蛋白質(zhì)的共價結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的共價結(jié)構(gòu)第一頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二蛋白質(zhì)（Protein）1838年，J.J.Berzelius提出，由西臘文proteuo衍生而來——第一重要，首要的物質(zhì)第二頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二蛋白質(zhì)存在于所有生物細胞中，是構(gòu)成生物體最基本的結(jié)構(gòu)物質(zhì)和功能物質(zhì)。蛋白質(zhì)是生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)，參與了幾乎所有的生命活動過程。第三頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二（一）、蛋白質(zhì)功能的多樣性1.催化功能-酶2.調(diào)節(jié)功能-激素、基因調(diào)控因子3.轉(zhuǎn)運功能-膜轉(zhuǎn)運蛋白、血紅/血清蛋白4.貯存功能-乳、蛋、谷蛋白5.運動功能-鞭毛、肌肉蛋白6.結(jié)構(gòu)成分-皮、毛、骨、牙、細胞骨架7.支架作用-接頭蛋白8.防御功能-免疫球蛋白9.異常功能第四頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二二、蛋白質(zhì)通論（一）、蛋白質(zhì)的化學(xué)組成和分類１、元素組成第五頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二第六頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二２、蛋白質(zhì)的含氮量蛋白氮占生物組織所有含氮物質(zhì)的絕大部分。大多數(shù)蛋白質(zhì)含氮量接近于16%

蛋白質(zhì)含量=每克樣品中含氮的克數(shù)6.25凱氏定氮法第七頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二３、蛋白質(zhì)的分類（1）、依據(jù)外形分類球狀蛋白質(zhì)：globularprotein

纖維狀蛋白質(zhì)：fibrousprotein

膜蛋白質(zhì)：membraneprotein

第八頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二（2）、依據(jù)蛋白質(zhì)的組成分類簡單蛋白

simpleprotein

單純蛋白，僅由氨基酸組成結(jié)合蛋白

conjugatedprotein由簡單蛋白與其它非蛋白成分結(jié)合而成第九頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二簡

單

蛋

白清蛋白和球蛋白albuminandglobulin

廣泛存在于動物組織谷蛋白和醇溶谷蛋白glutelinandprolamin

植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸/堿精蛋白和組蛋白堿性蛋白存在于細胞核硬蛋白

第十頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二結(jié)

合

蛋

白色蛋白：簡單蛋白+色素物質(zhì)糖蛋白：簡單蛋白+糖類物質(zhì)脂蛋白：簡單蛋白+脂類結(jié)合核蛋白：簡單蛋白+核酸第十一頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二N端C端按照蛋白質(zhì)的多肽鏈的組成分類有些蛋白質(zhì)是由兩條或多條多肽鏈構(gòu)成,這樣的蛋白質(zhì)稱為寡聚蛋白質(zhì)或者多聚蛋白質(zhì),其中每條多肽鏈稱為亞基.如:血紅蛋白.有些蛋白質(zhì)僅由一條多肽鏈構(gòu)成,稱為單體蛋白質(zhì),如溶菌酶.第十二頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二（二）、蛋白質(zhì)的大小與分子量蛋白質(zhì)是分子量很大的生物分子對任一種給定的蛋白質(zhì)，其所有分子在AA組成和順序以及肽鏈的長度方面都應(yīng)是相同的，即所謂均一的蛋白質(zhì)。第十三頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二

蛋白質(zhì)與多肽無嚴(yán)格的界線——通常將6000Dr以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子量變化范圍很大

對于不含輔基的蛋白質(zhì),用分子量除于氨基酸殘基的平均分子量110,即可以粗略估計該蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的數(shù)目第十四頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)包括

一級結(jié)構(gòu)(primarystructure)二級結(jié)構(gòu)(secondarystructure)三級結(jié)構(gòu)(tertiarystructure)四級結(jié)構(gòu)(quaternarystructure)（三）蛋白質(zhì)構(gòu)象和結(jié)構(gòu)的組織層次第十五頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二定義蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)指多肽鏈中氨基酸的排列順序。(一)、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)(Primarystructure）主要的化學(xué)鍵肽鍵，有些蛋白質(zhì)還包括二硫鍵。（三）蛋白質(zhì)構(gòu)象和結(jié)構(gòu)的組織層次第十六頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二一級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和特異生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。第十七頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二(二)蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中某一段肽鏈的局部空間結(jié)構(gòu)，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈的構(gòu)象

。定義

主要的化學(xué)鍵：

氫鍵

（三）蛋白質(zhì)構(gòu)象和結(jié)構(gòu)的組織層次第十八頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二2.-折疊1.-螺旋第十九頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二3.-轉(zhuǎn)角4.無規(guī)卷曲第二十頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二三、蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)疏水鍵、離子鍵、氫鍵和VanderWaals力等。主要的化學(xué)鍵整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。（一）定義（三）蛋白質(zhì)構(gòu)象和結(jié)構(gòu)的組織層次第二十一頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二龍蝦素第二十二頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二木瓜蛋白酶組織蛋白酶第二十三頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二雞半胱氨酸蛋白酶抑制劑第二十四頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二亞基之間的結(jié)合力主要是疏水作用，其次是氫鍵和離子鍵。四、蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。有些蛋白質(zhì)分子含有二條或多條多肽鏈，每一條多肽鏈都有完整的三級結(jié)構(gòu)，稱為蛋白質(zhì)的亞基(subunit)。第二十五頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)

第二十六頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二二、肽（peptide）AA-NH2與另一AA-COOH間失水形成的酰胺鍵稱肽鍵，所形成的化合物稱肽。第二十七頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二+-HOH甘氨酰甘氨酸肽鍵第二十八頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二由兩個AA組成的肽稱為二肽。由多個AA組成的肽則稱為多肽。組成多肽的AA單元稱為氨基酸殘基。第二十九頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二多肽鏈中AA殘基按一定順序排列：氨基酸順序含游離-氨基的一端：氨基端或N-端含游離-羧基的一端：羧基端或C-端AA順序是從N-端開始以C-端氨基酸殘基為終點如上述五肽：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln第三十頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二（一）、肽和肽鍵的結(jié)構(gòu)第三十一頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二①肽鍵中C-N鍵有部分雙鍵性質(zhì)

——不能自由旋轉(zhuǎn)②組成肽鍵原子處于同一平面（肽平面）③鍵長及鍵角一定④大多數(shù)情況以反式結(jié)構(gòu)存在第三十二頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二（一）肽單元參與肽鍵的6個原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所處的位置為反式(trans)構(gòu)型，此同一平面上的6個原子構(gòu)成了所謂的肽單元

(peptideunit)

。第三十三頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二共價主鏈

第三十四頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二（二）、肽的物理化學(xué)性質(zhì)肽末端α-羧基pKa值比游離AA中的大。肽末端α-氨基pKa值比游離AA中的小。等電點（兩性）。酸堿性質(zhì)取決于：—α-羧基、α-氨基、側(cè)鏈基團的解離

具有雙縮脲反應(yīng)——Pr特有的反應(yīng)。第三十五頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二（三）、天然存在的重要多肽第三十六頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二第三十七頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二第三十八頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二

谷胱甘肽(glutathione,GSH)第三十九頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二GSH過氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSG

GSH還原酶NADPH+H+NADP+第四十頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二三、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定什么是Pr的一級結(jié)構(gòu)？蛋白質(zhì)中氨基酸的排列順序。第四十一頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二第四十二頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二1.樣品必需純（>97%以上）2.知道蛋白質(zhì)的分子量3.知道蛋白質(zhì)由幾個亞基組成4.測定蛋白質(zhì)的AA組成并根據(jù)分子量計算每種AA的個數(shù)5.測定水解液中的氨量計算酰胺的含量前提第四十三頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二（一）、蛋白質(zhì)測序策略(1)測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定第四十四頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二（一）、蛋白質(zhì)測序策略(2)

多肽鏈的拆分蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定第四十五頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二（一）、蛋白質(zhì)測序策略幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體。可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基)。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定第四十六頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二（一）、蛋白質(zhì)測序策略(3)

斷開二硫鍵在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護生成的巰基，防止重新被氧化。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定第四十七頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二第四十八頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二（一）、蛋白質(zhì)測序策略蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定(4)測定每條多肽鏈的AA組成，并計算出AA成分的分子比

第四十九頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二第五十頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二（一）、蛋白質(zhì)測序策略(5)分析多肽鏈的N-末端和C-末端(6)多肽鏈斷裂成多個肽段采用兩/多種不同的斷裂方法將多肽斷裂成兩套或多套肽段，并將其分離。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定第五十一頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二（一）、蛋白質(zhì)測序策略(7)測定每個肽段的氨基酸順序蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定(8)確定肽段在多肽鏈中的次序利用兩/多套肽段的AA順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的AA順序。第五十二頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二（一）、蛋白質(zhì)測序策略(9)確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定第五十三頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二兩類多肽鏈末端氨基酸殘基：

N-端氨基酸

C-端氨基酸在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。（二）、末端氨基酸殘基測定第五十四頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二Sanger法1、末端分析二硝基氟苯（DNFB）法O2NFNO2+

H2NCHCROHNCHCROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCHCROOH+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸（二）、末端氨基酸殘基的鑒定N堿性條件二硝基苯衍生物黃色第五十五頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二二甲氨基萘磺酰-AA有強熒光，檢測靈敏度高丹磺酰氯（DNS）法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析1N(DNS-aa)第五十六頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二④苯異硫氰酸酯（PITC)法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析1N第五十七頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二—N=C=S+N—CH—COOHHHRPITC—N—C—N—CH—COOHHHRSPTC-氨基酸—N—CHRSNCCOPTH-氨基酸pH8.3無水HF苯異硫氰酸酯PITC第五十八頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二肽鏈外切酶:從多肽鏈N-端逐個向里水解根據(jù)不同反應(yīng)時間測出釋放的AA種類和數(shù)量，按反應(yīng)時間和AA殘基釋放量作動力學(xué)曲線蛋白質(zhì)N-末端殘基順序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶

—水解以Leu殘基為N-末端的肽鍵速度最大。⑤氨肽酶法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析1N第五十九頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二肽鏈外切酶:從多肽鏈C-端逐個水解根據(jù)不同反應(yīng)時間釋放出的AA種類和數(shù)量蛋白質(zhì)C-末端殘基順序。四種羧肽酶：A,B,C和Y；A和B(胰臟)、C(柑桔葉)、Y(面包酵母)∽A:除Pro/Arg/Lys/外所有C-末端AA殘基∽B:只水解Arg和Lys為C-末端殘基的肽鍵

③羧肽酶法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析2C第六十頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二（三）、二硫鍵的斷裂鹽酸胍/尿素解離多肽鏈間的非共價力。應(yīng)用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。第六十一頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二1、酸水解（四）、氨基酸組成的分析2、堿水解第六十二頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二1、酶解法:內(nèi)切酶：胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶外切酶：羧肽酶和氨肽酶多肽鏈的選擇性降解（五）、多肽鏈的部分裂解和肽段混合物的分離純化第六十三頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二R1=Lys（K）和Arg（R）專一性較強，水解速度快R2=Pro（抑制）肽鏈水解位點胰蛋白酶trypsin第六十四頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二R1=Phe（F）、Trp（W）Tyr（Y）等疏水性AALeu、Met和His稍慢R2=Pro（抑制）pH8-9肽鏈水解位點糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）水解速度與相鄰AA性質(zhì)有關(guān):酸性：-/堿性：+第六十五頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二R2=Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、Leu（L）、Ile（I）、Met（M）、Val（V）及其它疏水性強的AA水解速度較快肽鏈水解位點R2=Pro或Gly，不水解R1或R3=Pro，抑制水解嗜熱菌蛋白酶（thermolysin)第六十六頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二R1和/或R2＝Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、Leu（L）及其它疏水性AA水解速度較快R1=Pro（抑制）pH2肽鏈水解位點胃蛋白酶Pepsin第六十七頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二肽鏈水解位點羧肽酶和氨肽酶第六十八頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二2、化學(xué)裂解法

①溴化氰水解法(Cyanogenbromide)——選擇性地切割由Met羧基形成的肽鍵。（五）、多肽鏈的部分裂解和肽段混合物的分離純化多肽鏈的選擇性降解第六十九頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二②NH2OH斷裂：較專一性斷裂Asn-Gly之間的肽鍵

Asn-Leu及Asn-Ala鍵也能部分?jǐn)嗔?/p>

第七十頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二3、肽段的分離純化：

凝膠過濾、凝膠電泳和HPLC法第七十一頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二N-端分析法

特點：能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進行標(biāo)記和解離。

1、Edman法（六）、肽段氨基酸序列的測定（苯異硫氰酸酯法）Edman于1950年首先提出。第七十二頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二PITCPTC-肽第七十三頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二2、氨肽酶法或羧肽酶法3、質(zhì)譜法（MS）

靈敏度高、所需樣品少、測定速度快第七十四頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二第七十五頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二第七十六頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二第七十七頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二第七十八頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二核糖體蛋白質(zhì)鏈4.根據(jù)核苷酸序列的推定法第七十九頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期二（七）、肽段在