致未知樣實際進樣量只有9.90uL,

但計算時仍按10uL算：

則可測得氯霉素Ai變?yōu)?95，對硝基苯酚As也變?yōu)?4.75；

f′=0.05;

Ws=0.5ug/uL×10uL=5ug；

Wi=f′×(Ws/As)×Ai

=0.05×(5/24.75)×495=5ug,

Cx=5ug/10uL=0.5ug/uL。

第三十九頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二例：一含氯霉素試樣，稱取此樣1.000g，以對硝基苯酚作內(nèi)標，稱取0.100g對硝基苯酚加到試樣中，混合均勻后進樣，測得氯霉素峰面積是20，對硝基苯酚峰面積是120，已知氯霉素相對于對硝基苯酚的相對校正因子是1.2，求試樣中氯霉素的含量。

fi

′

=（Wi

/20）/（0.100/120）=1.2

wi=0.020g

Ci

=

0.020/1.000=2.0%第四十頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二

3、外標法

——標準物質(zhì)在未知樣外部即標準曲線法。特點：

不必使用校正因子。

操作條件變化對結(jié)果準確性影響較大。對進樣量的準確性控制要求較高，適用于大批量試樣的快速分析。第四十一頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二4、歸一化法：

i前提：所有組分都能從柱上洗脫并能被檢測器檢測。第四十二頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二例1、高效液相色譜法測定奶粉中的三聚氰胺（1）提?。悍Q取0.5~3g奶粉試樣，加入0.1mol/L鹽酸至15ml，混勻，超聲提取30min后加入60g/L磺基水楊酸3~4ml，再用0.1mol/L鹽酸定容至20ml，混勻后以4000r/min離心5min，上清液經(jīng)0.45μm的微孔濾膜過濾后進樣。（2）分析：色譜柱:色譜柱KromasilKR100-5C8(250mm×4.6mm，5μm，EkaChemicals公司，瑞典)柱溫:40℃。流動相:緩沖液+乙腈(85+15，體積比);流速:1.0ml/min;進樣量:20μl。二極管陣列檢測器，波長范圍200~400nm。第四十三頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二第四十四頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二例2、液相色譜法測定食品中苯并(a)芘原理：樣品經(jīng)過提取、皂化以及柱層析凈化，除去脂肪類物質(zhì)、色素等雜質(zhì)后，再通過液相色譜儀中的色譜柱，將苯并芘從多環(huán)芳烴物質(zhì)中分離出來。求出樣品中苯并芘的含量。儀器：(1)液相色譜儀：色譜柱：ODS柱，柱長250mm，Φ4mm；

柱溫：30℃；流動相：75％甲醇；流速：2mL／min。(2)檢測器：熒光檢測器，激發(fā)波長369nm，熒光波長405nm。第四十五頁，共四十九頁，編輯于2023年，